Ringraziamo i membri del laboratorio Wingert per utili discussioni di AKI biologia e tecniche di zebrafish, e C. Diep per condividere la sua ricetta metilcellulosa. Gli autori desiderano esprimere la nostra gratitudine ai membri del personale di Notre Dame Centro per la Ricerca Zebrafish per fornire un&#39;eccellente assistenza continua di allevamento per la nostra colonia zebrafish. Finanziamenti del NIH-NIDDK DK083512 di assegnazione del contributo, e di laboratorio generoso finanziamento di start-up presso l&#39;Università di Notre Dame, sostenuto questo lavoro.

1. Procedura di microiniezione per etichettare il pesce zebra pronephros epitelio tubulo prossimale Per questa procedura, si usa un sistema di microiniezione (Appartus Harvard, PLI90), con l&#39;aria compressa fornita da un compressore d&#39;aria (Jun-Air, Modello 6-4), e apparecchi micromanipolatore (Narishege parti MN151, IP3, e GJI) che sono assemblato in una stazione stereomicroscopio (Nikon, SMZ-Zoom 645) le istruzioni per fabbricante. Coniugati destrano sono prontamente endocitato dal nefrone tubulo prossimale, consentendo l&#39;etichettatura preferenziali di questa popolazione di cellule epiteliali 9. <ol><li> L&#39;esposizione al blu di metilene può accentuare l&#39;autofluorescenza del sacco vitellino e rende la visualizzazione del nefrone tubuli più difficile. </li><li> Sollevare il embrioni fecondati a 28,5 ° C ad un timepoint sviluppo tra 48-55 ore dopo la fecondazione (HPF). Questo è il palcoscenico ideale per eseguire microiniezioni larve a causa della facilità con cui microiniezione intramuscolare può essere eseguita, e perché la funzione renale ha inizio in questo momento. </li><li> Rimuovere il corion da qualsiasi zebrafish unhatched usando un paio di pinze fine. Sciacquare i detriti corion dalla capsula di Petri e riempire il piatto con 30 ml di soluzione modificato E3. </li><li> Preparare un vassoio di iniezione per gli embrioni. I nostri stampi ad iniezione preferito è fatta di 1,5% agarose/E3, in cui si formano depressioni triangolare in modo che l&#39;embrione può essere posizionato all&#39;interno per l&#39;iniezione. Per fare lo stampo di iniezione, si galleggiare uno stampo di plastica con protuberanze a forma di cuneo (descritto in dettaglio in precedenza 11) in una piastra di Petri riempita con una base di 1,5% di agarosio. </li><li> Preparare aghi microiniezione vetro tirando tubi capillari con un estrattore ago, come descritto nel libro Zebrafish 10. In breve, tirare i tubi di vetro capillari quindi utilizzare pinze di metallo sottile per tagliare la punta dell&#39;ago microiniezione di fare una punta con una punta mentre si visualizza la punta dell&#39;ago sotto uno stereomicroscopio. Conservare gli aghi taglio coperto da una capsula di Petri e posizionato su plastilina per proteggere il bordo di taglio e di prevenire l&#39;accumulo di polvere. </li><li> Preparare la soluzione di iniezione per etichettare il tubulo prossimale. Sciogliere 40 kD destrano-fluoresceina coniugato (Invitrogen, D1845) ad una concentrazione di 1 mg / ml in acqua distillata. </li><li> Per anestetizzare il pesce, aggiungere 5 ml di 0,2% Tricaine pH 7,0 alla capsula di Petri contenente le larve pesce zebra in 30 ml di E3. I pesci sono anestetizzati, quando non hanno più mostra la risposta al tocco. E &#39;fondamentale che i pesci siano completamente anestetizzati o saranno contrazione durante il tentativo di iniettare loro. </li><li> Trasferire il pesce anestetizzato per un vassoio di stampo ad iniezione utilizzando una pipetta di plastica di trasferimento. Posizionare l&#39;animale con la testa nella parte più profonda della depressione triangolare bene, e su un fianco in modo che il tronco è a riposo lungo il lato inclinato del pozzo. </li><li> Eseguire microiniezione intramuscolare. Caricare un ago tagliato con 2-3 ml di destrano fluoresceina, e iniettare l&#39;animale in un somite tronco con circa 1 nL di soluzione. Obiettivo per la parte superiore del somite, e di evitare l&#39;estensione del sacco vitellino. Ciò assicura che i tubuli nefrone non sono meccanicamente interrotta dal processo di microiniezione. </li><li> Trasferimento zebrafish iniettato per un piatto pulito Petri e aggiungere modificato soluzione E3. Lavare gli animali 3 volte con E3 dolce per rimuovere ogni traccia di Tricaine. Coprire il coperchio della capsula di Petri con un foglio di alluminio per fornire luce protezione per il destrano, e tornare gli animali per i 28 ° C durante la notte incubatore. </li></ol> 2. Laser ablazione mirata di cellule del tubulo prossimale Per questa procedura, si usa uno stereomicroscopio con epifluorescenza a segno animali con destrano fluoresceina vivaci marcato tubuli prossimali e selezionare questi per ablazione laser. Quindi, usiamo un sistema laser pulsato Micropoint (Strumenti fotonici, Inc) che è stato collegato a un microscopio composto (Nikon Eclipse 80i con attacco epifluorescente), e