Questo studio è stato sostenuto da una borsa di TEAM CIHR # 82946 CTP, una sovvenzione CIHR # 102741 MOP, così come una sedia Canada # 216684 e una Fondazione Strauss. ER è stato sostenuto da una borsa di studio dal Cuore canadese &amp; Stroke Foundation.

Transitoria occlusione dell&#39;arteria cerebrale media (MCAO) 1. Chirurgia Procedura (Figura 1) Transitoria occlusione dell&#39;arteria cerebrale media (tMCAO) viene eseguito il 2 - a 3 mesi maschio topi C57BL / 6 (22-28g). Questo protocollo è stato approvato dalla cura degli animali IRCM comitato di bioetica. Strumenti chirurgici sono stati sterilizzati in autoclave (121 ° C a 15 psi per 60 min). Tra ogni animale, sono stati sterilizzati con il caldo tallone sterilizzatrice (15 sec). Tavolo Chirurgia e altre attrezzature sono disinfettati con etanolo al 70%. Due ore prima dell&#39;intervento chirurgico, i topi sono stati analgesized con buprenorfina (0,03 mg / kg BWIP). Figura 1A. <ol><li> Profondamente anestetizzare topi con isoflurano 5% e poi mantenere l&#39;anestesia al 2,5% isoflurano. Temperatura corporea dei topi è mantenuta costante durante l&#39;intervento con un cuscinetto riscaldante. </li><li> Disinfettare la pelliccia e skcon il 70% in etanolo o Betadine. Dal momento che la rasatura produce frammento rilascio capelli, microabrasioni e infiammazione che possono avere un impatto sulla fisiopatologia corsa, non di rado pelliccia del mouse. </li><li> Effettuare una incisione mediana del collo e delicatamente separare i tessuti molli. </li><li> Sotto un microscopio stereo (Stemi 2000, Zeiss), una dissezione smussa viene eseguita per esporre la trachea e ritrarre i muscoli per individuare la carotide. </li><li> La sinistra arteria carotide comune (CCA) è attentamente sezionato dal tessuto circostante e il CCA è temporaneamente occluso da una sutura temporanea (1) con sutura di seta 5-0 tagliato in 20 segmenti mm. Grande attenzione deve essere esercitata non danneggiare il nervo vagale. </li><li> Separare la biforcazione della sinistra interna carotide comune (ICA) ed esterni carotide comune (ECA). Una sutura permanente (2) è posizionato intorno alla ECA, più distalmente possibile, e un&#39;altra sutura leggermente stretto temporanea (3) è posto sulla ECA distale albiforcazione. </li><li> Agganciare la sinistra ICA (4) utilizzando un reverse-azione pinzette per evitare emorragie. Grande attenzione deve essere esercitata non danneggiare il nervo vagale. </li><li> Tagliare un piccolo foro in ECA (5) tra permanenti (2) e temporanei (3) punti di sutura. </li></ol> Figura 1B. <ol start="9"><li> Introdurre un 12 mm di lunghezza 6-0 siliconato (circa 9-10mm è siliconata) sutura monofilamento (Doccol Corporation) nel ECA (6), completamente tagliato l&#39;ECA distale alla sutura permanente e invertire il occlusore nella ICA . La sutura è strettamente legato intorno al monofilo per prevenire le emorragie e le reverse-azione pinzette vengono rimossi. </li><li> L&#39;occlusione è introdotto per occludere l&#39;origine del MCA nel cerchio di Willis. Interrompere l&#39;inserimento circa il 9-10 mm oltre la biforcazione di ECA e CCA. L&#39;occlusione è bloccato e non può più muoversi. La cura deve essere esercitata non a penetrare l&#39;arteria pterigopalatino. La sutura (3) sul ECA è tightly legato per fissare il monofilo in posizione. </li><li> Chiudere la pelle con un sistema di chiusura AutoClip ferita. </li><li> Iniettare 1 ml di soluzione fisiologica per via sottocutanea e posizionare topi sotto una lampada di riscaldamento a infrarossi durante tutto il periodo post-occlusione (60 min). </li></ol> 2. Restauro del Medio flusso ematico cerebrale Arteria Prima reanesthesia, il neuroscore può essere controllato per valutare il successo della chirurgia. <ol><li> Anestetizzare i topi come precedentemente descritto e rimuovere le autoclips. </li><li> Aprire leggermente la sutura (3) sulla Corte dei conti per riunire la revoca monofilamento e riperfusione sangue. </li><li> Permanente legare la sutura temporanea della Corte dei conti per evitare la perdita di sangue. Il monofilo è tenuto per il riutilizzo. </li><li> Rimuovere la sutura temporaneo (1) sul CCA per consentire ricircolo di sangue. </li><li> Chiudere la ferita. I topi dovrebbero ricevere un altro 1 ml di soluzione fisiologica per via sottocutanea. </li><li> Posizionare i topi sotto la lampada di riscaldamento a raggi infrarossi per 1 ora. Dopo aver verificato che l&#39;animale riprenda mobilità, il mouse viene restituito alla sua gabbia e lasciato sotto il termoforo e asciugamani per 72 ore. Si noti che solo la metà della gabbia è collocata sul cuscinetto di riscaldamento per permettere topi di scegliere il loro ambiente. Poiché post-chirurgica perdita di peso è generalmente osservata, cibo purè è posto in una capsula di Petri per incoraggiare mangiare. Dodici ore dopo la chirurgia, i topi hanno ricevuto un&#39;altra dose di buprenorfina (0,03 mg / kg BWIP). </li></ol> 3. Sham Funzionamento Per le operazioni fittizie, tutte le procedure sono identiche tranne che l&#39;occlusione non è inserita. 4. Neuroscore Deficit neurologici consentire la valutazione del successo di tMCAO appena dopo riperfusione e successivamente la stima del grado di gravità della lesione. Deficit neurologici sono segnati come descritto in precedenza 5 &lt;/ Sup&gt; ed eseguito a 1, 24, 48 e 72 ore post-riperfusione. Un espanso scala di sei punti viene utilizzato: <ul><li> 0: normale. </li><li> 1: lieve cerchio comportamento con o senza rotazione incoerente se preso per la coda, i tentativi &lt;50% per ruotare verso il lato controlaterale. </li><li> 2: lieve coerente cerchio,&gt; tentativi 50% per ruotare verso il lato controlaterale. </li><li> 3: in linea forte e immediato girando, il mouse ha una posizione di rotazione per più di 1-2 secondi, con il suo naso quasi a raggiungere la coda. </li><li> 4: rotazione grave procedendo in burattatura, la perdita di camminare o di riflesso di raddrizzamento. </li><li> 5: in coma o moribondi. </li></ul> 5. Violet colorazione cresolo (Figura 2) Seguendo soluzione perfusione PBS, cervelli vengono rapidamente congelati in isopentano a -80 °C. cervello del mouse può essere anche perfusi con 4% paraformaldeide (PFA) in base agli studi di immunoistochimica previsti. Criostato-tagli di sezioni cerebrali coronali (17 micron) vengono eseguite. Una sezione su ogni 30 viene raccolta nello stesso vetrino di avere una lesione cerebrale rappresentativo. Per la quantificazione del volume, 2 alla colorazione mediante colorazione violetto cresolo ed un sistema di analisi di immagine (Scion Corporation, Frederick, MD) è stato utilizzato per valutare la lesione. Il volume pregiudizio è stato calcolato in unità arbitrarie (pixel), ed espressa come percentuale del controlaterale non lesionato area per ciascuna sezione. Altre diapositive sono mantenuti a -80 ° C per studi di immunoistochimica. In alternativa, PFA-fisso cervello può essere tagliato a 30-50 micron utilizzando vibratomo e il volume dell&#39;infarto misurata come raccomandato da Han et al. (2009) 6.

