Questi studi sono stati finanziati, in parte, da finanziamenti della ricerca e sviluppo della Fondazione alternativa (107.588), l&#39;Istituto Nazionale della Salute (1U54CA136465-04S1), e la California Breast Cancer Research Program (201B-0141). Ringraziamo Drs. Andrew Wilber e R. Scott McIvor per la generosa donazione di loro <pkt2 lubig=""> transponson e PK / hUbiC-SB11 plasmidi trasposasi. Noi riconosciamo con gratitudine John Tamaresis, Ph.D. per consigli su metodi statistici, Timothy Brown per l&#39;esecuzione di citometria a flusso, Georgette Henrich per consigli su migrazioni saggi, e Nancy Bellagamba per facilitare la raccolta di campioni THR. </pkt2>

Teste femorali sono stati prelevati da pazienti sottoposti a chirurgia elettiva THR presso il Dipartimento di Chirurgia Ortopedica presso la Facoltà di Medicina dell&#39;Università di Stanford. Tutti i tessuti sono stati raccolti come campioni de-identificati conformemente ai regolamenti della ricerca dell&#39;Ufficio Compliance Stanford University. 1. Selezione di un cancro al seno linea cellulare (s) <ol><li> Ottenere o trasfettare linea di cellule di cancro al seno desiderata (s) con una luciferasi-GFP giornalista costrutto. I seguenti esperimenti sono stati eseguiti utilizzando il MCF-7 di cancro al seno linee cellulari progettati per l&#39;espressione stabile di luciferasi lucciola (Fluc) e la proteina fluorescente verde (EGFP) MDA-MB-231 e dalla trasfezione con la Bella Addormentata transposon plasmide pKT2 / Lubig e il pK trasposasi plasmide / hUbiC-SB11 45,46. NOTA: Le linee cellulari transfettate sono indicati come MDA-MB-231-Fluc-EGFP e MCF-7-Fluc-EGFP. </li></ol> 2. Isolare Tissue Fragments da femorali Heads <ol><li> Dopo l&#39;intervento chirurgico THR, raccogliere la testa femorale scartato in un contenitore sterile riempito con soluzione salina fisiologica. Trasferire il campione al laboratorio ed elaborare entro 1-3 ore di intervento chirurgico. Nota: se c&#39;è un ritardo nella lavorazione, posizionare il campione a 4 ° C. </li><li> Preparare una zona di lavoro inserendo le seguenti voci su un tappetino assorbente in una cappa coltura tissutale flusso laminare: guanti sterili, rongeur chirurgica, pinze, bicchiere con il 70% di isopropanolo per lavare gli strumenti e recipienti di coltura dei tessuti, come previsto per ogni tipo di esperimento . </li><li> Indossare un guanto chirurgico sterile per tenere la testa del femore rotonda in una mano, utilizzare la rongeur nell&#39;altra mano per estrarre frammenti ossei trabecolari di dimensioni desiderate (~ 2-5 mm) dal albero superiore esposta del femore. Trasferire frammenti ossei nel recipiente di coltura (ad esempio, 6, 12, o 24 pozzetti coltura tissutale o camera di migrazione), a seconda del tipo della proliferazione, colesperimento onization o la migrazione, come descritto nei passaggi da 3, 4 o 5. NOTA: frammenti di tessuto osseo deve essere raccolto come descritto sopra dopo aver completato i passaggi iniziali per ogni saggio specifico di proliferazione, colonizzazione o migrazione. Frammenti varieranno in dimensioni come mostrato in Figura 2. I frammenti possono essere pesati prima o dopo esperimenti allo scopo di normalizzazione. </li></ol> 3. Co-coltura di cellule tumorali del seno Adiacente a frammenti ossei di Misura seno Cell Proliferation Uso BLI <ol><li> Prima dell&#39;esperimento, preparare una sospensione contenente 2 x 10 5 cellule del cancro al seno / 50 microlitri, e preparare i tappi di cera osso per immobilizzare frammenti ossei nella cultura. Tagliare una punta P200 micropipetta in 3 pezzi e utilizzare l&#39;estremità più stretta il più grande pezzo in modo &quot;cookie cutter&quot; per tagliare piccoli (~ 35 mg) pezzi di cera osso. Utilizzare l&#39;estremità larga del pezzo più piccolo per espellere i tappi di cera osso in una capsula di Petriper lo stoccaggio. </li><li> Posizionare un pezzo di cera osso nella posizione delle 12 di ogni bene e premere delicatamente con un indice sterile guantata. </li><li> Pipettare 50 ml di sospensione cellulare contenente 1 x 10 5 cellule di carcinoma mammario in DMEM-10% FBS + Pen-Strep nel centro di ciascun pozzetto di una piastra da 6 pozzetti. (In alternativa, le cellule di semi in un modello di dispersione, se lo si desidera). Posizionare la piastra a 37 ° C di coltura tissutale incubatore per 45 min a promuovere l&#39;adesione delle cellule. </li><li> Mettere frammento osseo 1 su 1 pezzo di cera dell&#39;osso per ogni pozzetto sperimentale e applicare una leggera pressione con il rongeur per fissarlo. Effettuare esperimenti in triplice copia in modo che 3 frammenti ossei di un dato campione THR vengono inseriti nei primi tre pozzi, mentre la parte inferiore tre pozzi contengono cera osso solo come controlli. </li><li> Usando una pipetta da 5 ml, delicatamente e lentamente fornire 5 ml di DMEM-10% FBS al lato di ogni pozzetto per evitare di spostare le cellule