calibrata per l&#39;uso come istruzioni del produttore, per eseguire l&#39;ablazione delle cellule nefrone. Abbiamo avuto più successo di ablazione delle cellule utilizzando un filtro FITC che consente al ricercatore di visualizzare le regioni tubulo fluorescenti in campo chiaro illuminazione. In anticipo di questa procedura, preparare i media immobilizzazione per l&#39;ablazione, sciogliendo 1,5% di metilcellulosa a 0,02% tricaine/E3. Aliquote negozio di metilcellulosa per l&#39;uso immediato a temperatura ambiente, oppure a 4 ° C per la conservazione a lungo termine. <ol><li> Anestetizzare il pesce zebra 72 HPF aggiungendo 5 ml di 0,2% pH 7,0 Tricaine alla capsula di Petri contenente le larve pesce zebra in 30 ml di E3. I pesci sono anestetizzati, quando non hanno più mostra la risposta al tocco. E &#39;fondamentale che i pesci siano completamente anestetizzati o saranno contrazione durante il tentativo di eseguire l&#39;ablazione laser. </li&gt; <li> Procede all&#39;esame degli animali iniettato sotto l&#39;impostazione appropriata fluorescenti e selezionare gli animali in cui è possibile visualizzare facilmente i tubuli prossimali. </li><li> Trasferimento degli embrioni selezionati per un piatto separato contenente tricaine. Gli animali possono essere anestetizzati fino a 30 minuti prima di eseguire l&#39;ablazione delle cellule. Se il vostro punteggio&gt; 15 animali, di ritorno a queste un piatto separato contenente fresca E3 modificati in attesa ablazione in quanto ogni cella di ablazione richiede diversi minuti. </li><li> Per eseguire l&#39;ablazione, il trasferimento di uno zebrafish anestetizzati ad una piccola scatola di Petri contenente 1,5% methylcellulose/0.02% tricaine per 2 minuti per lavare l&#39;embrione nei media immobilizzazione. </li><li> Poi, il trasferimento dell&#39;embrione a una diapositiva depressione di vetro contenente un calo del 1,5% methylcellulose/0.02% tricaine. Delicatamente la posizione dell&#39;animale con una sonda sottile in modo che il suo lato ventrale si affaccia sul vetrino e lato dorsale è rivolto verso l&#39;alto. </li><li> Mettere il vetrino sul microscopio compund palco, e concentrarsi sul lato dorsale dell&#39;animale. Eseguire l&#39;ablazione delle cellule nefrone sotto fuoco premendo il pedale. Vedrete la dispersione della fluorescenza come le cellule epiteliali renali sono ablazione (figura 1A). </li><li> Delicatamente trasferire l&#39;animale ablato di un pozzo in un 12 ben piatto per la coltura successiva. Sciacquare la E3 2-3 volte per lavare via la metilcellulosa. </li><li> Dopo l&#39;iniezione, aumentare l&#39;animale al timepoint desiderato ed eseguire l&#39;analisi desiderata come stabilito per le tecniche istologiche e molecolari per gli embrioni di pesce zebra giovani (Figura 2). </li></ol> 3. Rappresentante dei risultati: I dati che sono riportati nella Figura 1 indicano il periodo di tempo ablazione. Dopo l&#39;iniezione intramuscolare con destrano-coniugati, il tubulo prossimale è preferenzialmente etichettati. L&#39;iniezione di destrano-FITC è stato usato per etichettare il rene per l&#39;ablazione laser, e gli animali sono stati ablato reiniettate con destrano-rodamina in una sola ablazione aggiuntivi timepoint seguenti re-imaging della popolazione tubulo prossimale. Tecniche di analisi di espressione come ibridazione in situ può essere usata per analizzare i cambiamenti nei campioni fissati a timepoints singolo dopo ablazione delle cellule, come mostrato nella Figura 2. <img src="/files/ftp_upload/2845/2845fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1: procedura di ablazione laser è seguita da una rapida rigenerazione dell&#39;epitelio del tubulo (AC) Timecourse di cambiamenti cellulari durante e dopo ablazione laser di tubuli larva zebrafish prossimali al momento della ablazione (giorno 3, pannello A), o uno o tre. giorni dopo l&#39;ablazione (giorno 4, pannello B; giorno 7, pannello C). (Top) schemi mostrano la posizione del nefrone, con destrano-FITC (verde) e destrano-rodamina (rosso), e (in basso) immagini dal vivo di controllo e di laser-ablazione (LA) nefroni. <img src="/files/ftp_upload/2845/2845fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2:. Analisi di espressione genica dopo ablazione laser Dopo ablazione laser al giorno 3, gli embrioni sono stati fissati e trattati da montare tutto ibridazione in situ per rilevare trascrizioni per slc20a1a, che segnano il segmento contorto tubulo prossimale del nefrone. (A) Un embrione di controllo che non è stato sottoposto ad ablazione laser, (B) un embrione in cui è stato asportato un ampio tratto di epitelio dei tubuli, e (C) un embrione in cui un breve intervallo di epitelio dei tubuli è stato ablato. Linea nera indica l&#39;entità del tubulo prossimale in A per fornire riferimento, le linee blu indicano il grado di ablazione laser in pannelli aC, e * indica il controllo (non ablato) nefrone controlaterale in pannelli aC.