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	<li>Koizumi, J., Yoshida, Y., Nakazawa, T., Ooneda, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+studies+of+ischemic+brain+edema,+I:+a+new+experimental+model+of+cerebral+embolism+in+rats+in+which+recirculation+can+be+introduced+in+the+ischemic+area.">Experimental studies of ischemic brain edema, I: a new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area.</a> Jpn. J. Stroke. 8, 1-8 (1986).</li><li>Chan, P. H., Kamii, H., Yang, G., Gafni, J., Epstein, C. J., Carlson, E., Reola, L. B. r. a. i. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=infarction+is+not+reduced+in+SOD-1+transgenic+mice+after+a+permanent+focal+cerebral+ischemia.">infarction is not reduced in SOD-1 transgenic mice after a permanent focal cerebral ischemia.</a> Neuroreport. 5, 293-296 (1993).</li><li>Yang, G., Chan, P. H., Chen, J., Carlson, E., Chen, S. F., Weinstein, P., Epstein, C. J., Kamii, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+copper-zinc+superoxide+dismutase+transgenic+mice+are+highly+resistant+to+reperfusion+injury+after+focal+cerebral+ischemia.">Human copper-zinc superoxide dismutase transgenic mice are highly resistant to reperfusion injury after focal cerebral ischemia.</a> Stroke. 25, 165-170 (1994).</li><li>Liu, S., Zhen, G., Meloni, B. P., Campbell, K., Winn, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rodent+stroke+model+guidelines+for+preclinical+stroke+trials+(1st+edition.">Rodent stroke model guidelines for preclinical stroke trials (1st edition.</a> J. Exp. Stroke Transl. Med. 2, 2-27 (2009).</li><li>Jiang, S. X., Lertvorachon, J., Hou, S. T., Konishi, Y., Webster, J., Mealing, G., Brunette, E., Tauskela, J., Preston, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlortetracycline+and+demeclocycline+inhibit+calpains+and+protect+mouse+neurons+against+glutamate+toxicity+and+cerebral+ischemia.">Chlortetracycline and demeclocycline inhibit calpains and protect mouse neurons against glutamate toxicity and cerebral ischemia.</a> J. Biol. Chem. 280, 33811-33888 (2005).</li><li>Han, R. Q., Ouyang, Y. B., Xu, L., Agrawal, R., Patterson, A. J., Giffard, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postischemic+brain+injury+is+attenuated+in+mice+lacking+the+beta2-adrenergic+receptor.">Postischemic brain injury is attenuated in mice lacking the beta2-adrenergic receptor.</a> Anesth. Analg. 108, 280-287 (2009).</li><li>Rousselet, E., Marcinkiewicz, J., Kriz, J., Zhou, A., Hatten, M. E., Prat, A., Seidah, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCSK9+reduces+the+protein+levels+of+the+LDL+receptor+in+mouse+brain+during+development+and+after+ischemic+stroke.">PCSK9 reduces the protein levels of the LDL receptor in mouse brain during development and after ischemic stroke.</a> J. Lipid Res. 52, 1383-1391 (2011).</li><li>Tamura, A., Graham, D. I., McCulloch, J., Teasdale, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focal+cerebral+ischaemia+in+the+rat:+1.+Description+of+technique+and+early+neuropathological+consequences+following+middle+cerebral+artery+occlusion.">Focal cerebral ischaemia in the rat: 1. Description of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 1, 53-60 (1986).</li><li>Chen, Y., Ito, A., Takai, K., Saito, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blocking+pterygopalatine+arterial+blood+flow+decreases+infarct+volume+variability+in+a+mouse+model+of+intraluminal+suture+middle+cerebral+artery+occlusion.">Blocking pterygopalatine arterial blood flow decreases infarct volume variability in a mouse model of intraluminal suture middle cerebral artery occlusion.</a> J. Neurosci. Methods. 174, 18-24 (2008).</li><li>Tsuchiya, D., Hong, S., Kayama, T., Panter, S. S., Weinstein, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+suture+size+and+carotid+clip+application+upon+blood+flow+and+infarct+volume+after+permanent+and+temporary+middle+cerebral+artery+occlusion+in+mice.">Effect of suture size and carotid clip application upon blood flow and infarct volume after permanent and temporary middle cerebral artery occlusion in mice.</a> Brain Res. 970, 131-192 (2003).</li><li>Tureyen, K., Vemuganti, R., Sailor, K. A., Dempsey, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infarct+volume+quantification+in+mouse+focal+cerebral+ischemia:+a+comparison+of+triphenyltetrazolium+chloride+and+cresyl+violet+staining+techniques.">Infarct volume quantification in mouse focal cerebral ischemia: a comparison of triphenyltetrazolium chloride and cresyl violet staining techniques.</a> J. Neurosci. Methods. 139, 203-207 (2004).</li></ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare. Produzione e l&#39;accesso gratuito a questo articolo è sponsorizzato da Zeiss, Inc.