del seno o frammenti ossei. Posizionare la piastra a 3776; C tessuto cultura incubatore per 20-24 ore. </li><li> Per eseguire l&#39;imaging bioluminescenza (BLI) rimuovere la piastra dall&#39;incubatore e aggiungere substrato luciferina (per ottenere una concentrazione di 300 mg / ml) per ciascun bene. Immagine del piatto immediatamente su una piattaforma di imaging IVIS utilizzando i seguenti parametri: f-stop di 1, piccolo di categorizzazione, tempo di esposizione di 1 sec, livello D. Misurare l&#39;intensità del segnale di ogni e radianza media (fotoni / secondo / centimetro quadrato / steradiante). </li><li> Utilizzare il software di imaging per definire regioni di interesse (ROI) per quantificare la radianza media per tutti i pozzetti sperimentale e di controllo. Esportare i valori medi di radianza a un foglio Excel per effettuare statistiche e generare grafici. </li></ol> 4. Co-coltura di cellule tumorali del seno seminati direttamente su frammenti ossei allo Studio Colonizzazione e numero di cellulare <ol><li> Utilizzare pinze per inserire frammenti ossei direttamente nei pozzetti vuoti di una piastra di coltura tissutale 24 pozzetti (1 frammento / pozzetto). </li><li> Semeette 50 microlitri sospensione cellulare gocciolina di DMEM-10% FBS contenente 1 x 03-06 Ottobre cellule di carcinoma mammario direttamente sulla parte superiore di ciascun frammento osseo. Posizionare la piastra a 37 ° C di tessuto cultura incubatore per 45 min a promuovere l&#39;adesione delle cellule. Aggiungere delicatamente 1-2 ml DMEM-10% FBS nel lato di ciascun pozzetto tale che il frammento è interamente sommerso in terreno. Incubare la piastra a 37 ° C di tessuto cultura incubatore per 20-24 ore. </li><li> Dopo l&#39;incubazione, utilizzare pinze per trasferire ciascun frammento tessuto osseo ad una piastra da 24 pozzetti fresco contenente 1 ml DMEM-10% FBS in ciascun pozzetto. Per eseguire BLI, seguire i passaggi 3,6-3,7 sopra. Inoltre, i frammenti possono essere visualizzati con un microscopio a fluorescenza, o scaricate per ottenere la popolazione osseo per le analisi di numero di cellule di cancro al seno e le proprietà come descritto al punto 6. </li><li> Per preparare i frammenti intatti per la valutazione qualitativa al microscopio a fluorescenza seguente BLI, pipetta 5 ml di soluzione di etichettatura bifosfonati fluorescente (preconfrontato secondo le istruzioni del produttore) in ogni pozzetto per etichettare spicole mineralizzati dei frammenti ossei. Incubare la piastra nel tessuto culturale incubatore per un altro 24 hr. </li><li> Dopo 24 ore di cultura in soluzione di etichettatura bifosfonati fluorescente, utilizzare pinze per trasferire i frammenti di piastre di coltura dei tessuti contenenti fenolo mezzo privo di rosso e vista utilizzando un microscopio a fluorescenza configurato per GFP immagine (485 nm) e l&#39;etichetta bifosfonati (680 nm). </li></ol> 5. Misurare la migrazione delle cellule del cancro al seno a frammenti ossei dei tessuti e colto Bone Fragment surnatante <ol><li> La migrazione verso il tessuto osseo cultura surnatante. NOTA: eseguire esperimenti in triplice copia in modo che 3 frammenti di un dato campione THR sono usati per generare 3 surnatanti. Per ogni esperimento, la migrazione è confrontata su tre pozzetti contenenti surnatanti ossee vs tre pozzetti contenenti mezzo di controllo solo. <ol><li> Genera tis ossocitare supernatanti inserendo frammenti ossei nei pozzetti di una piastra a 12 pozzetti contenenti 2.2 ml DMEM-10% FBS per pozzetto. Cultura in un 37 ° C di tessuto cultura incubatore per 24 ore. Estrarre il supporto a 24 ore e sostituirlo con 2,2 ml di fresca DMEM-10% FBS. Pozzetti di controllo Trattare contenenti DMEM-10% FBS allo stesso modo. NOTA: Il terreno è cambiata in 24 ore per rimuovere i fattori secreti in risposta al trauma dei tessuti derivanti da un intervento chirurgico. Perché supernatanti tessuto osseo sono generati in FBS contenenti medie, pozzetti contenenti FBS contenente medio solo sono inclusi per il controllo per i contributi di FBS alla migrazione delle cellule del cancro al seno. </li><li> A 48 ore, raccogliere 0,9 ml di ogni surnatante / mezzo di controllo e pipetta nei pozzetti di una piastra ricevente. Gli inserti saranno poi inseriti in questi pozzi. Incubare la piastra ricevente nel tessuto cultura incubatore mentre semina gli inserti. Nota: Il surnatante rimanente (~ 1 ml dopo evaporazione) possono essere raccolti per l&#39;analisi di secretome factors se desiderato 44. </li><li> Per seminare gli inserti Transwell, metterli in uno standard, di 24 e piastra di coltura tissutale vuoto. Pipettare sospensione cellulare 350 microlitri contenente 1 x 10 5 cellule di carcinoma mammario in DMEM-10% FBS sulla superficie della membrana interna superiore di ciascun inserto come illustrato nella Figura 1A. Posizionare la piastra da 24 pozzetti contenenti gli inserti testa di serie nel 37 ° C di