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il pesce zebra è un organismo modello molto utilizzato in tutto molti aspetti della scienza, le applicazioni di cui sono in crescita 6. L&#39;impiego del sistema modello Danio rerio nello studio delle malattie renali, come AKI ha portato ad importanti osservazioni e continuerà ad essere un buon modello per studiare danno renale 7,8. Con un genoma che è stato sequenziato e molti protocolli molecolari in atto, è diventato sempre più facile da eseguire ricerche sofisticate zebrafish che utilizza modelli transgenici, knockdown genica e studi misexpression. Il pesce zebra ha un ciclo di vita breve con dimensioni di generazione di grandi dimensioni e fasi di sviluppo ben definito. Inoltre, il pesce zebra fasi embrionale e larvale sono in gran parte trasparente, rendendo gli studi di imaging possibile senza dissezione dell&#39;organismo. In tutto le fasi embrionale e larvale, il pesce zebra ha un rene pronephric composto da due nefroni, che rimangono visibili nel corso di questi punti temporali di sviluppo. Zebrafish nefroni pronephric sono analoghe per struttura e funzione ai loro omologhi nei mammiferi, il che rende un buon modello per studi di insufficienza renale acuta 4,5. Il rene è cruciale per la sopravvivenza degli esseri umani e altri vertebrati, che funge da organo che purifica il corpo di scorie metaboliche liquido. Questa funzione di pulizia si basa sulla capacità dei nefroni rene di filtrare il sangue, e quindi modificare il filtrato per raccogliere i rifiuti azotati per la secrezione e contemporaneamente mantenere il bilancio idro-elettrolitico. Nefroni sono costituiti da un filtro del sangue, tubulo epiteliale, e in un condotto di scarico. L&#39;integrità strutturale e funzionale di tutte le tre parti è parte integrante della funzione nefrone. Insulti vari al rene, compresa l&#39;esposizione a nefrotossine, ischemia, o di ostruzione delle vie del flusso urinario può provocare AKI 1. La patologia di AKI è spesso associata a necrosi tubulare acuta 1,2. Gli studi clinici hanno dimostrato che la conseguente insufficienza renale ha un tasso di mortalità che può variare 7-80% a seconda della causa e il contesto del insufficienza renale. Tuttavia, una diagnosi rapida e l&#39;inversione della causa sottostante di AKI è sempre più associato con il recupero attraverso la rigenerazione dei tubuli nefrone necrotico. Recenti studi di mappatura destino hanno dimostrato che la popolazione di cellule principali che ripopola tubuli nefrone danneggiate sono cellule epiteliali che hanno origine da adiacenti, aree illeso 12. Questi risultati non hanno eliminato la possibilità che renale cellule staminali / progenitrici possono partecipare al processo, e le relazioni indipendenti hanno suggerito che le cellule del midollo osseo derivate possono contribuire alla rigenerazione renale 13. E &#39;chiaro che le indagini costante per risolvere meglio le fonti di cellulare renale rigenerazione epiteliale. Sia la rigenerazione e lo sviluppo nefrone condividere il fenomeno degli switch allo stato cellulare tra fenotipi mesenchimali ed epiteliali. Durante lo sviluppo nefrone, le cellule progenitrici mesenchimali si differenziano in un fenotipo stazionaria, allegando una membrana basale a formare l&#39;epitelio tubolare 3. Il fenomeno migratorio ipotizzato di cellule epiteliali seguenti insufficienza renale acuta necessita di una de-differenziazione in un fenotipo mesenchimale. È interessante notare che studi recenti suggeriscono che le cellule mesenchimali nel rene danneggiato esibiscono un profilo di espressione simile a una cellula mesenchimale durante lo sviluppo 14. Diversi rapporti hanno rilevato cambiamenti nelle molecole di adesione cellulare, proteine ​​della matrice, citochine e chemochine. Dopo la mesenchimali proposto di transizione epiteliali, le cellule rimontare su una membrana basale e riavviare tubolare attività epiteliali. Determinare i geni importanti in questo processo continua ad essere un argomento di ricerca del nostro laboratorio e altri. Gran parte del lavoro per chiarire i fattori chiave in questo processo resta ancora da fare, ma i progressi significativi nel campo è stato annunciato dallo studio degli effetti di gentamicina. AKI e insufficienza renale causata da gentamicina è rilevante considerando la prevalenza dei composti nefrotossici utilizzato in medicina 15. Usato come trattamento per le infezioni batteriche gram-negativi, la somministrazione di aminoglicosidi produce la lesione acuta nel 10-25% dei casi. Il farmaco provoca una pletora di effetti negativi cellulare, insieme con conseguente apoptosi o necrosi in molte cellule