Diversi modelli ictus sono stati sviluppati per imitare conseguenze ictus nei pazienti. La scelta del modello dipende dalla corsa questione biologica. Il modello intraluminale MCAO imita uno dei tipi più comuni di ictus ischemico nei pazienti ed è meno invasivo e più coerente rispetto al modello Tamura 4,7. Si tratta di un modello molto interessante per le analisi di morte neuroprotezione, neurorepair e cellula. Il successo del modello intraluminale dipende da molti fattori quali il sesso animale, età e peso, la temperatura, l&#39;anestesia e l&#39;intervento chirurgico, che devono essere controllati. Le proprietà fisiche del occlusore (diametro della punta, lunghezza, forma e fessibilità) sono critici per la consistenza del MCAO 4. Qui, usiamo i 12 mm di lunghezza 6-0 monofilamento ricoperti in silicone il 9-10 mm dalla Corporation Doccol. Il grande vantaggio di questo monofilo è quello di ridurre le emorragie subaracnoidea e per la sua lunghezza coperto tutta l&#39;ACIlunghezza, il flusso di sangue residuo, che proviene dalle arterie comunicanti anteriore e posteriore del Circolo di Willis e PPA, sia precluso e il variabilità diminuisce volume di infarto (15% della variabilità nelle nostre mani) 8. La sutura di CCA diminuisce anche la variabilità del volume dell&#39;infarto 9. L&#39;entità del seguente tMCAO lesioni cerebrali può essere valutata per vie diverse. Deficit neurologici può essere misurata come accennato in precedenza. Tuttavia, è difficile avere una misura efficace in questo modo. L&#39;entità dell&#39;infarto è comunemente eseguita mediante colorazione TTC. Più recentemente, tecniche di risonanza magnetica sono utilizzati anche, una tecnologia particolarmente interessante per trattamenti neuroprotettivi. Per comprendere i meccanismi cellulari coinvolti nella corsa come neurorepair morte cellulare o proliferazione cellulare, lo studio dei diversi marcatori di immunoistochimica è critica e molto informativo. Così, il nostro protocolo di preparati sezione del cervello ha il grande vantaggio di consentire queste analisi, e riduce al minimo il numero di topi utilizzati. Inoltre, Tureyen et al. 10 hanno riportato che esiste una buona correlazione tra colorazione violetto cresolo e TTC.