coltura tissutale incubatore per 45 minuti per promuovere l&#39;attaccamento. </li><li> Una volta che le cellule hanno attribuito agli inserti, utilizzare pinze per trasferire gli inserti alla piastra ricevitore secondo le istruzioni del produttore. Angolo ogni inserto quando collocandola nel ricevitore bene per evitare la formazione di bolle tra la membrana di inserimento e il ricevitore ben surnatante. Incubare la piastra ricevitore con inserti per 20 ore a 37 ° C di tessuto cultura incubatore. NOTA: Controllare il lato inferiore della piastra ricevente per bolle tra la membrana inserto e il ricevitore ben supernatant. Se le bolle sono visibili, rimuovere gli inserti specifici e riposizionarli nel ricevitore bene fino a quando non bolle sono presenti. </li><li> Dopo 20 ore di uso pinze per rimuovere gli inserti dalla piastra ricevente. Utilizzando le procedure nei passaggi 3,6-3,7 eseguire BLI all&#39;immagine le cellule che hanno migrato in e allegate al fondo dei pozzetti della piastra del ricevitore. </li></ol></li><li> Migrazione verso frammenti di tessuto osseo. NOTA: eseguire esperimenti in triplice copia in modo che 3 frammenti di un dato campione THR sono posti in 3 inserti separati, e 3 perle di vetro sono posti in 3 inserti indipendenti come controlli. <ol><li> Preparare la piastra ricevente pipettando 0,9 ml DMEM-10% FBS in ogni pozzetto. Inserirlo nel tessuto cultura incubatore durante la preparazione gli inserti. </li><li> Per seminare gli inserti, li invertire sulla superficie di una scatola di provetta per microcentrifuga di plastica che ha un coperchio. Pipettare 50 microlitri sospensione cellulare goccia di DMEM-10% FBS contenente 1 x 10 5 cellule del cancro al seno directly esterna sulla superficie inferiore di ciascuna membrana inserto (che è rivolto verso l&#39;alto sugli inserti invertiti). Coprire la scatola tubo microcentrifuga con il coperchio rotto aperto e le trasferisce al 37 ° C incubatore tessuto per 45 min a promuovere l&#39;adesione delle cellule. </li><li> Trasferire la casella tubo microcentrifuga alla cappa coltura tissutale, e utilizzare pinze per girare le teste di serie inserti lato destro e trasferirli nei pozzetti della piastra ricevente. Pipettare 0.450 ml DMEM-10% FBS in ogni tazza di inserimento. Utilizzando pinze, trasferire un frammento di tessuto osseo (~ 3 mm) in ogni tazza inserto preparato. Facoltativamente, utilizzare perle di vetro come controlli negativi in ​​altri pozzi. Porre la piastra in un tessuto cultura incubatore per 20 ore. </li><li> Per misurare la migrazione, preparare un 24-pozzetti di coltura tissutale standard contenente 1 ml di DMEM-10% FBS per pozzetto. Rimuovere la piastra ricevente dall&#39;incubatore e utilizzare pinze per trasferire i frammenti e le perle di osso da ciascun inserto in pozzetti separati della piastra standard. Aggiungi luciferinasubstrato (per ottenere una concentrazione finale di 300 mg / ml) ad ogni pozzetto ed eseguire BLI utilizzando le procedure descritte in passaggi 3.6-3.7. </li></ol></li></ol> 6. Ulteriori analisi pre e post-sperimentali <ol><li> Analisi di midollo arrossato. <ol><li> Trasferire un frammento osseo in una cella di filtro 70 micron posto alla sommità di una provetta conica da 50 ml. Utilizzare una siringa da 10 ml con un ago 25 G per irrigare energicamente il frammento con 10 ml di PBS per ottenere una sospensione di cellule di midollo nel tubo conico. Centrifugare la sospensione cellulare per 3 minuti a 300 xg e 21 ° C, aspirare il surnatante e risospendere le cellule pellet in PBS o altra soluzione desiderata per citometria a flusso. NOTA: volumi di risospensione variano a seconda delle dimensioni del pellet cellulare dopo centrifugazione, e l&#39;applicazione. </li><li> Per i saggi di vitalità ~ 75-300 volumi microlitri di PBS sono appropriate, e queste sospensioni possono essere analizzati utilizzando disponibili in commercio fluorescence saggi di vitalità basate secondo le istruzioni del fabbricante, pipettati in un emocitometro convenzionali, e contate con un microscopio a fluorescenza invertito. </li><li> Per l&#39;analisi citometrica di flusso o ordinamento base al rilevamento di cellule di carcinoma mammario GFP-positive, risospendere il pellet di cellule in 1 ml di PBS contenente 2% FBS, 2 mM EDTA e 10 mM HEPES tale che la concentrazione è di 1 x 10 6 cellule / ml. </li></ol></li><li> H &amp; E colorazione ed immunoistochimica. <ol><li> Per elaborare i frammenti di ematossilina e eosina (H &amp; E) colorazione e / o immunoistochimica, posizionare i frammenti in cassette di plastica etichettati con una matita numero 2, e immergere in un contenitore riempito con il 10% formalina per 24 ore. </li><li> Tessuti di processo per paraffina, sezionamento e colorazione utilizzando protocolli di routine che includono una fase di decalcificazione per spiegare le spicole mineralizzate all&#39;interno di ogni frammento. </li></ol></li></ol>