tubulari. Gli studi hanno trovato il farmaco di legarsi preferenzialmente ad un complesso formato da megalin cubulin e che è coinvolto in endocitosi. Queste molecole si trovano in abbondanza nelle cellule epiteliali del tubulo prossimale, anche se non si limitano a espressione in queste cellule. Attraverso la segnalazione cellulare con conseguente induzione di stress ossidativo, il rilascio di vasocostrittori, esaurimento di cellulare di ATP, l&#39;ipossia, l&#39;inibizione della fosfolipasi, antibiotici gentamicina e simili causanoapoptosi e necrosi in cellule epiteliali. Inoltre, gli antibiotici innescare contrazione mesangiale nel sangue nefrone filtro (glomerulo), con un conseguente calo della velocità di filtrazione glomerulare e negativamente alterare la capacità del rene di filtrare il sangue. La produzione di specie reattive dell&#39;ossigeno, molecole immunostimolante, e l&#39;attivazione di fosfolipasi hanno effetti diffusi nel nefrone, creando un catastrofico patologia che porta a insufficienza renale acuta. Mentre gli studi di antibiotici gentamicina e simili sono stati e continueranno ad essere strumenti importanti per la ricerca rigenerazione del rene, non hanno una precisione che può essere utile per affrontare alcune questioni. Il nostro sistema di utilizzare il pesce zebra in combinazione con un metodo di ablazione laser descritto in questo protocollo risponde alla necessità di un tale strumento di ricerca precisa. Ablazione laser permette ai ricercatori di indurre la distruzione delle cellule in zone focali del tubulo renale, che vanno da un piccolo (2-3) di grandi dimensioni (&gt; 50-100) le popolazioni, con una precisione senza eguali. In questo protocollo, utilizziamo un metodo sviluppato in precedenza di esposizione al destrano-coniugati per etichettare preferenzialmente popolazioni epiteliali del tubulo prossimale. In alternativa, le linee transgeniche zebrafish che esprimono la proteina fluorescente verde in una o più regioni del tubulo potrebbero essere utilizzati. Per esempio, cadherin17: eGFP zebrafish transgenico presentano fluorescenza forte nelle regioni tubulo distale (ma debole nelle popolazioni prossimale), e potrebbe essere prezioso per gli studi di rigenerazione in altri segmenti del tubulo 16. La visibilità del nefrone consentirà time-lapse registrazione video di cambiamenti cellulari nel corso del tempo. Quando accoppiato con studi di espressione genica come montare tutto ibridazione in situ o immunoistochimica, i ricercatori in grado di rilevare alterazioni molecolari nel nefrone nel tempo. Nel loro insieme, tali strategie può cominciare a formulare una comprensione più dinamica degli eventi che traspaiono quando cellule epiteliali renali vengono distrutti. L&#39;avvertenza importante del nostro modello di ablazione laser è che si può ricapitolare aspetti parziali delle condizioni fisiologiche che traspaiono nel umana AKI. La morte cellulare indotta attraverso istantanee danno fisico è diversa da quella cascata di eventi che porta alla necrosi delle cellule, e come tale i fattori umorali in questi microambienti diversi non può essere identico. Inoltre, esiste evidenza di apoptosi indotta durante il danno renale, e non è noto se tali conseguenze trasparire insulto seguente con un laser. Tuttavia, proprio come la coltura cellulare è uno strumento che meglio risponde ad alcune domande che necessitano di un ambiente altamente controllato, ablazione laser, servirà come altamente controllato modello in vivo di AKI. Come tale, la intuizioni ottenuto da studi ablazione dell&#39;epitelio renale in zebrafish probabilmente promuovere scoperta di intuizioni fondamentali che possono essere applicati alle indagini delle altre lesioni renali e potenzialmente usato per creare una migliore diagnostica negli esseri umani.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th></tr><tr><td> Embrione piatti </td><td> Falco </td><td> 35-1005 </td></tr><tr><td> Dissezione forcipe </td><td> Roboz </td><td> RS-5010 </td></tr><tr><td> Aghi per iniezione </td><td> Sutter STRUMENTI </td><td> BF100-50-10 </td></tr><tr><td> Ultrapura agarosio </td><td> Invitrogen </td><td> 16500-500 </td></tr><tr><td> 40 kilodalton (KD) destrano-fluoresceina </td><td> Invitrogen </td><td> D1845 </td></tr><tr><td> Trasferimento pipetta di plastica </td><td> Samco scientifico, Fisher </td><td> 204, 13-711-23 </td></tr><tr><td> Tricaine </td><td> Sigma </td><td> E10521 </td></tr><tr><td> Metilcellulosa </td><td> Sigma </td><td> M0262 </td></tr><tr><td> Depressione scivolo </td><td> Pescatore </td><td> S175201 </td></tr><tr><td> 12-ben piatto </td><td> Corning </td><td> 3512 </td></tr></tbody></table>