<table border="1"&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; Descrizione</strong</td&gt;<td<strong&gt; Azienda</strong</td&gt;<td<strong&gt; Numero di catalogo</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Stereomicroscopio</td&gt;<td&gt; Zeiss</td&gt;<td&gt; Stemi 2000</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Fibra-illuminatore a luce ad alta intensità</td&gt;<td&gt; Dolan-Jenner Industries Inc.</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Sistema di Anestesia per isoflurano</td&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Isoflurano</td&gt;<td&gt; CDMV</td&gt;<td&gt; 108737</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Riscaldamento coperta</td&gt;<td&gt; Gaymar Medsearch</td&gt;<td&gt; TP22G</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Lampada di riscaldamento a raggi infrarossi</td&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Ultra fine pinzette, stile 5</td&gt;<td&gt; Scienze della microscopia elettronica</td&gt;<td&gt; 78320-5TI</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Forbici Vannas Cutting Edge 3 mm, dritto</td&gt;<td&gt; Scienze della microscopia elettronica</td&gt;<td&gt; 72932-01</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Stile LA-1 e MPF-1 Tutte le lame lisce</td&gt;<td&gt; Scienze della microscopia elettronica</td&gt;<td&gt; 77926-5S</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Pinzette ad azione negativa, stile KOPINC 5</td&gt;<td&gt; Scienze della microscopia elettronica</td&gt;<td&gt; 72850-F</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Dissezione forbici 5 1/2 &quot;Straight</td&gt;<td&gt; Cedarlane</td&gt;<td&gt; 72960</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; AutoClip STARTER SET</td&gt;<td&gt; Harvard Apparatus</td&gt;<td&gt; 34-0557</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; BD AutoClip Wound Syst chiusura., 9mm lungo, 100/conf</td&gt;<td&gt; Fisher</td&gt;<td&gt; 01-804-5</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 5-0 sutura</td&gt;<td&gt; Harvard Apparatus</td&gt;<td&gt; 517763</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Materiale di sutura PDS II monofilamento viola, 5-0, RB-1; Z303H</td&gt;<td&gt; CDMV</td&gt;<td&gt; 6167</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 12 mm di lunghezza 6-0 siliconato sutura monofilamento</td&gt;<td&gt; Doccol Corporation</td&gt;<td&gt; 60SPRePK5</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Seringes 1ml</td&gt;<td&gt; Fisher</td&gt;<td&gt; 14-823-2F</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Aghi 26G1 / 2</td&gt;<td&gt; Fisher</td&gt;<td&gt; BD-305111</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td<em&gt; C57BL / 6</emHome&gt; mouse</td&gt;<td&gt; IRCM</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;</table