No disclosures to report.

Mehra et al. Hanno descritto in precedenza la raccolta e l&#39;analisi di campioni ossei postmortem di pazienti affetti da carcinoma prostatico metastatico raccolte al momento dell&#39;autopsia, rivelando i tessuti di alta qualità e per validare l&#39;uso di campioni di ossa umane per studiare il processo metastatico 47. Qui abbiamo descritto i protocolli per la raccolta, l&#39;elaborazione e l&#39;utilizzo di frammenti di tessuto osseo umano ottenuti da teste femorali scartati dopo l&#39;intervento...

Il microambiente tumorale è ampiamente riconosciuto come un fattore determinante del comportamento delle cellule di cancro durante la progressione del cancro al seno e metastasi diffuse 1-3. L&#39;obiettivo del metodo presentato qui è quello di facilitare lo studio delle cellule del cancro al seno nel microambiente del tessuto osseo umano, la sede più frequente di cancro al seno metastasi 4-6. Bone comprende mineralizzati e midollo compartimenti 7-9, entrambe ospitano cellule e fattori secreti implicati nella progressione metastatica 10,11. Benché ampiamente utilizzato in modelli di topo vivo facilitare studi sistemici del processo metastatico 12-15, interazioni delle cellule all&#39;interno dello scheletro non sono facilmente accessibili per l&#39;osservazione e la perturbazione diretta. Sistemi modello per lo studio e la coltura dei tessuti osseo di topo e cellule del mouse midollo forniscono un migliore accesso e hanno prodotto molte intuizioni per quanto riguarda le interferenze ei meccanismi alla base delle cellule del cancro al seno metastasis dello scheletro murino 16-22. Tuttavia, gli studi hanno suggerito che ci possono essere specie-specifiche modelli di osteotropism per il tessuto osseo 23,24. Questi modelli potrebbero riflettere specie-specifiche intrinseche differenze nelle proprietà del tessuto osseo, differenze derivanti dalla alterati popolazioni di midollo osseo in topi con deficit immunitario 11, e / o la relativamente giovane età di topi utilizzati in esperimenti, che sono tutti probabili determinanti dell&#39;osso microambiente. In vitro approcci per studiare le cellule del cancro al seno in co-colture di ossa umane sono in genere concentrati su specifici tipi di cellule di osso, come osteoblasti derivate dal midollo o cellule stromali in coltura come monostrato oa ingegnerizzati sistemi modello 3-dimensionale 25-35. Sebbene i modelli di coltura cellulare a 2 dimensioni hanno costituito la colonna portante di in vitro approcci per la ricerca sul cancro, si è da tempo riconosciuto che il comportamento delle cellule è fondamentalmente alterata in monolayer sistemi di coltura 18,36,37. Questo ha portato allo sviluppo di microambienti ingegnerizzati che imitano la complessità dei tessuti viventi 3-dimensionali, compresi da matrice e modelli basati scaffold composti di materiali naturali quali collagene, polimeri sintetici o seminate con specifici tipi cellulari per creare microambienti tessuto-like 36-41. Approcci di ingegneria hanno incluso anche l&#39;uso di piattaforme bioreattore per controllare e studiare il milieu ormonale del microambiente 18,19,41-43. Sebbene i modelli biomimetici e bioreattori forniscono molti elementi di un microambiente tissutale complesso in un ambiente controllato, e sono state applicate con successo per promuovere lo studio delle metastasi del cancro al seno alle ossa 18,19,35,42,43, sistemi modello ingegnerizzati genere non incorporano l&#39;intera gamma di tipi di cellule e componenti della matrice extracellulare presenti all&#39;interno dell&#39;ambiente osso nativo. Fino a poco tempo, il cancro al senocellule non sono stati studiati nel nativa, intatta, microambiente 3-dimensionale del tessuto osseo umano. Recentemente abbiamo segnalato lo sviluppo di un modello di co-coltura con frammenti di tessuto osseo umano isolato da protesi totale d&#39;anca (THR) Chirurgia campioni 44. Questi esemplari porto sia i comparti mineralizzate e midollo necessarie per studiare i meccanismi alla base di micro-metastasi in coltura breve termine. In lavori precedenti abbiamo stabilito prova di principio per l&#39;utilizzo di bioluminescenza (BLI) per monitorare la proliferazione delle cellule del cancro al seno-luciferasi che esprimono (MDA-MB-231-Fluc) co-coltura con frammenti di ossa 44. Qui vi presentiamo dettagliate protocolli sperimentali per lo studio la proliferazione delle cellule del cancro al seno, la colonizzazione, e la migrazione nel contesto del microambiente nativo utilizzando espianti di tessuto osseo umano. Innanzitutto vi presentiamo un protocollo per la co-coltura di cellule di cancro al seno adiacenti frammenti ossei per misurare senoproliferazione cellulare utilizzando BLI. In questa sezione, sospensioni di cellule vengono seminate al seno come macchie di cellule in piastre da 6 pozzetti adiacenti frammenti ossei, che sono immobilizzati da pezzi di cera ossea. Pozzetti di controllo contengono cera ossea, ma nessun frammento osseo. Una volta che i punti di cellule attaccano, si aggiunge medio e il piatto è in coltura per 24 ore, dopo di che l&#39;intensità del segnale bioluminescente (associato al numero di cellulare) viene misurata con BLI. Nella fase successiva vi presentiamo i metodi per le cellule del cancro al seno co-coltura seminati direttamente su frammenti di ossa di studiare la colonizzazione e la proliferazione. Qui le sospensioni cellulari seno sono pipettati direttamente sui frammenti di tessuto osseo, che sono monitorati nella cultura da BLI e microscopia a fluorescenza nel tempo per monitorare la colonizzazione e il numero di cellulare. In questo metodo, il vano osseo può essere lavato dai frammenti ossei in qualsiasi punto di tempo per l&#39;analisi di cellule di carcinoma mammario colonizzati mediante citometria di flusso, o saggi di vitalità osseo. Inoltre, Describa due diversi approcci per misurare la migrazione delle cellule del cancro al seno. Nel primo metodo passaggi vengono descritti per misurare la migrazione verso tessuto osseo supernatanti di coltura. In questo protocollo le cellule tumorali del seno vengono seminate sulle interni, superfici superiori di Transwell inseriscono membrane con un 8 micron dimensione dei pori (come mostrato nella Figura 1A). Gli inserti vengono poi poste in un piatto ricevitore con pozzetti contenenti surnatante tessuto osseo o mezzo di controllo. Nel corso di un periodo di incubazione di 20 ore, un piccolo numero di cellule di carcinoma mammario migrano attraverso le membrane inserto giù nei pozzetti inferiori tessuto coltura dove attaccano alla rivelazione per BLI. Nel secondo metodo di migrazione delle cellule tumorali del seno vengono seminate sulle superfici esterne inferiori delle membrane inserti Transwell. Frammenti di tessuto osseo vengono inseriti nelle tazze di inserimento e le cellule di carcinoma mammario migrano attraverso le membrane a colonizzare i frammenti ossei (come mostrato nella Figura 1B), chevengono poi ripreso con BLI.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM (1X) + GlutaMAX-l</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10569-010</td>
			<td>Supplement all DMEM with 10% fetal bovine serum and 1% Pen/Strep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McCoy&#39;s 5A Medium (1X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16600-082</td>
			<td>Supplement all McCoy&#39;s&#160; with 10% fetal bovine serum and 1% Pen/Strep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillen Streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blastocidin (10 mgl/ml)</td>
			<td>InvivoGen&#160;</td>
			<td>ant-bl</td>
			<td>Supplement media used for transfected cell lines.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon&#174; Cell Culture Inserts for 24 Well Plate with Transparent PET Membrane (8.0 &#956;m pore size)</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>353097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon&#174; 24 Well TC-Treated Polystyrene Cell Culture Insert Companion Plate</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>353504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit *for mammalian cells*</td>
			<td>Invitrogen Detection Technologies</td>
			<td>L-3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroBrite DMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A18967-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-luciferin firefly, potassium salt 5 grams (30 mg/mL)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L-8220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Cell Strainer 70 &#956;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 Well TC-Treated Cell Culture Cluster</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 Well TC-Treated Cell Culture Cluster</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 Well TC-Treated Cell Culture Cluster</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Friedman-Pearson Rongeur</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>16021-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone wax</td>
			<td>Surgical Specialties Corporation</td>
			<td>903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS 50 Imaging Platform</td>
			<td>Caliper Life Sciences/PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Image Software Program&#160;</td>
			<td>Caliper Life Sciences/PerkinElmer</td>
			<td>133026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FL Imaging System</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Version 4.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OsteoSense 680 EX</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NEV10020EX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCF-7 breast cancer cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231 breast cancer cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse anti-human cytokeratin antibody</td>
			<td>DAKO Cytomation</td>
			<td>Clone (AE1/AE3)</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods for culturing human femur tissue explants to study breast cancer cell colonization of the metastatic niche