laser ablation of the zebrafish pronephros to study renal epithelial regeneration

Danno renale acuto (AKI) è caratterizzata da elevati tassi di mortalità dal deterioramento della funzione renale in un periodo di ore o giorni che culmina con insufficienza renale 1. AKI può essere causato da una serie di fattori tra cui l&#39;ischemia, farmaco a base di tossicità, o lesioni ostruttive 1. Ciò si traduce in una incapacità di mantenere l&#39;omeostasi dei fluidi e di elettroliti. Mentre AKI è stata osservata per decenni, efficaci terapie cliniche sono ancora da sviluppare. Curiosamente, alcuni pazienti con danno renale acuto recuperare funzionalità renale nel corso del tempo, un fenomeno misterioso che è stato solo rudimentale caratterizzata 1,2. La ricerca che utilizza modelli di mammiferi di AKI ha dimostrato che i reni nefrotossina ischemica o con lesioni esperienza di morte delle cellule epiteliali nel nefrone tubuli 1,2, le unità funzionali del rene che sono costituiti da una serie di regioni specializzate (segmenti) di tipi di cellule epiteliali 3 . All&#39;interno di nefroni, la morte delle cellule epiteliali è più alta in cellule del tubulo prossimale. Ci sono prove che suggeriscono la distruzione delle cellule è seguito da de-differenziazione, la proliferazione e la migrazione delle cellule epiteliali circostanti, che può rigenerare il nefrone interamente 1,2. Tuttavia, ci sono molte domande senza risposta circa i meccanismi di rigenerazione dell&#39;epitelio renale, che vanno dai segnali che modulano questi eventi per motivi di variazione gamma di capacità tra gli esseri umani per rigenerare reni feriti. Il pesce zebra larvale fornisce un modello eccellente per studiare la rigenerazione dell&#39;epitelio renale come il suo rene pronephric si compone di nefroni che si conservano con vertebrati superiori tra cui i mammiferi 4,5. Il nefroni delle larve zebrafish possono essere visualizzati con tecniche di fluorescenza a causa della relativa trasparenza del giovane zebrafish 6. Questo fornisce un&#39;opportunità unica di cella di immagine e cambiamenti molecolari in tempo reale, in contrasto con i modelli dei mammiferi in cui nefroni sono inaccessibili perché i reni sono sistemi strutturalmente complessi internalizzati nel animale. Recenti studi hanno impiegato la gentamicina aminoglicoside come agente tossico causale per lo studio di AKI e conseguente insufficienza renale: gentamicina e altri antibiotici hanno dimostrato di provocare AKI negli esseri umani, ei ricercatori hanno formulato metodi da utilizzare per attivare questo agente danni renali in zebrafish 7 , 8. Tuttavia, gli effetti di tossicità degli aminoglicosidi nelle larve di zebrafish sono catastrofiche e letale, che presenta una difficoltà quando si studia la rigenerazione epiteliale e la funzione nel tempo. Il nostro metodo presenta l&#39;utilizzo di ablazione delle cellule bersaglio, come un nuovo strumento per lo studio delle lesioni epiteliali in zebrafish. Ablazione laser offre ai ricercatori la capacità di indurre la morte delle cellule in una popolazione limitata di cellule. Aree diverse di cellule possono essere mirati in base alla posizione morfologica, la funzione, o anche espressione di un particolare fenotipo cellulare. Così, ablazione laser aumenta la specificità di quello che i ricercatori possono studiare, e può essere un approccio nuovo ed efficace per far luce sui meccanismi di rigenerazione dell&#39;epitelio renale. Questo protocollo può essere ampiamente applicata a popolazioni di cellule bersaglio in altri organi nell&#39;embrione zebrafish per studiare lesioni e di rigenerazione in un qualsiasi numero di contesti di interesse.

