Abbiamo sviluppato un metodo semplice, veloce ed economico per estrarre il DNA genomico di C.elegans che funziona alla grande per le applicazioni in classe e di ricerca. Questi protocolli possono essere utilizzati in modo affidabile per produrre rapidamente modelli di DNA da un singolo o un piccolo campione di C.elegance per applicazioni basate su PCR. Gli utenti che non hanno esperienza nella raccolta di worm o nell'utilizzo di un micropipetter possono avere difficoltà con passaggi che richiedono queste abilità.
Guardare un praticante esperto e praticare può aiutare. A dimostrare la procedura sarà Farhan Lakdawala, uno studente laureato senior del mio laboratorio. Per estrarre il DNA da un singolo verme Caenorhabditis elegans, in primo luogo, impostare il programma di lisi costituito da un ciclo a 55 gradi Celsius per 10 minuti seguito da 95 gradi Celsius per tre minuti in un termociclatore.
Per preparare la soluzione di lisi, in primo luogo, aggiungere 0,8 microlitri di soluzione di estrazione dal kit alla parete interna di un tubo PCR da 0,2 millilitri su ghiaccio. Quindi aggiungere 0,2 microlitri di soluzione di preparazione del tessuto dal kit alla goccia di soluzione di estrazione e mescolare accarezzando. Con la selezione di un verme per l'estrazione del DNA, in primo luogo, identificare un animale L4 o adulto sotto un microscopio di dissezione.
Un ermafrodito L4 può essere identificato da una caratteristica vulva che è visibile come un semicerchio pallido nel mezzo dell'animale. Per identificare un ermafrodita adulto, selezionare uno degli animali più grandi sul piatto che potrebbe avere embrioni ovali visibili nel suo utero. Quindi, utilizzando un plettro di filo di platino, trasferire l'animale selezionato alla soluzione.
Per raccogliere il contenuto nella parte inferiore del tubo, centrifugare il tubo per due o tre secondi a 2000 x g a temperatura ambiente. Quindi posizionare il tubo nel termociclatore ed eseguire il programma di lisi impostato in precedenza. Al termine di questo programma di lisi, centrifugare brevemente il tubo e metterlo sul ghiaccio.
Quindi aggiungere 0,8 microlitri di soluzione di neutralizzazione dal kit e mescolare mediante pipettaggio. Ancora una volta, centrifugare il tubo per due o tre secondi a 2000 x g a temperatura ambiente. Se il lisato non viene utilizzato immediatamente, conservare il tubo a quattro gradi Celsius per un uso futuro.
Per estrarre il DNA da un singolo verme anche, in primo luogo, impostare il programma di lisi di un ciclo a 55 gradi Celsius per 10 minuti seguito da 95 gradi Celsius per tre minuti in un termociclatore. Quindi preparare la soluzione di lisi aggiungendo prima due microlitri della soluzione di estrazione dal kit sulla parete interna di un tubo PCR da 0,2 millilitri su ghiaccio, quindi aggiungendo 0,5 microlitri della soluzione di preparazione del tessuto dal kit alla goccia di soluzione di estrazione, quindi mescolare il contenuto mediante pipettaggio. Dopo aver identificato L4 o animali adulti, utilizzare un plettro di filo di platino per trasferire un numero adeguato di animali nella soluzione.
Quindi, centrifugare il tubo per due o tre secondi a 2000 x g a temperatura ambiente, quindi posizionare il tubo nel termociclatore ed eseguire il programma di lisi precedentemente impostato. Dopo aver completato il programma, centrifugare brevemente il tubo e metterlo sul ghiaccio. Quindi aggiungere due microlitri della soluzione di neutralizzazione dal kit al tubo e miscelati mediante pipettaggio.
Ancora una volta, centrifugare il tubo per due o tre secondi a 2000 x g a temperatura ambiente. Se non utilizzato immediatamente, conservare il lisato a quattro gradi Celsius per un uso futuro. Il DNA genomico estratto dal protocollo potrebbe essere utilizzato con successo come modello di PCR, sia il kit commerciale che il tradizionale metodo della proteinasi K hanno prodotto DNA con livelli simili di amplificazione PCR di un prodotto a coppia di basi 2100 e un prodotto a coppia di basi 500.
Il metodo kit per la lisi del DNA ha anche fornito modelli PCR efficaci per una varietà di enzimi della DNA polimerasi. Anche a diverse diluizioni, il DNA estratto da un singolo animale dal kit commerciale ha supportato l'amplificazione PCR di un frammento di DNA a coppia di basi 2100 con efficienza equivalente. Tuttavia, l'amplificazione di un frammento di DNA di 500 coppie di basi variava con la concentrazione del modello.
L'idoneità del DNA estratto da un singolo animale o da più animali come modello pcr per determinare il genotipo è stata ulteriormente dimostrata dal successo dell'amplificazione di un gene e della sua variante mutata. Poiché questo protocollo prevede il pipettaggio di piccoli volumi di reagenti, per garantire la coerenza, utilizzare una miscela principale per reazioni multiple, una buona tecnica di tubazione e pipette ben calibrate. Inoltre, la rotazione del contenuto del tubo garantisce una corretta lisi.
Questo metodo potrebbe essere scalato, adattato per estrarre il DNA genomico di C.elegans per altre applicazioni a valle e potrebbe essere utilizzato per estrarre il DNA da altre specie di nematodi. Data la semplicità, la velocità, la robustezza e il basso costo del protocollo, è adatto sia per la ricerca che per le applicazioni in classe in cui il tempo e le risorse sono limitati.