Bone è la sede più comune di metastasi del cancro al seno. Anche se è ampiamente accettato che il comportamento delle cellule di cancro influenze microambiente, poco si sa circa le proprietà delle cellule del cancro al seno e comportamenti all&#39;interno del microambiente nativo del tessuto osseo umano. Abbiamo sviluppato approcci per monitorare, quantificare e modulare le cellule del cancro al seno umano nel microambiente di frammenti umani in coltura di tessuto osseo isolati da teste femorali scartati seguenti totali interventi chirurgici di sostituzione dell&#39;anca. Usando le cellule del cancro al seno ingegnerizzate per luciferasi e migliorate proteina fluorescente verde (EGFP) espressione, siamo in grado di quantificare in modo riproducibile di migrazione e proliferazione modelli che utilizzano l&#39;imaging bioluminescenza (BLI), interazioni cellulari pista entro i frammenti ossei mediante microscopia a fluorescenza, e valutare le cellule del seno dopo colonizzazione con citometria a flusso. I vantaggi principali di questo modello sono: 1) un nativo, MicroE tessuto architettonico intattonvironment che include importanti tipi di cellule umane, e 2) l&#39;accesso diretto al microambiente, che facilita la rapida quantitativa e monitoraggio qualitativo e perturbazione del seno e delle cellule delle ossa proprietà, comportamenti e interazioni. Una limitazione primaria, attualmente, è finita la vitalità dei frammenti di tessuto, che delimita la finestra di studio per coltura breve termine. Applicazioni del sistema modello comprendono lo studio della biologia di base di cancro al seno e di altri tumori maligni ossa cerca all&#39;interno della nicchia metastatica, e lo sviluppo di strategie terapeutiche per indirizzare in modo efficace le cellule del cancro al seno nei tessuti ossei.

Isolare frammenti di tessuto da femorali Heads Teste femorali sono stati raccolti da un numero uguale di pazienti di sesso femminile (44-90 anni di età) sottoposti a chirurgia elettiva di sostituzione totale dell&#39;anca presso il Dipartimento di Chirurgia Ortopedica presso la Facoltà di Medicina dell&#39;Università di Stanford maschile e. Ogni testa femorale scartato contiene una piccola porzione del femore, che porti tessuto osseo trabecolare composto spicole mineralizzati e osseo. Que...

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Methods for Culturing Human Femur Tissue Explants to Study Breast Cancer Cell Colonization of the Metastatic Niche

I protocolli sono descritti per studiare la migrazione delle cellule del cancro al seno, la proliferazione e la colonizzazione in un tessuto osseo sistema modello espianto umana.

Metodi per la coltura di femore umano espianti di tessuto di studio sul carcinoma della mammella cellulare colonizzazione della nicchia metastatico

Bone is the most common site of breast cancer metastasis. Although it is widely accepted that the microenvironment influences cancer cell behavior, little ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

12.4K Views.  Stanford University School of Medicine.  I protocolli sono descritti per studiare la migrazione delle cellule del cancro al seno, la proliferazione e la colonizzazione in un tessuto osseo sistema modello espianto umana. 

Video: Methods for Culturing Human Femur Tissue Explants to Study Breast Cancer Cell Colonization of the Metastatic Niche

Method for Novel Anti-Cancer Drug Development using Tumor Explants of Surgical Specimens

The current therapies for malignant glioma have only palliative effect. For therapeutic development, one hurdle is the discrepancy of efficacy determined by current drug efficacy tests and the efficacy on patients. Thus, novel and reliable methods for evaluating drug efficacy are warranted in pre-clinical phase. In vitro culture of tumor tissues, including cell lines, has substantial phenotypic, genetic, and epigenetic alterations of cancer cells caused by artificial environment of cell culture, which may not reflect the biology of original tumors in situ. Xenograft models with the immunodeficient mice also have limitations, i.e., the lack of immune system and interspecies genetic and epigenetic discrepancies in microenvironment. Here, we demonstrate a novel method using the surgical specimens of malignant glioma as undissociated tumor blocks to evaluate treatment effects. To validate this method, data with the current first-line chemotherapeutic agent, temozolomide (TMZ), are described.


We used the freshly-removed surgical specimen of malignant glioma for our experiments. We performed intratumoral injection of TMZ or other drug candidates, followed by incubation and analysis on surgical specimens. Here, we sought to establish a tumor tissue explant method as a platform to determine the efficacy of novel anti-cancer therapies so that we may be able to overcome, at least, some of the current limitations and fill the existing gap between the current experimental data and the efficacy on an actual patient's tumor. This method may have the potential to accelerate identifying novel chemotherapeutic agents for solid cancer treatment.

Here, we established a method for drug efficacy testing with surgical specimens of brain tumors, termed &#x201C;tumor explant method&#x201D;. With this method, we can evaluate drug efficacy without breaking the microenvironment of solid tumors. To validate reliability of this method, we describe representative data with our glioma specimen treated with the current first-line chemotherapeutic agent, temozolomide.