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Laser Ablation of the Zebrafish Pronephros to Study Renal Epithelial Regeneration

Danno renale acuto (AKI) negli esseri umani è un problema comune clinico causato da un danno alle cellule epiteliali che costituiscono nefroni renali e AKI è associata ad elevati tassi di mortalità del 50-70% 1. A seguito di distruzione delle cellule epiteliali, nefroni hanno una limitata capacità di rigenerarsi, anche se i meccanismi e le limitazioni che guidano questo fenomeno sono ancora poco compresi. In questo articolo video, descriviamo la nostra tecnica di ablazione laser mirato delle cellule renali nefrone nel rene embrione zebrafish, o pronephros. Il nostro nuovo metodo può essere utilizzato per integrare nefrotossicità indotta modelli di AKI e ottenere un&#39;immagine ad alta risoluzione comprensione delle alterazioni cellulari e molecolari che sono associati con la rigenerazione epiteliale nel nefrone renale.

Ablazione laser del Pronephros Zebrafish allo Studio renale rigenerazione epiteliale

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in ...

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Research

JoVE Journal

Biology

15.2K Views.  University of Notre Dame. Danno renale acuto (AKI) negli esseri umani è un problema comune clinico causato da un danno alle cellule epiteliali che costituiscono nefroni renali e AKI è associata ad elevati tassi di mortalità del 50-70% 1. A seguito di distruzione delle cellule epiteliali, nefroni hanno una limitata capacità di rigenerarsi, anche se i meccanismi e le limitazioni che guidano questo fenomeno sono ancora poco compresi. In questo articolo video, descriviamo la nostra tecnica di abla...

Video: Laser Ablation of the Zebrafish Pronephros to Study Renal Epithelial Regeneration

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of the visual system provide more empirical evidence for functional applications. Investigation into the sensory system provides information about the sensory capacity, learning and memory ability, and establishes known baseline behaviour in which to gauge deviations (Burghardt, 1977). However, unlike mammalian or avian systems, testing for learning and memory in a reptile species is difficult. Furthermore, using an operant paradigm as a psychophysical measure of sensory ability is likewise as difficult. Historically, reptilian species have responded poorly to conditioning trials because of issues related to motivation, physiology, metabolism, and basic biological characteristics. Here, I demonstrate an operant paradigm used a novel model lizard species, the Jacky dragon (Amphibolurus muricatus) and describe how to test peripheral sensitivity to salient speed and motion characteristics. This method uses an innovative approach to assessing learning and sensory capacity in lizards. I employ the use of random-dot kinematograms (RDKs) to measure sensitivity to speed, and manipulate the level of signal strength by changing the proportion of dots moving in a coherent direction. RDKs do not represent a biologically meaningful stimulus, engages the visual system, and is a classic psychophysical tool used to measure sensitivity in humans and other animals. Here, RDKs are displayed to lizards using three video playback systems. Lizards are to select the direction (left or right) in which they perceive dots to be moving. Selection of the appropriate direction is reinforced by biologically important prey stimuli, simulated by computer-animated invertebrates.

Testing visual sensitivity in lizards using an operant conditioning paradigm that employs video playback of random-dot kinematograms and computer-generated invertebrates.

Test di sensibilità visiva alla velocità e direzione del movimento in lucertole

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Ricerca

Biologia

Cortical Neurogenesis: Transitioning from Advances in the Laboratory to Cell-Based Therapies

Neurogenesi corticale: Transizione dai progressi nel laboratorio di terapie basate sulle cellule

Murine Renal Transplantation Procedure

Renal orthotopic transplantation in mice is a technically challenging procedure. Although the first kidney transplants in mice were performed by Russell et al over 30 years ago (1) and refined by Zhang et al years later (2), few people in the world have mastered this procedure. In our laboratory we have successfully performed 1200 orthotopic kidney transplantations with &gt; 90% survival rate. The key points for success include stringent control of reperfusion injury, bleeding and thrombosis, both during the procedure and post-transplantation, and use of 10-0 instead of 11-0 suture for anastomoses.
Post-operative care and treatment of the recipient is extremely important to transplant success and evaluation. All renal graft recipients receive antibiotics in the form of an injection of penicillin immediately post-transplant and sulfatrim in the drinking water continually. Overall animal health is evaluated daily and whole blood creatinine analyses are performed routinely with a portable I-STAT machine to assess graft function.

Renal transplantation in mice is a technically challenging procedure that requires careful post-operative care and treatment for success.

Murino procedura trapianto renale

Renal orthotopic transplantation in mice is a technically challenging procedure. Although the first kidney transplants in mice were performed by Russell ...

