La tecnica chirurgica è stata originariamente acquisite nel laboratorio del Dr. William D. Hill presso il Medical College of Georgia. Gli autori desiderano inoltre ringraziare il dottor David A. Rempe e Landa Prifti per l&#39;utilizzo della fotocamera dissezione. Questa ricerca è stata sostenuta da NIH NS041744, NS051279, F31 NS064700 e AHA 30815697D.

Questo protocollo è stato approvato dalla Università di Rochester comitato dedicato l&#39;uso etico degli animali nella ricerca (UCAR). Tecniche asettiche da seguire durante il protocollo. L&#39;utilizzo di guanti sterili e una maschera è necessario. Tutte le attrezzature, materiali, prodotti chimici, e gli strumenti che vengono utilizzati durante il protocollo sono descritte nella tabella 1. 1. La preparazione pre-chirurgica <ol><li> Iniettare topi per via sottocutanea con buprenorfina (0.05mg/kg) 2 h prima dell&#39;intervento, subito dopo l&#39;intervento chirurgico e poi ogni 3-5 ore durante le prime 24 ore post-operatorio. </li><li> Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici, spugne garza, e applicatori punta del cotone in autoclave. Mantenere gli strumenti chirurgici in etanolo al 70% durante l&#39;intervento chirurgico e aria secca a destra garza sterile prima dell&#39;uso. Spruzzare l&#39;area di lavoro con il 70% di etanolo. </li><li> Anestetizzare il mouse con un 3% isofluorane-20% miscela di ossigeno del gas utilizzando un vaporizzatore anestetico. Regolare la quantità di ossigeno con il misuratore di portata. Testare il livello di anestesia da dito o pizzicare la coda (che dovrebbero essere non risponde). Mantenere il livello di anestesia con il 2% (v / v) isofluorane. </li><li> Applicare lacrime artificiali per gli occhi del mouse e usare cautela per evitare di danneggiare l&#39;occhio durante la procedura chirurgica. Posizionare il mouse sul lato destro in posizione laterale. </li><li> Radere l&#39;area sul lato sinistro tra l&#39;occhio sinistro e la base dell&#39;orecchio sinistro con il tagliaunghie animale. Pulire l&#39;area alternando tra una soluzione betadine e il 70% di etanolo con applicatori punta di cotone e strofinare leggermente la zona. Ripetere se necessario. </li><li> Posizionare il mouse su di una piastra elettrica collegato ad una sonda rettale per mantenere la temperatura corporea a 37 ° C. Inserire la sonda rettale utilizzando olio minerale. </li><li> Posizionare il mouse sul lato destro sotto il microscopio e fissare con nastro adesivo. Tagliare una finestra in una garza e coprire un&#39;area chirurgica. </li></ol> 2. Procedura chirurgica e MCA Ligation <ol><li> Fai una incisione verticale tra l&#39;occhio sinistro e la base dell&#39;orecchio sinistro utilizzando bene le forbici diritte. Usa hemostats curva per mantenere l&#39;area chirurgica aperta. </li><li> Effettuare una incisione orizzontale sul muscolo temporale utilizzando le forbici a molla e un po &#39;separare il muscolo temporale dal cranio lentamente tirando con una pinza. </li><li> Fai una piccola craniotomia subtemporal all&#39;incrocio tra zigomatica e ossa squammoso utilizzando un ago da 18G mentre si tiene la mandibola con una pinza curva. </li><li> Esporre il MCA rimuovendo il piccoli pezzi di cranio con Rongeurs osso. Dell&#39;arcata zigomatica e contenuti orbitale non deve essere danneggiato durante questo processo. Se l&#39;essiccamento eccessivo di tessuto si verifica durante questo processo, si applicano PBS sterile con applicatori punta di cotone. </li><li> Legare la porzione distale del MCA cauterizer utilizzando un piccolo vaso. </li><li> Posizionare il muscolo temporale nella sua posizione originale e chiudere il sito di incisione chirurgica con 5-0 punti di sutura in nylon. </li><li> Interrompere l&#39;anestesia e rimuovere la sonda rettale. Iniettare il mouse con una dose 2 di buprenorfina (0.05mg/kg) per via sottocutanea. Ritorna il mouse per la gabbia che è stata mantenuta a 37 ° C con un pannello di riscaldamento. </li><li> Seguire da vicino il mouse per le prossime 24 ore per ogni disagio (riduzione dell&#39;appetito / consumo di acqua, la postura ingobbita, aumento della respirazione, pilo-eretto capelli). Iniettare il mouse con