La qualità della sospensione monocellulare preparata è fondamentale per ottenere risultati di alta qualità e affidabili per qualsiasi metodologia omica a singola cellula. E questo protocollo ti mostrerà come isolare le cellule velocemente, delicatamente e in modo robusto anche da tessuti molto difficili. Il vantaggio principale di questo protocollo è la lavorazione semplificata dei tessuti che consente la dissociazione dei tessuti e l'isolamento delle cellule da un gran numero di campioni in breve tempo con una qualità perfetta.
Sebbene questo metodo sia stato sviluppato per i denti di topo e umani, potrebbe essere applicato anche ad altri tessuti ricchi di matrice extracellulare, tra cui cartilagine, ossa o tessuto connettivo denso. La procedura di isolamento delle polpe dentali dai denti umani e in particolare dai denti dei topi è manualmente impegnativa. Consigliamo a tutti di testarlo prima che inizino gli esperimenti reali.
Per iniziare, tieni il topo eutanasizzato dietro la testa guardando l'aspetto ventrale della sua testa in modo che la coda punti via. Usando le forbici piccole e affilate, rimuovere rapidamente la pelle dalla mandibola per esporre l'arco mandibolare, il tessuto molle tra ogni metà delle mandibole e i muscoli facciali adiacenti. Per effettuare un taglio profondo da ciascun lato della mandibola, prima tagliare il massetere lungo il lato buccale della mandibola fino all'articolazione temporo-mandibolare e quindi tagliare lungo la parte interna di ogni metà della mandibola attraverso la base della cavità orale.
Tagliare tutti i muscoli e i legamenti lungo la mandibola fino all'articolazione temporo-mandibolare sia dall'esterno che dall'interno del cavo orale. Afferrare la mandibola usando le pinzette a punta piegata e rimuoverla. Quindi, con le forbici, tagliare la sinfisi mandibolare per dividere la mandibola sezionata in due metà.
Utilizzare una salvietta industriale a bassa lanugine per sfregare il tessuto molle rimanente da ciascuna metà della mandibola. Dopo aver pulito entrambe le parti della mandibola, metterle in una capsula di Petri pre-preparata con HBSS ghiacciato. Per la dissezione degli incisivi mandibolari, rimuovere la cresta alveolare con tutti e tre i molari e rompere trasversalmente l'arco mandibolare nel luogo corrispondente alla posizione tra il primo e il secondo molare.
Estrarre con attenzione l'incisivo dal resto della presa dentale. Se necessario, rimuovere i restanti frammenti di osso attaccati all'incisivo con una pinzetta e un bisturi. Posizionare gli incisivi sezionati in HBSS fresco ghiacciato.
Dopo aver sezionato il tessuto di interesse, posizionare il tessuto molle sezionato in una goccia di HBSS fresco ghiacciato nel mezzo di una capsula di Petri di 10 centimetri tenuta sul ghiaccio. Usando una lama di bisturi numero 10 di forma rotonda, tagliare il tessuto nei pezzi più piccoli possibili. Dopo aver riaggregato i pezzi di tessuto nel mezzo della goccia, tagliare ripetutamente gli aggregati di tessuto con la stessa lama del bisturi e ripetere questo processo fino a quando il materiale non è sufficientemente tritato.
Trasferire i pezzi di tessuto triturato utilizzando una punta di pipetta da un millilitro in una miscela di digestione precedentemente preparata. Quindi posizionare il tubo con un angolo di 60 gradi e impostare la velocità da 150 a 200 RPM per garantire movimenti di sospensione costanti all'interno del tubo e incubare per 15-20 minuti. Dopo ogni tre o quattro minuti durante l'incubazione, titolare vigorosamente la sospensione usando una punta di pipetta da un millilitro per disintegrare tutti i grumi.
Alla fine dell'incubazione, dopo aver titolato la sospensione cellulare per l'ultima volta, aggiungere lentamente la soluzione di lavaggio ghiacciato a un volume finale di 12 millilitri. Centrifugare la sospensione cellulare a 300 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius e quindi rimuovere con cura il surnatante con una pipetta sierologica da 10 millilitri. Sospendere il pellet nella soluzione di lavaggio per ottenere la concentrazione finale da 700 a 1.200 celle per microlitro.
Passare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare da 50 micrometri per rimuovere i rimanenti grumi o pezzi di tessuto calcificato e mantenere il tubo sul ghiaccio fino a un'ulteriore elaborazione. Quindi, per lo smistamento delle celle attivato in modo fluorescente, caricare le celle in un tubo preparato. Caricare il tubo nella selezionatrice di celle e impostare una rigorosa strategia di gating per rimuovere detriti cellulari, doppietti e cellule morte come descritto nel manoscritto di testo.
In primo luogo, la colorazione dell'anticorpo CD45 e la successiva analisi FACS sono state utilizzate per chiarire il numero di cellule immunitarie nella sospensione finale a singola cellula. Come metodo complementare, è stato analizzato il numero totale di cellule immunitarie CD45 positive nei dati di sequenziamento dell'RNA a singola cellula. Utilizzando FACS, sono state identificate il 14,44% di cellule CD45 positive.
L'analisi dei dati di sequenziamento dell'RNA a singola cellula ha mostrato il 10,9% delle cellule che esprimono CD45 e la diminuzione delle cellule nei dati di sequenziamento dell'RNA a singola cellula potrebbe essere causata da una soglia aggiuntiva durante l'analisi di sequenziamento. Le cose chiave sono essere veloci e mantenere questo tessuto o cellule sul ghiaccio quando possibile. Il numero di cellule isolate può essere molto basso soprattutto durante l'isolamento molare del topo.
Evitare la perdita di cellule. Ridurre il tempo di isolamento a singola cellula è molto importante per il successo di tutti gli esperimenti a singola cellula. E questo metodo specifico ha davvero permesso di ridurre questo tempo e aprire la strada a un tipo di cellule dentali di alta qualità per sistemi murini e umani.