mouse model of intraluminal mcao: cerebral infarct evaluation by cresyl violet staining

L&#39;ictus è la terza causa di mortalità e la principale causa di disabilità nel mondo. Ischemici conti del tratto per circa l&#39;80% di tutti gli ictus. Tuttavia, il tessuto trombolitico plasminogeno (tPA) è l&#39;unico trattamento dell&#39;ictus ischemico acuto che esiste. Ciò ha indotto i ricercatori a sviluppare diversi modelli di ictus ischemico in una varietà di specie. Due principali tipi di modelli di roditori sono stati sviluppati modelli di ischemia cerebrale globale o ischemia cerebrale focale. Per simulare ictus ischemico nei pazienti, in cui circa l&#39;80% ictus trombotico o embolico si verificano nel territorio dell&#39;arteria cerebrale media (MCA), il intraluminale occlusione dell&#39;arteria cerebrale media (MCAO) modello è molto rilevante per gli studi ictus. Questo modello è stato sviluppato nei ratti di Koizumi et al. Nel 1986 1. Grazie alla facilità di manipolazione genetica nei topi, questi modelli sono stati sviluppati anche in questa specie 2-3. contenuto &quot;&gt; Qui, presentiamo il transitorio MCA procedura occlusione in C57/Bl6 topi. Precedenti studi hanno riportato che le proprietà fisiche del occlusore come diametro della punta, lunghezza, forma e flessibilità sono critici per la riproducibilità del volume dell&#39;infarto 4. qui, un monofilamenti commerciali al silicio rivestite (Doccol Corporation) sono stati utilizzati. Un altro grande vantaggio è che questo monofilo riduce il rischio di indurre emorragie subaracnoidea. Uso stereomicroscopio Zeiss Stemi 2000, il monofilamento di silicio rivestito è stato introdotto nella carotide interna (ICA) attraverso un taglio nella carotide esterna (ECA) finché il monofilamento occlude la base del MCA. flusso di sangue è stato ripristinato dopo 1 ora dalla rimozione del monofilamento di imitare il ripristino del flusso sanguigno dopo la lisi di un coagulo in tromboembolica umani. Il grado di infarto cerebrale possono essere valutati prima da un punteggio neurologica e dalla misura del volume dell&#39;infarto.Ischemici topi sono stati quindi analizzati per il loro punteggio neurologico a diversi post-riperfusione volte. Per valutare il volume dell&#39;infarto, colorazione con 2,3,5-trifeniltetrazolio cloruro (TTC) è stato di solito eseguita. Qui, abbiamo usato la colorazione viola cresile in quanto offre la possibilità di testare molti indicatori critici di immunoistochimica. In questo video, si segnala la procedura MCAO; punteggi neurologici e la valutazione del volume dell&#39;infarto mediante colorazione violetto cresolo.