buprenorfina per via sottocutanea ogni 3-5 ore dopo l&#39;intervento fino a 24 ore. Fornire il mouse con gel di recupero durante questo periodo. </li></ol> 3. TTC colorazione e Determinazione della gittata sistolica <ol><li> Ventiquattro ore dopo l&#39;intervento profondamente anestetizzare il mouse, transcardially profumato il mouse con un 4% TTC (w / v) in tampone fosfato (PBS) per 15 min e poi con una soluzione di paraformaldeide al 4% per 10 minuti utilizzando un mini pompa peristaltica a portata media. Togliere il cervello e posizionarlo nella soluzione di paraformaldeide al 4% durante la notte. </li><li> Posizionare il cervello nel blocco di sezionamento. Tagliate a fette il cervello 1 mm di spessore utilizzando lame di rasoio. </li><li> Mettere le fette accanto ad un righello scala millimetrata. Fotografare le fette utilizzando una fotocamera digitale collegata al microscopio da dissezione. </li><li> Calcolare l&#39;area colpo sottraendo il non-infartuato area del sito ipsilaterale dalla superficie totale del sito controlaterale utilizzando immagini J Software (http://rsbweb.nih.gov/ij/). Calcolare la gittata sistolica sovrapponendo l&#39;area colpo di fette di 22. </li></ol> 4. Indicazioni per l&#39;uso J software Image <ol><li> Aprire il file immagine da analizzare in software Image J cliccando sul menu File. </li><li> Fare clic sulla scheda &#39;retta&#39; nel programma. Tracciare una linea retta tra i due margini sul righello. Fare clic su &#39;analizzare&#39; menu e seleziona &#39;scala set&#39;. Impostare la distanza nota come 1, unità di lunghezza mm. </li><li> Fare clic sulla scheda &#39;cerchio a mano libera&#39;. Disegnare un cerchio a delineare l&#39;emisfero controlaterale. Fare clic sul menu &#39;analizzare&#39; e selezionare &#39;misura&#39;. La finestra di calcolo si aprirà mostra l&#39;area del cerchio disegnato. </li><li> Disegnare un altro cerchio intorno alla emisfero esclusi ictus ipsilaterale (bianco) zona. Misurare l&#39;area, come indicato al punto 4.3. Il nuovo valore verrà aggiunto alla finestra di calcolo. La differenza tra il 1 ° e 2 ° valori rappresenta l&#39;area dell&#39;infarto, che è indicato come nella formula sottostante. </li><li> Calcolare l&#39;area corsa in ogni fetta ripetendo i passaggi 4,2-4,4. Prendere sommatoria dell&#39;area corsa calcolato in ogni sezione (ΣA n). Questo rappresenta gittata sistolica conoscere il fatto che lo spessore di ogni fetta è 1 mm. ΣA n x 1 mm (spessore di ogni fetta) volume = Corsa </li></ol> 5. Rappresentante dei risultati: Il infarti ottenuto permanente legatura MCA nel topo sono in gran parte corticale. Tuttavia, è possibile ottenere le lesioni subcorticali se l&#39;MCA è legatura prossimale al ramo lenticulostriate. I volumi di ictus dopo MCA legatura può variare da 10 millimetri a 35 mm ³ ³ 19, 23. I volumi corsa calcolata con colorazione TTC in Moyanova et al. 19 sono tra ³ ³ 10mm a 22 millimetri mentre i volumi di corsa determinata da immagini MRI a Filiano e altri 23 sono tra ³ ³ 20mm a 35mm. Il possibile motivo di queste differenze forse la posizione esatta della legatura ed i diversi metodi utilizzati per misurare i volumi di corsa. Nella Figura 1, un cervello colorato TTC 24 ore posto permanente legatura MCA in un tipo selvaggio C57/BL6 del mouse viene mostrato. Il sito di corsa è di colore bianco in apparenza (Fig. 1A, B). Figure 1A e B illustrano il sito dell&#39;infarto da diverse angolazioni. La Figura 2 mostra fette 1 mm di spessore del cervello macchiato TTC corsa da anteriore a posteriore (Fig. 2A-G). Volume dell&#39;infarto è stata calcolata 24 ore post-operatorie. Il volume dell&#39;infarto è ³ ~ 23mm. <img src="/files/ftp_upload/3039/3039fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Rappresentazione del sito ictus. AB, TTC macchiato immagini del cervello intero, 24 ore dopo la legatura MCA. Area bianca rappresenta l&#39;infarto. <img src="/files/ftp_upload/3039/3039fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Risultati rappresentativi. (A&gt; G), TTC macchiato 1 millimetro cervello sezioni, 24 ore dopo Mcal. Fette sono allineate da anteriore a posteriore. Area bianca rappresenta l&#39;infarto.