Methods for the Study of the Zebrafish Maxillary Barbel

Barbels are skin sensory appendages found in fishes, reptiles and amphibians. The zebrafish, Danio rerio, develops two pairs of barbels- a short nasal pair and a longer maxillary pair. Barbel tissue contains cells of ectodermal, mesodermal and neural crest origin, including skin cells, glands, taste buds, melanocytes, circulatory vessels and sensory nerves. Unlike most adult tissue, the maxillary barbel is optically clear, allowing us to visualize the development and maintenance of these tissue types throughout the life cycle. 
This video shows early development of the maxillary barbel (beginning approximately one month post-fertilization) and demonstrates a surgical protocol to induce regeneration in the adult appendage (&gt;3 months post-fertilization). Briefly, the left maxillary barbel of an anesthetized fish is elevated with sterile forceps just distal to the caudal edge of the maxilla. A fine, sterile spring scissors is positioned against the forceps to cut the barbel shaft at this level, establishing an anatomical landmark for the amputation plane. Regenerative growth can be measured with respect to this plane, and in comparison to the contralateral barbel. Barbel tissue regenerates rapidly, reaching maximal regrowth within 2 weeks of injury.
Techniques for analyzing the regenerated barbel include dissecting and embedding matched pairs of barbels (regenerate and control) in the wells of a standard DNA electrophoresis gel. Embedded specimens are conveniently photographed under a stereomicroscope for gross morphology and morphometry, and can be stored for weeks prior to downstream applications such as paraffin histology, cryosectioning, and/or whole mount immunohistochemistry. These methods establish the maxillary barbel as a novel in vivo tissue system for studying the regenerative capacity of multiple cell types within the genetic context of zebrafish.

The zebrafish maxillary barbel is an integumentary sense organ containing ectodermal, mesodermal and neural crest derivatives. Importantly, the adult barbel can regenerate after proximal amputation. This video introduces maxillary barbel development and demonstrates a surgical protocol to induce regeneration, followed by collection, embedding and downstream imaging of barbel specimens.

Metodi per lo studio del mascellare Zebrafish Barbel

Barbels are skin sensory appendages found in fishes, reptiles and amphibians.  The zebrafish, Danio rerio, develops two pairs of barbels- a short nasal ...

Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish1-5. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adult zabrafish. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish with our simple custom-built apparatus using a new protocol which is established in our lab. Both our apparatus and step-by-step procedure of OKR in adult zebrafish are illustrated in this video. In addition, the measurements of the larval OKR, as well as the optomotor response (OMR) test of adult zebrafish, are also demonstrated in this video. This OKR assay of adult zebrafish in our experiment may last for up to 4 hours. Such OKR test applied in adult fish will benefit to visual function investigation more efficiently when the adult fish vision system is manipulated.
Su-Qi Zou and Wu Yin contributed equally to this paper.

Optokinetic response has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adults1-5. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish using a new protocol which is established in our lab.

Utilizzando la risposta optocinetico per studiare la funzione visiva del pesce zebra

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the ...

A System for Culturing Iris Pigment Epithelial Cells to Study Lens Regeneration in Newt

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, heart, the jaw 1. Specifically, newts are unique for its lens regeneration capability. Upon lens removal, IPE cells of the dorsal iris transdifferentiate to lens cells and eventually form a new lens in about a month 2,3. This property of regeneration is never exhibited by the ventral iris cells. The regeneration potential of the iris cells can be studied by making transplants of the in vitro cultured IPE cells. For the culture, the dorsal and ventral iris cells are first isolated from the eye and cultured separately for a time period of 2 weeks (Figure 1). These cultured cells are reaggregated and implanted back to the newt eye. Past studies have shown that the dorsal reaggregate maintains its lens forming capacity whereas the ventral aggregate does not form a lens, recapitulating, thus the in vivo process (Figure 2) 4,5. This system of determining regeneration potential of dorsal and ventral iris cells is very useful in studying the role of genes and proteins involved in lens regeneration.

In newt, the lens regenerates always from the dorsal iris by transdifferentiation of the iris pigmented epithelial cells (IPEs). Here we describe a procedure to culture dorsal and ventral newt IPE cells and their implantation to the newt eye. The implanted cells are then studied by tissue sectioning and immunohistochemistry.

Un sistema per la coltura cellule epiteliali del pigmento Iris a studio Rigenerazione Lens Newt

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an attractive model system to study organ development and tissue-specific signaling. Although hair follicle development is genetically tractable, fast and reproducible analysis of factors essential for this process remains a challenge. Here we describe a procedure to generate targeted overexpression or shRNA-mediated knockdown of factors using lentivirus in a tissue-specific manner. Using a modified version of a hair regeneration model 5, 6, 11, we can achieve robust gain- or loss-of-function analysis in primary mouse keratinocytes or dermal cells to facilitate study of epithelial-mesenchymal signaling pathways that lead to hair follicle morphogenesis. We describe how to isolate fresh primary mouse keratinocytes and dermal cells, which contain dermal papilla cells and their precursors, deliver lentivirus containing either shRNA or cDNA to one of the cell populations, and combine the cells to generate fully formed hair follicles on the backs of nude mice. This approach allows analysis of tissue-specific factors required to generate hair follicles within three weeks and provides a fast and convenient companion to existing genetic models.

Tissue-specific analysis of a hair follicle regeneration model using lentivirus to mediate gain- or loss-of-function.