La valutazione neuroscore conferma il successo tMCAO post-stroke e determina l&#39;efficienza del tMCAO post-riperfusione. Nelle nostre mani, tutti i topi sottoposti alla procedura intraluminale presentato almeno una lieve arricciatura consistente (neuroscore 2) ed i deficit neurologici sono generalmente stabili fino a 72 ore. La maggior parte dei topi mostrano un lieve arricciatura consistente (neuroscore 2). Topi mostrano assenza di arricciature sono esclusi dallo studio. Tuttavia, la valutazione neuroscore non ci permette di distinguere tra i topi con un ippocampo ferito e quelli con un ippocampo intatto. Nessuna mortalità è stata osservata durante il day surgery, suggerendo che emorragie subaracnoidea non si è verificato. Quando emorragia subaracnoidea è identificato in un topo, questo viene sistematicamente esclusi dall&#39;analisi. L&#39;uso di silicio rivestito monofilamento da Doccol Corporation, che è più liscia preparate in casa, monofilamenti, aumenta il successotMCAO e riduce emorragie subaracnoidea. La mortalità tra 24 ore e 72 ore è del 14% in questo modello, come generalmente riportato per 60 minuti di occlusione. La mortalità osservata è probabilmente dovuto ad un grande volume dell&#39;infarto in questo ceppo di topi. Una lesione riproducibilità forte è stata osservata anche (deviazione standard è del 15%), che è molto interessante studiare molecole neuroprotezione dove il suo effetto (s) potrebbe essere nascosti dalla variabilità del modello. Per valutare l&#39;entità del danno cerebrale dopo tMCAO, abbiamo scelto di utilizzare la colorazione cresyl violetto (Figura 2) anziché TTC per avere un sacco di materiale per testare marcatori pertinenti 6. L&#39;estensione della lesione è relativamente costante. Tuttavia, abbiamo notato che in alcuni topi, l&#39;ippocampo è stato ferito (circa il 30% dei topi). È interessante notare che la colorazione violetto cresolo può essere applicata fino a 1 settimana dopo. In letteratura, la percentuale di infarto cerebrale varia da unostudiare all&#39;altro. Essa dipende dalla scelta del ceppo di topo, l&#39;anestesia, lo spessore delle sezioni cerebrali, il monofilo utilizzata, o la colorazione utilizzata 6, 7. <img src="/files/ftp_upload/4038/4038fig1.jpg" alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4038/4038fig1highres.jpg" /> Figura 1. Schema della occlusione dell&#39;arteria cerebrale media utilizzando siliconato monofilo intraluminale. A. Schema semplificato di cervello di topo e arterie cerebrali che mostrano suture successive e clip per preparare l&#39;introduzione di silicio rivestito monofilamento. B. La posizione del monofilo attraverso il circolo di Willis è rappresentato. Il monofilamento è introdotto nella ICA via Corte a occludere alla base del MCA ACA, arteria cerebrale anteriore,. BA, arteria basilare, CCA, arteria carotide comune, C. Willis, circolo di Willis, Corte dei conti, carotide esterna artery, ICA, arteria carotide interna, MCA, l&#39;arteria cerebrale media, PCA, posteriore dell&#39;arteria comunicante, PPA, arteria pterigopalatino. <img src="/files/ftp_upload/4038/4038fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Rappresentative sezioni coronali di cervello di topo colorate con violetto cresolo, dopo 72 ore di post-riperfusione. Dell&#39;area infartuale (soprattutto striato, la corteccia e le aree cerebrali adiacenti) viene visualizzata in bianco (non colorati di violetto cresolo). Il volume lesioni (parte bianca, emisfero destro) era delimitato ed espressa come percentuale del controlaterale non lesionato area (emisfero sinistro).

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Mouse Model of Intraluminal MCAO: Cerebral Infarct Evaluation by Cresyl Violet Staining

Il modello intraluminale occlusione cerebrale nei topi viene qui presentato. Il grado di infarto cerebrale viene valutata da un punteggio neurologico e colorazione violetto cresolo, una colorazione alternativa alla TTC, che offre il grande vantaggio di testare in parallelo molti marcatori di interesse.

Modello murino di MCAO intraluminale: valutazione infarto cerebrale da colorazione viola cresile

Stroke is the third  cause of mortality and the leading cause of disability in the World. Ischemic  stroke accounts for approximately 80% of all strokes. ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

62.8K Views.  Clinical Research Institute of Montreal. Il modello intraluminale occlusione cerebrale nei topi viene qui presentato. Il grado di infarto cerebrale viene valutata da un punteggio neurologico e colorazione violetto cresolo, una colorazione alternativa alla TTC, che offre il grande vantaggio di testare in parallelo molti marcatori di interesse.