Metodo per Novel Anti-Cancer Drug Development utilizzando Espianti Tumore di campioni chirurgici


The current therapies for malignant glioma have only palliative effect. For therapeutic development, one hurdle is the discrepancy of efficacy determined ...

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An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent until many years after removal of the primary tumor and adjuvant therapy. A likely explanation of this phenomenon is that tumor cells have seeded metastatic sites, are resistant to conventional therapies, and remain dormant for long periods of time 1-4.
The existence of dormant cancer cells at secondary sites has been described previously as quiescent solitary cells that neither proliferate nor undergo apoptosis 5-7. Moreover, these solitary cells has been shown to disseminate from the primary tumor at an early stage of disease progression 8-10 and reside growth-arrested in the patients' bone marrow, blood and lymph nodes 1,4,11. Therefore, understanding mechanisms that regulate dormancy or the switch to a proliferative state is critical for discovering novel targets and interventions to prevent disease recurrence. However, unraveling the mechanisms regulating the switch from tumor dormancy to metastatic growth has been hampered by the lack of available model systems.
in vivo and ex vivo model systems to study metastatic progression of tumor cells have been described previously 1,12-14. However these model systems have not provided in real time and in a high throughput manner mechanistic insights into what triggers the emergence of solitary dormant tumor cells to proliferate as metastatic disease. We have recently developed a 3D in vitro system to model the in vivo growth characteristics of cells that exhibit either dormant (D2.OR, MCF7, K7M2-AS.46) or proliferative (D2A1, MDA-MB-231, K7M2) metastatic behavior in vivo . We demonstrated that tumor cells that exhibit dormancy in vivo at a metastatic site remain quiescent when cultured in a 3-dimension (3D) basement membrane extract (BME), whereas cells highly metastatic in vivo readily proliferate in 3D culture after variable, but relatively short periods of quiescence. Importantly by utilizing the 3D in vitro model system we demonstrated for the first time that the ECM composition plays an important role in regulating whether dormant tumor cells will switch to a proliferative state and have confirmed this in in vivo studies15-17. Hence, the model system described in this report provides an in vitro method to model tumor dormancy and study the transition to proliferative growth induced by the microenvironment.

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

A modified 3-D in vitro system is presented in which growth characteristics of several tumor cell lines in reconstituted basement membrane correlate with the dormant or proliferative behavior of the tumor cells at a metastatic secondary site in vivo.

Un In Vitro Sistema per studio dormienza tumorale e l&#39;interruttore di crescita metastatica

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent ...

Human Neuroendocrine Tumor Cell Lines as a Three-Dimensional Model for the Study of Human Neuroendocrine Tumor Therapy

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human malignancies.1 Other than surgery for the minority of patients who present with localized disease, there is little or no survival benefit of systemic therapy. Therefore, there is a great need to better understand the biology of NETs, and in particular define new therapeutic targets for patients with nonresectable or metastatic neuroendocrine tumors. 3D cell culture is becoming a popular method for drug screening due to its relevance in modeling the in vivo tumor tissue organization and microenvironment.2,3 The 3D multicellular spheroids could provide valuable information in a more timely and less expensive manner than directly proceeding from 2D cell culture experiments to animal (murine) models.
To facilitate the discovery of new therapeutics for NET patients, we have developed an in vitro 3D multicellular spheroids model using the human NET cell lines. The NET cells are plated in a non-adhesive agarose-coated 24-well plate and incubated under physiological conditions (5% CO2, 37 &deg;C) with a very slow agitation for 16-24 hr after plating. The cells form multicellular spheroids starting on the 3rd or 4th day. The spheroids become more spherical by the 6th day, at which point the drug treatments are initiated. The efficacy of the drug treatments on the NET spheroids is monitored based on the morphology, shape and size of the spheroids with a phase-contrast light microscope. The size of the spheroids is estimated automatically using a custom-developed MATLAB program based on an active contour algorithm. Further, we demonstrate a simple method to process the HistoGel embedding on these 3D spheroids, allowing the use of standard histological and immunohistochemical techniques. 
This is the first report on generating 3D spheroids using NET cell lines to examine the effect of therapeutic drugs. We have also performed histology on these 3D spheroids, and displayed an example of a single drug's effect on growth and proliferation of the NET spheroids. Our results support that the NET spheroids are valuable for further studies of NET biology and drug development.

We present a simple agarose overlay platform to grow 3D multicellular spheroids using neuroendocrine cancer cell lines. This method provides a very convenient way to examine the effect of therapeutic drugs on the neuroendocrine tumor cells. It could also help us establish human neuroendocrine tumor spheroids for cancer therapy.

Neuroendocrini umani cella linee tumorali come un modello tridimensionale per lo studio dei diritti dell&#39;uomo e terapia dei tumori neuroendocrini

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human ...

The Use of Reverse Phase Protein Arrays (RPPA) to Explore Protein Expression Variation within Individual Renal Cell Cancers

