Le prove emergenti hanno implicato il contributo dei macrofagi ganglio della radice dorsale allo sviluppo del dolore neuropatico e alla riparazione assonale nel contesto della lesione nervosa. Fenotipizzare rapidamente la risposta dei macrofagi ganglionari della radice dorsale è desiderato per identificare i fattori neuroimmuni sconosciuti. Qui dimostriamo come il nostro laboratorio isola rapidamente ed efficacemente i macrofagi dai gangli delle radici dorsali usando un protocollo di dissociazione meccanica privo di enzimi.
Questo protocollo richiede molto meno tempo rispetto ai protocolli enzimatici standard, e lo abbiamo usato regolarmente per la nostra analisi di smistamento delle celle attivata dalla fluorescenza. Prima di iniziare l'esperimento, preparare la soluzione di lavoro del mezzo gradiente di densità mescolando nove volumi del mezzo con un volume di HBSS 10X privo di calcio e magnesio e tenerlo sul ghiaccio. Verificare che il mouse sia completamente anestetizzato dalla mancanza di risposta al pizzico posteriore.
Iniziare posizionando un topo anestetizzato all'interno di una cappa chimica dei fumi in posizione supina con quattro zampe fissate con nastro adesivo. Utilizzare le forcep per sollevare la pelle sotto la gabbia toracica. E poi con le forbici chirurgiche, fai una piccola incisione per esporre il fegato e il diaframma.
Usando le stesse forbici, tagliare il diaframma e la gabbia toracica. E poi aprire la cavità pleurica per esporre il cuore pulsante. Successivamente, con le forbici dell'iride, tagliare rapidamente l'appendice atriale destra.
Una volta notato il sanguinamento, inserire un ago calibro 30 nell'estremità posteriore del ventricolo sinistro e iniettare lentamente 10 millilitri di 1X PBS pre-refrigerato per perfondere l'animale. Per eseguire la laminectomia dorsale, posizionare il mouse nella posizione prona. Utilizzare un bisturi di taglia 11 per effettuare due incisioni longitudinali profonde laterale a partire dalla regione toracica fino alla regione sacrale.
Quindi rimuovere la pelle che espone lo strato muscolare dorsale. Quindi con il rongeur Friedman-Pearson, staccare i tessuti e i muscoli connettivi fino a quando non vengono esposti i processi lumbosacrali della colonna vertebrale e i processi trasversali bilaterali. In primo luogo, utilizzare un rongeur Friedman-Pearson per aprire attentamente la colonna vertebrale dorsale, quindi passare da un rongeur Friedman-Pearson a forbici primaverili Noyes per rimuovere le ossa vertebrali, esponendo il midollo spinale con nervi spinali intatti attaccati.
Sezionare accuratamente il DRG lombare ipsilaterale e contralaterale. Posizionarlo in un millilitro di calcio ghiacciato e 1X HBSS privo di magnesio in un omogeneizzatore di tessuti Dounce. Omogeneizzare il tessuto DRG nell'omogeneizzatore Dounce con un pestello sciolto per 20-25 volte.
Posizionare un filtro sterile a celle in nylon da 70 micrometri in un tubo conico sterile da 50 millilitri. Utilizzare 800 microlitri di codice ghiaccio 1X HBSS per bagnare il filtro cellulare. Utilizzare una pipetta per raccogliere la sospensione omogeneizzata del tessuto dall'omogeneizzatore sul filtro a cellule bagnate e raccoglierla nel tubo conico da 50 millilitri.
Risciacquare l'omogeneizzatore due volte con 800 microlitri di freddo ghiaccio 1X HBSS, raccogliendo il liquido nello stesso tubo conico da 50 millilitri per aumentare la resa. Aggiungere 1,5 millilitri di mezzo gradiente di densità isotonica ghiacciato equilibrato in un tubo sterile di pallone in polistirolo a cinque millilitri. Trasferire l'omogeneato cellulare dal tubo conico da 50 millilitri in questo tubo del pallone.
E pipetta su e giù per mescolare bene. Aggiungere altri 500 microlitri di 1X HBSS per sigillare la parte superiore. Centrifugare le cellule a 800 volte G per 20 minuti a quattro gradi Celsius.
Aspirare con cura il supernatante contenente mielina nel mezzo senza disturbare il pellet cellulare nella parte inferiore del tubo. Aggiungere al pellet 100 microlitri di PBS contenenti siero bovino fetale al 5% e sospendere di nuovo le cellule DRG. Quindi aggiungere l'anticorpo APC CX3CR1 del topo alfa alle cellule e incubare al buio a quattro gradi Celsius per un'ora.
Lavare le cellule una volta con cinque millilitri di PBS. Centrifugare le cellule a 360 volte G per otto minuti a quattro gradi Celsius. Aspirare il supernatante, quindi sospendere di nuovo il pellet cellulare in 300 microlitri di PBS per l'analisi dei fatti.
Dopo iniezioni intraperitoneali di AP dimerizzatore proteico legante FK nei topi MaFIA per esaurire i macrofagi, c'è stata una significativa perdita di cellule positive della GFP nei DRG dei topi trattati con AP rispetto ai topi controllati trattati con veicoli. L'analisi dei fatti ha rivelato un impoverimento riuscito dell'elevata popolazione di FPG nei topi trattati con AP e ha dimostrato l'alta qualità delle cellule isolate. Il 4% del totale delle cellule isolate dal DRG dell'animale trattato con veicoli erano alti macrofagi della GFP.
Al contrario, solo lo 0,4% delle celle DRG totali erano macrofagi elevati della GFP nel mouse trattato con AP. Le cellule DRG isolate meccanicamente dai topi di tipo selvatico sono state macchiate con anticorpi CX3CR1-APC del topo alfa. Il 6% delle cellule DRG erano macrofagi positivi CX3CR1.
Quando la vitalità cellulare è stata valutata con ioduro di propidio, ha rivelato che più dell'80% delle cellule DRG appena isolate erano vitali. Se si nota la resa cellulare insoddisfacente, si può sospettare un'omogeneizzazione insufficiente o eccessiva del tessuto DRG. Inoltre, la dissezione DRG può richiedere una pratica ripetuta per i principianti.
Probabilmente l'applicazione del nostro protocollo può essere ampliata per studiare altre cellule non neuronali come cellule satellitari e cellule T. Potrebbero essere necessari ulteriori studi per confermare l'efficacia dell'isolamento cellulare.