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il metodo di legatura permanente MCA dà volumi infarto altamente riproducibili e un aumento post-operatorio tassi di sopravvivenza rispetto ad altri metodi disponibili. La facilità e la breve durata (~ 30 min) della procedura di renderlo ancora più pratico. Il metodo è ampiamente utilizzato sia in topi e ratti. Questa tecnica richiede un intervento chirurgico invasivo sotto uno stereomicroscopio. Pertanto, l&#39;esperienza nella gestione sotto un microscopio e perfezionare una craniotomi...

<table border="1"><tbody><tr><th> NOME </th><th> SOCIETA &#39;E NUMERO CATALOGO </th></tr><tr><td> Soluzioni e prodotti chimici A. </td><td></td></tr><tr><td> Povidone-iodio soluzione, lavaggio chirurgico </td><td> Aplicare, 82-209 </td></tr><tr><td> 70% di etanolo </td><td> Koptec, V1001 </td></tr><tr><td> 2,3,5 trifeniltetrazolio cloruro (TTC) </td><td> Sigma, T8877 </td></tr><tr><td> 4% paraformaldeide </td><td> Scienze della microscopia elettronica, 159SP </td></tr><tr><td> Tampone fosfato isotonico, pH: 7,4 </td><td> Realizzato e sterilizzati in laboratorio. </td></tr><tr><td> Olio minerale </td><td> PML Microbiologicals, R6570 </td></tr><tr><td> Isofluorane </td><td> La Società Butler, 029405 </td></tr><tr><td> Buprenorfina (0.3mg/ml) </td><td> Hospira, NDC 0409-2012-32 </td></tr><tr><td> Lacrime artificiali </td><td> La Società Butler, 007312 </td></tr><tr><td> Recupero Gel </td><td> Chiaro H 2 O, 72-01-5022 </td></tr><tr><td> B. Materiali e attrezzature chirurgiche </td><td></td></tr><tr><td> C57/BL6 del mouse, 10-12 settimane di età </td><td> La colonia è stato allevato nel vivaio universitario </td></tr><tr><td> 100% bombola di ossigeno </td><td> Airgas </td></tr><tr><td> Anestetico vaporizzatore e misuratore di portata </td><td> Surgivet, Modello 100 </td></tr><tr><td> Pad di riscaldamento con sonda rettale </td><td> Strumenti Scienza bene, TR200 </td></tr><tr><td> Microscopio da dissezione </td><td> Zeiss, Stemi 2000 </td></tr><tr><td> Riscaldamento a pannelli </td><td> Petco Services Ltd. 0307-013 </td></tr><tr><td> Piccola nave Set Cauterizer </td><td> Strumenti Scienza bene, 18000-00 </td></tr><tr><td> Mini pompa peristaltica </td><td> Harvard Apparatus, MPII </td></tr><tr><td> Siringa da 1 ml </td><td> BD, 329650 </td></tr><tr><td> 18G ago </td><td> Becton Dickinson, 305196 </td></tr><tr><td> Chirurgico di sutura in nylon 5,0 </td><td> Ethilon, 698H </td></tr><tr><td> Blocco di sezionamento </td><td> Kent scientifico, 1mm </td></tr><tr><td> Singolo bordo Razor Blades </td><td> Scienze della microscopia elettronica, 71962 </td></tr><tr><td> Etichetta del nastro </td><td> Scienceware, Bel-arte Prodotti F13463-2075 </td></tr><tr><td> Garza Spugne </td><td> Kendall rezza 2252, Johnson e Johnson 6415 </td></tr><tr><td> Suggerimento cotone Applicatori </td><td> Puritana 806-WCL </td></tr><tr><td> C. Strumenti di Chirurgia </td><td></td></tr><tr><td> Forbici chirurgiche Primavera </td><td> Strumenti Scienza multa 15003-08 </td></tr><tr><td> Forcipe Microdissecting angolato </td><td> Strumenti Scienza Belle 5 / 45 </td></tr><tr><td> Pinze Microdissecting curve </td><td> Belle Scienza Strumenti 5 Ti </td></tr><tr><td> Belle forbici dritto </td><td> Strumenti Scienza multa 14568-12 </td></tr><tr><td> Osso curvo pinza ossivora </td><td> Strumenti Scienza multa 16021-14 </td></tr><tr><td> Emostatica Hartman curvo </td><td> Strumenti Scienza multa 13003-10 </td></tr></tbody></table> Tabella 1. L&#39;elenco dei materiali, strumenti e sostanze chimiche usate per la procedura di legatura MCA. Soluzioni e prodotti chimici A., B. Materiali e attrezzature chirurgiche, C. Chirurgia Strumenti.