Currently there is no curative treatment for metastatic clear cell renal cell cancer, the commonest variant of the disease. A key factor in this treatment resistance is thought to be the molecular complexity of the disease 1. Targeted therapy such as the tyrosine kinase inhibitor (TKI)-sunitinib have been utilized, but only 40% of patients will respond, with the overwhelming majority of these patients relapsing within 1 year 2. As such the question of intrinsic and acquired resistance in renal cell cancer patients is highly relevant 3.
In order to study resistance to TKIs, with the ultimate goal of developing effective, personalized treatments, sequential tissue after a specific period of targeted therapy is required, an approach which had proved successful in chronic myeloid leukaemia 4. However the application of such a strategy in renal cell carcinoma is complicated by the high level of both inter- and intratumoral heterogeneity, which is a feature of renal cell carcinoma5,6 as well as other solid tumors 7. Intertumoral heterogeneity due to transcriptomic and genetic differences is well established even in patients with similar presentation, stage and grade of tumor. In addition it is clear that there is great morphological (intratumoral) heterogeneity in RCC, which is likely to represent even greater molecular heterogeneity. Detailed mapping and categorization of RCC tumors by combined morphological analysis and Fuhrman grading allows the selection of representative areas for proteomic analysis.
Protein based analysis of RCC8 is attractive due to its widespread availability in pathology laboratories; however, its application can be problematic due to the limited availability of specific antibodies 9. Due to the dot blot nature of the Reverse Phase Protein Arrays (RPPA), antibody specificity must be pre-validated; as such strict quality control of antibodies used is of paramount importance. Despite this limitation the dot blot format does allow assay miniaturization, allowing for the printing of hundreds of samples onto a single nitrocellulose slide. Printed slides can then be analyzed in a similar fashion to Western analysis with the use of target specific primary antibodies and fluorescently labelled secondary antibodies, allowing for multiplexing. Differential protein expression across all the samples on a slide can then be analyzed simultaneously by comparing the relative level of fluorescence in a more cost-effective and high-throughput manner.

The Use of Reverse Phase Protein Arrays RPPA to Explore Protein Expression Variation within Individual Renal Cell Cancers

RPPA enables the protein expression of hundreds of samples, printed on nitrocellulose slides to be interrogated simultaneously, using fluorescently labelled antibodies. This technique has been applied to study the effect of drug treatment heterogeneity within clear cell renal carcinoma.

L&#39;uso di matrici inverse proteina di fase (RPPA) per esplorare Espressione Variazione proteine ​​all&#39;interno dei singoli tumori a cellule renali

Currently there is no curative treatment for metastatic clear cell renal cell cancer, the commonest variant of the disease. A key factor in this treatment ...

Initiation of Metastatic Breast Carcinoma by Targeting of the Ductal Epithelium with Adenovirus-Cre: A Novel Transgenic Mouse Model of Breast Cancer

Breast cancer is a heterogeneous disease involving complex cellular interactions between the developing tumor and immune system, eventually resulting in exponential tumor growth and metastasis to distal tissues and the collapse of anti-tumor immunity. Many useful animal models exist to study breast cancer, but none completely recapitulate the disease progression that occurs in humans. In order to gain a better understanding of the cellular interactions that result in the formation of latent metastasis and decreased survival, we have generated an inducible transgenic mouse model of YFP-expressing ductal carcinoma that develops after sexual maturity in immune-competent mice and is driven by consistent, endocrine-independent oncogene expression. Activation of YFP, ablation of p53, and expression of an oncogenic form of K-ras was achieved by the delivery of an adenovirus expressing Cre-recombinase into the mammary duct of sexually mature, virgin female mice. Tumors begin to appear 6 weeks after the initiation of oncogenic events. After tumors become apparent, they progress slowly for approximately two weeks before they begin to grow exponentially. After 7-8 weeks post-adenovirus injection, vasculature is observed connecting the tumor mass to distal lymph nodes, with eventual lymphovascular invasion of YFP+ tumor cells to the distal axillary lymph nodes. Infiltrating leukocyte populations are similar to those found in human breast carcinomas, including the presence of &#945;&#946; and &#947;&#948; T cells, macrophages and MDSCs. This unique model will facilitate the study of cellular and immunological mechanisms involved in latent metastasis and dormancy in addition to being useful for designing novel immunotherapeutic interventions to treat invasive breast cancer.

Activation of latent mutations with adenovirus-Cre into the mammary ductal system results in a clinically relevant metastatic breast cancer. Incorporation of a YFP promoter allows tracking of distal metastatic tumor cells. This model is useful to study latent metastasis, anti-tumor immunity, and for designing novel immunotherapies to treat breast cancer.

Avvio del carcinoma metastatico della mammella dalla Targeting del duttale con Adenovirus-Cre: A Novel modello di topo transgenico di cancro al seno

Breast cancer is a heterogeneous disease involving complex cellular interactions between the developing tumor and immune system, eventually resulting in ...

Profiling of Estrogen-regulated MicroRNAs in Breast Cancer Cells

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen receptors (ERs), ER&#945;, and ER&#946;. ER&#945; is frequently upregulated in breast cancer and drives the proliferation of breast cancer cells. The ERs function as transcription factors and regulate gene expression. Whereas ER&#945;&#39;s regulation of protein-coding genes is well established, its regulation of noncoding microRNA (miRNA) is less explored. miRNAs play a major role in the post-transcriptional regulation of genes, inhibiting their translation or degrading their mRNA. miRNAs can function as oncogenes or tumor suppressors&#160;and are also promising biomarkers. Among the miRNA assays available, microarray and quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR) have been extensively used to detect and quantify miRNA levels. To identify miRNAs regulated by estrogen signaling in breast cancer, their expression in ER&#945;-positive breast cancer cell lines were compared before and after estrogen-activation using both the &#181;Paraflo-microfluidic microarrays and Dual Labeled Probes-low density arrays. Results were validated using specific qPCR assays, applying both Cyanine dye-based and Dual Labeled Probes-based chemistry. Furthermore, a time-point assay was used to identify regulations over time. Advantages of the miRNA assay approach used in this study is that it enables a fast screening of mature miRNA regulations in numerous samples, even with limited sample amounts. The layout, including the specific conditions for cell culture and estrogen treatment, biological and technical replicates, and large-scale screening followed by in-depth confirmations using separate techniques, ensures a robust detection of miRNA regulations,&#160;and eliminates false positives and other artifacts. However, mutated or unknown miRNAs, or regulations at the primary and precursor transcript level, will not be detected. The method presented here represents a thorough investigation of estrogen-mediated miRNA regulation.

Molecular signaling through both estrogen and microRNAs are critical in breast cancer development and growth. Estrogen activates the estrogen receptors, which are transcription factors. Many transcription factors can regulate the expression of microRNAs, and estrogen-regulated microRNAs can be profiled using different large-scale techniques.

Profiling di microRNA regolati dagli estrogeni in cellule di carcinoma mammario

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen ...