Video: Mouse Model of Intraluminal MCAO: Cerebral Infarct Evaluation by Cresyl Violet Staining

Mouse Model of Middle Cerebral Artery Occlusion

Stroke is the most common fatal neurological disease in the United States 1. The majority of strokes (88%) result from blockage of blood vessels in the brain (ischemic stroke) 2. Since most ischemic strokes (~80%) occur in the territory of middle cerebral artery (MCA) 3, many animal stroke models that have been developed have focused on this artery. The intraluminal monofilament model of middle cerebral artery occlusion (MCAO) involves the insertion of a surgical filament into the external carotid artery and threading it forward into the internal carotid artery (ICA) until the tip occludes the origin of the MCA, resulting in a cessation of blood flow and subsequent brain infarction in the MCA territory 4. The technique can be used to model permanent or transient occlusion 5. If the suture is removed after a certain interval (30 min, 1 h, or 2 h), reperfusion is achieved (transient MCAO); if the filament is left in place (24 h) the procedure is suitable as a model of permanent MCAO. This technique does not require craniectomy, a neurosurgical procedure to remove a portion of skull, which may affect intracranial pressure and temperature 6. It has become the most frequently used method to mimic permanent and transient focal cerebral ischemia in rats and mice 7,8. To evaluate the extent of cerebral infarction, we stain brain slices with 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) to identify ischemic brain tissue 9. In this video, we demonstrate the MCAO method and the determination of infarct size by TTC staining.

We demonstrate in the video a method for producing a middle cerebral artery occlusion in adult mice using an intraluminal monofilament. We also show how to evaluate the extent of cerebral infarction by 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) staining.

Modello murino di Mezzo occlusione dell&#39;arteria cerebrale

Stroke is the most common fatal neurological disease in the United States 1. The majority of strokes (88%) result from blockage of blood vessels in the ...

Ricerca

Medicina

Intraluminal Middle Cerebral Artery Occlusion (MCAO) Model for Ischemic Stroke with Laser Doppler Flowmetry Guidance in Mice

Stroke is the third leading cause of death and the leading cause of disability in the world, with an estimated cost of near $70 billion 
in the United States in 20091,2. The intraluminal middle cerebral artery occlusion (MCAO) model was developed by Koizumi4 in 1986 to simulate this 
impactful human pathology in the rat. A modification of the MCAO method was later presented by Longa3. Both techniques have been widely used to identify 
molecular mechanisms of brain injury resulting from ischemic stroke and potential therapeutic modalities5. This relatively noninvasive method in rats has been 
extended to use in mice to take advantage of transgenic and knockout strains6,7. To model focal cerebral ischemia, an intraluminal suture is advanced via 
the internal carotid artery to occlude the base of the MCA. Retracting the suture after a specified period of time mimics spontaneous reperfusion, but the 
suture can also be permanently retained. This video will be demonstrating the two major approaches for performing intraluminal MCAO procedure in mice in a 
stepwise fashion, as well as providing insights for potential drawbacks and pitfalls. The ischemic brain tissue will subsequently be stained by 
2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) to evaluate the extent of cerebral infarction8.

Intraluminal Middle Cerebral Artery Occlusion MCAO Model for Ischemic Stroke with Laser Doppler Flowmetry Guidance in Mice

The intraluminal middle cerebral artery occlusion (MCAO) model is the most frequent used model among experimental ischemic stroke models. Here we will demonstrate the entire model in detail with the guide of Laser Doppler flowmetry, and its representative results.

Intraluminali occlusione dell&#39;arteria cerebrale media (MCAO) Modello per l&#39;ictus ischemico con la guida flussimetria laser Doppler in topi

Stroke is the third leading cause of death and the leading cause of disability in the world, with an estimated cost of near $70 billion 
in the United ...

Optimized System for Cerebral Perfusion Monitoring in the Rat Stroke Model of Intraluminal Middle Cerebral Artery Occlusion

The translational potential of pre-clinical stroke research depends on the accuracy of experimental modeling. Cerebral perfusion monitoring in animal models of acute ischemic stroke allows to confirm successful arterial occlusion and exclude subarachnoid hemorrhage. Cerebral perfusion monitoring can also be used to study intracranial collateral circulation, which is emerging as a powerful determinant of stroke outcome and a possible therapeutic target. Despite a recognized role of Laser Doppler perfusion monitoring as part of the current guidelines for experimental cerebral ischemia, a number of technical difficulties exist that limit its widespread use. One of the major issues is obtaining a secure and prolonged attachment of a deep-penetration Laser Doppler probe to the animal skull. In this video, we show our optimized system for cerebral perfusion monitoring during transient middle cerebral artery occlusion by intraluminal filament in the rat. We developed in-house a simple method to obtain a custom made holder for twin-fibre (deep-penetration) Laser Doppler probes, which allow multi-site monitoring if needed. A continuous and prolonged monitoring of cerebral perfusion could easily be obtained over the intact skull.