Rapida analisi genetica di epitelio-mesenchimale segnalazione durante la rigenerazione dei capelli

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Application of Retinoic Acid to Obtain Osteocytes Cultures from Primary Mouse Osteoblasts

The need for osteocyte cultures is well known to the community of bone researchers; isolation of primary osteocytes is difficult and produces low cell numbers. Therefore, the most widely used cellular system is the osteocyte-like MLO-Y4 cell line.
The method here described refers to the use of retinoic acid to generate a homogeneous population of ramified cells with morphological and molecular osteocyte features.
After isolation of osteoblasts from mouse calvaria, all-trans retinoic acid (ATRA) is added to cell medium, and cell monitoring is conducted daily under an inverted microscope. First morphological changes are detectable after 2 days of treatment and differentiation is generally complete in 5 days, with progressive development of dendrites, loss of the ability to produce extracellular matrix, down-regulation of osteoblast markers and up-regulation of osteocyte-specific molecules.
Daily cell monitoring is needed because of the inherent variability of primary cells, and the protocol can be adapted with minimal variation to cells obtained from different mouse strains and applied to transgenic models. 
The method is easy to perform and does not require special instrumentation, it is highly reproducible, and rapidly generates a mature osteocyte population in complete absence of extracellular matrix, allowing the use of these cells for unlimited biological applications.

Treatment of primary mouse osteoblasts with retinoic acid produces a homogeneous population of ramified cells bearing morphological and molecular features of osteocytes. The method overcomes the difficulty of obtaining and maintaining primary osteocytes in culture, and can be advantageous to study cells derived from transgenic models.&#160;

Applicazione di acido retinoico per ottenere colture osteocytes da principale del mouse osteoblasti

The need for osteocyte cultures is well known to the community of bone researchers; isolation of primary osteocytes is difficult and produces low cell ...

Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial function, cell death, cell metabolism and cell migration to name but a few. Cytosolic calcium is normally maintained at low nanomolar concentrations; rather it is found in high micromolar to millimolar concentrations in the endoplasmic reticulum, mitochondrial matrix and the extracellular compartment. Upon stimulation, a transient increase in cytosolic calcium serves to signal downstream events. Detecting changes in cytosolic calcium is normally performed using a live cell imaging set up with calcium binding dyes that exhibit either an increase in fluorescence intensity or a shift in the emission wavelength upon calcium binding. However, a live cell imaging set up is not freely accessible to all researchers. Alternative detection methods have been optimized for immunological cells with flow cytometry and for non-immunological adherent cells with a fluorescence microplate reader. Here, we describe an optimized, simple method for detecting changes in epithelial cells with flow cytometry using a single wavelength calcium binding dye. Adherent renal proximal tubule epithelial cells, which are normally difficult to load with dyes, were loaded with a fluorescent cell permeable calcium binding dye in the presence of probenecid, brought into suspension and calcium signals were monitored before and after addition of thapsigargin, tunicamycin and ionomycin.

Calcium is involved in numerous physiological and pathophysiological signaling pathways. Live cell imaging requires specialized equipment and can be time consuming. A quick, simple method using a flow cytometer to determine relative changes in cytosolic calcium in adherent epithelial cells brought into suspension was optimized.

Misure calcio citosolico nelle cellule epiteliali renali mediante citometria di flusso

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial ...

Laser Micro-Irradiation to Study DNA Recruitment During S Phase

DNA damage repair maintains the genetic integrity of cells in a highly reactive environment. Cells may accumulate various types of DNA damage due to both endogenous and exogenous sources such as metabolic activities or UV radiation. Without DNA repair, the cell's genetic code becomes compromised, undermining the structures and functions of proteins and potentially causing disease. 
Understanding the spatiotemporal dynamics of the different DNA repair pathways in various cell cycle phases is crucial in the field of DNA damage repair. Current fluorescent microscopy techniques provide great tools to measure the recruitment kinetics of different repair proteins after DNA damage induction. DNA synthesis during the S phase of the cell cycle is a peculiar point in cell fate regarding DNA repair. It provides a unique window to screen the entire genome for mistakes. At the same time, DNA synthesis errors also pose a threat to DNA integrity that is not encountered in non-dividing cells. Therefore, DNA repair processes differ significantly in S phase as compared to other phases of the cell cycle, and those differences are poorly understood. 
The following protocol describes the preparation of cell lines and the measurement of dynamics of DNA repair proteins in S phase at locally induced DNA damage sites, using a laser-scanning confocal microscope equipped with a 405 nm laser line. Tagged PCNA (with mPlum) is used as a cell cycle marker combined with an AcGFP-labeled repair protein of interest (i.e., EXO1b) to measure the DNA damage recruitment in S phase.

This protocol describes a non-invasive method to efficiently identify S-phase cells for downstream microscopy studies, such as measuring DNA repair protein recruitment by laser micro-irradiation.

Microirraggiamento laser per studiare il reclutamento del DNA durante la fase S

DNA damage repair maintains the genetic integrity of cells in a highly reactive environment. Cells may accumulate various types of DNA damage due to both ...