Three Dimensional Cultures: A Tool To Study Normal Acinar Architecture vs. Malignant Transformation Of Breast Cells

Invasive breast carcinomas are a group of malignant epithelial tumors characterized by the invasion of adjacent tissues and propensity to metastasize. The interplay of signals between cancer cells and their microenvironment exerts a powerful influence on breast cancer growth and biological behavior1. However, most of these signals from the extracellular matrix are lost or their relevance is understudied when cells are grown in two dimensional culture (2D) as a monolayer. In recent years, three dimensional (3D) culture on a reconstituted basement membrane has emerged as a method of choice to recapitulate the tissue architecture of benign and malignant breast cells. Cells grown in 3D retain the important cues from the extracellular matrix and provide a physiologically relevant ex&#160;vivo system2,3. Of note, there is growing evidence suggesting that cells behave differently when grown in 3D as compared to 2D4. 3D culture can be effectively used as a means to differentiate the malignant phenotype from the benign breast phenotype and for underpinning the cellular and molecular signaling involved3. One of the distinguishing characteristics of benign epithelial cells is that they are polarized so that the apical cytoplasm is towards the lumen and the basal cytoplasm rests on the basement membrane. This apico-basal polarity is lost in invasive breast carcinomas, which are characterized by cellular disorganization and formation of anastomosing and branching tubules that haphazardly infiltrates the surrounding stroma. These histopathological differences between benign gland and invasive carcinoma can be reproduced in 3D6,7. Using the appropriate read-outs like the quantitation of single round acinar structures, or differential expression of validated molecular markers for cell proliferation, polarity and apoptosis in combination with other molecular and cell biology techniques, 3D culture can provide an important tool to better understand the cellular changes during malignant transformation and for delineating the responsible signaling.

Three dimensional culture of mammary epithelial cells on a reconstituted basement membrane is a useful method to recapitulate the in vivo architecture of the benign breast, and to differentiate the malignant phenotype from the benign breast phenotype. Importantly, this system can be applied to study invasive carcinomas in other tissues.

Tre Culture dimensionali: strumento per studiare normale acinose Architettura vs trasformazione maligna delle cellule mammarie

Invasive breast carcinomas are a group of malignant epithelial tumors characterized by the invasion of adjacent tissues and propensity to metastasize. The ...

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mammary Fat Pad of Mice to Study Tumor Growth.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the functions of proteins involved in oncogenic progression or help to discover new tumor suppressors. In addition, injecting cancer cells into mice with different genotypes might provide a better understanding of the importance of the stromal compartment. Many models may be useful to investigate certain aspects of disease progression but do not recapitulate the entire cancerous process. In contrast, breast cancer cells engraftment to the mammary fat pad of mice better recapitulates the location of the disease and presence of the proper stromal compartment and therefore better mimics human cancerous disease. In this article, we describe how to implant breast cancer cells into mice orthotopically and explain how to collect tissues to analyse the tumor milieu and metastasis to distant organs. Using this model, many aspects (growth, angiogenesis, and metastasis) of cancer can be investigated simply by providing a proper environment for tumor cells to grow.

Cancer is a complex disease that is influenced by the tissue surrounding the tumor as well as local pro- and anti-inflammatory mediators. Therefore, orthotropic injection models, rather than subcutaneous models may be useful to study cancer progression in a manner that better mimics human pathology.

Iniezione ortotopico di cellule di carcinoma mammario nel mammaria Fat Pad di Mice per studiare la crescita del tumore.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the ...

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial cells tend to lose hormone receptor expression. Widely used hormone receptor positive breast cancer cell lines are of limited relevance to the in vivo situation. Here, we describe an ex vivo model to study hormone action in the human breast. Fresh human breast tissue specimens from surgical discard material such as reduction mammoplasties or mammectomies are mechanically and enzymatically digested to obtain tissue fragments containing ducts and lobules and multiple stromal cell types. These tissue microstructures kept in basal medium without growth factors preserve their intercellular contacts, the tissue architecture, and remain hormone responsive for several days. They are readily processed for RNA and protein extraction, histological analysis or stored in freezing medium. Fluorescence activated cell sorting (FACS) can be used to enrich for specific cell populations. This protocol provides a straightforward, standard approach for translational studies with highly complex, varied human specimens.

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

We have developed a novel ex vivo model to study hormone action in the human breast. It is based on tissue microstructures isolated from surgical breast tissue specimens which preserve tissue architecture, intercellular interactions, and paracrine signaling.

Un<em&gt; Ex vivo</em&gt; Modello per studiare Hormone azione in seno umano

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...

Mammosphere Formation Assay from Human Breast Cancer Tissues and Cell Lines

Similar to healthy tissues, many blood and solid malignancies are now thought to be organised hierarchically, with a subset of stem-like cancer cells that self-renew while giving rise to more differentiated progeny. Understanding and targeting these cancer stem cells in breast cancer, which may possess enhanced chemo- and radio-resistance compared to the non-stem tumor bulk, has become an important research area. Markers including CD44, CD24, and ALDH activity can be assessed using fluorescence activated cell sorting (FACS) to prospectively isolate cells that display enhanced tumorigenicity when implanted into immunocompromised mice: the mammosphere assay has also become widely used for its ability to retrospectively identify sphere-forming cells that develop from single stem cell-like clones. Here we outline approaches for the appropriate culturing of mammospheres from cell lines or primary patient samples, their passaging, and calculations to estimate sphere forming efficiency (SFE). First we discuss key considerations and pitfalls in the appropriate planning and interpretation of mammosphere experiments.

Floating mammosphere assays can investigate the subset of stem-like breast cancer cells that survive in suspension conditions and show enhanced tumorigenesis when implanted into mice. This protocol provides a convenient in vitro measure of sphere-forming ability, a proxy for in vivo tumorigenesis, while facilitating analysis of the stem-associated transcriptional landscape.

Mammosphere saggio Formazione di Human Breast Cancer tessuti e linee cellulari

Similar to healthy tissues, many blood and solid malignancies are now thought to be organised hierarchically, with a subset of stem-like cancer cells that ...