the application of permanent middle cerebral artery ligation in the mouse

Ischemia cerebrale focale è tra il tipo più comune di ictus osservato nei pazienti. A causa della rilevanza clinica c&#39;è stato un lungo lavoro per sviluppare modelli animali adatti a studiare gli eventi che si svolgono durante l&#39;insulto ischemico. Queste tecniche sono transitori o permanenti, i modelli di ischemia focale o globale usando molti diversi modelli animali, con i roditori più comuni sono. Il metodo di legatura permanente MCA, che viene anche definito come pMCAo in letteratura è ampiamente utilizzato come modello di ischemia focale nei roditori 1-6. Questo metodo è stato originariamente descritto per i ratti da Tamura et al. nel 1981 7. In questo protocollo una craniotomia è stato utilizzato per accedere alla MCA e le regioni prossimali sono state occluse da elettrocoagulazione. Il infarti coinvolgere soprattutto le regioni corticali e striatali volte a seconda della posizione della occlusione. Questa tecnica è ormai ben consolidata e utilizzata in molti laboratori 8-13. L&#39;uso precoce di questa tecnica ha portato alla definizione e descrizione del &quot;core infarto&quot; e &quot;penombra&quot; 14-16, ed è spesso utilizzata per valutare il potenziale neuroprotettivo composti 10, 12, 13, 17. Anche se gli studi iniziali sono stati condotti nel ratto, legatura permanente MCA è stato utilizzato con successo nei topi con lievi modifiche 18-20. Questo modello produce infarti riproducibile e un aumento post-tassi di sopravvivenza. Circa l&#39;80% degli ictus ischemico negli esseri umani avvengono in zona MCA 21 e quindi questo è un modello molto importante per gli studi di ictus. Attualmente, c&#39;è una scarsità di trattamenti efficaci a disposizione dei pazienti colpiti da ictus, e quindi c&#39;è bisogno di buoni modelli per testare potenziali composti farmacologici e valutare i risultati fisiologici. Questo metodo può essere utilizzato anche per studiare i meccanismi intracellulari di risposta all&#39;ipossia in vivo. Qui, vi presentiamo l&#39;intervento legatura MCA in un mouse C57/BL6. Descriviamo la preparazione pre-chirurgica, la chirurgia legatura MCA e 2,3,5 trifeniltetrazolio cloruro (TTC) colorazione per la quantificazione dei volumi di infarto.

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The Application Of Permanent Middle Cerebral Artery Ligation in the Mouse

Dell&#39;arteria cerebrale media (MCA) legatura è una tecnica per lo studio ischemia cerebrale focale in modelli animali. In questo metodo, l&#39;arteria cerebrale media è esposta da craniotomia e legato da cauterizzazione. Questo metodo dà volumi infarto altamente riproducibili e un aumento post-operatorio tassi di sopravvivenza rispetto ad altri metodi disponibili.

L&#39;applicazione di permanente legatura dell&#39;arteria cerebrale media nel mouse

Focal cerebral ischemia is among the most common type of stroke seen in patients. Due to the clinical significance there has been a prolonged effort to ...

the-application-permanent-middle-cerebral-artery-ligation

Research

JoVE Journal

Medicine

19.5K Views.  University of Rochester. Dell'arteria cerebrale media (MCA) legatura è una tecnica per lo studio ischemia cerebrale focale in modelli animali. In questo metodo, l'arteria cerebrale media è esposta da craniotomia e legato da cauterizzazione. Questo metodo dà volumi infarto altamente riproducibili e un aumento post-operatorio tassi di sopravvivenza rispetto ad altri metodi disponibili.