Cerebral perfusion monitoring has been demonstrated to improve accuracy in ischemic stroke models. Technical difficulties often limit the use of this essential tool for cerebrovascular research. In this video, an optimized system is shown to obtain a single or multi-site hemodynamic monitoring during intraluminal middle cerebral artery occlusion in rats.

Sistema ottimizzato per il monitoraggio perfusione cerebrale nel modello Rat Stroke of intraluminale occlusione dell&#39;arteria cerebrale media

The translational potential of pre-clinical stroke research depends on the accuracy of experimental modeling. Cerebral perfusion monitoring in animal ...

Embolic Middle Cerebral Artery Occlusion (MCAO) for Ischemic Stroke with Homologous Blood Clots in Rats

Clinically, thrombolytic therapy with use of recombinant tissue plasminogen activator (tPA) remains the most effective treatment for acute ischemic stroke. However, the use of tPA is limited by its narrow therapeutic window and by increased risk of hemorrhagic transformation. There is an urgent need to develop suitable stroke models to study new thrombolytic agents and strategies for treatment of ischemic stroke. At present, two major types of ischemic stroke models have been developed in rats and mice: intraluminal suture MCAO and embolic MCAO. Although MCAO models via the intraluminal suture technique have been widely used in mechanism-driven stroke research, these suture models do not mimic the clinical situation and are not suitable for thrombolytic studies. Among these models, the embolic MCAO model closely mimics human ischemic stroke and is suitable for preclinical investigation of thrombolytic therapy. This embolic model was first developed in rats by Overgaard et al.1 in 1992 and further characterized by Zhang et al. in 19972. Although embolic MCAO has gained increasing attention, there are technical problems faced by many laboratories. To meet increasing needs for thrombolytic research, we present a highly reproducible model of embolic MCAO in the rat, which can develop a predictable infarct volume within the MCA territory. In brief, a modified PE-50 tube is gently advanced from the external carotid artery (ECA) into the lumen of the internal carotid artery (ICA) until the tip of the catheter reaches the origin of the MCA. Through the catheter, a single homologous blood clot is placed at the origin of the MCA. To identify the success of MCA occlusion, regional cerebral blood flow was monitored, neurological deficits and infarct volumes were measured. The techniques presented in this paper should help investigators to overcome technical problems for establishing this model for stroke research.

Embolic Middle Cerebral Artery Occlusion MCAO for Ischemic Stroke with Homologous Blood Clots in Rats

In this paper, we demonstrate a standard method for producing an embolic middle cerebral artery occlusion with homologous blood clots (fibrin-rich) in adult rat. This model closely mimics human ischemic stroke and is suitable for preclinical study of thrombolytic therapy for ischemic stroke.

Embolic occlusione dell&#39;arteria cerebrale media (MCAO) per l&#39;ictus ischemico con omologhi coaguli di sangue nei ratti

Clinically, thrombolytic therapy with use of recombinant tissue plasminogen activator (tPA) remains the most effective treatment for acute ischemic ...

Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated death 1. Common sites of metastatic spread include lung, lymph node, brain, and bone 2. Mechanisms that drive metastasis are intense areas of cancer research. Consequently, effective assays to measure metastatic burden in distant sites of metastasis are instrumental for cancer research. Evaluation of lung metastases in mammary tumor models is generally performed by gross qualitative observation of lung tissue following dissection. Quantitative methods of evaluating metastasis are currently limited to ex vivo and in vivo imaging based techniques that require user defined parameters. Many of these techniques are at the whole organism level rather than the cellular level 3-6. Although newer imaging methods utilizing multi-photon microscopy are able to evaluate metastasis at the cellular level 7, these highly elegant procedures are more suited to evaluating mechanisms of dissemination rather than quantitative assessment of metastatic burden. Here, a simple in vitro method to quantitatively assess metastasis is presented. Using quantitative Real-time PCR (QRT-PCR), tumor cell specific mRNA can be detected within the mouse lung tissue.

This protocol describes how to use quantitative Real-time PCR (QRT-PCR) to detect tumor cell specific mRNA representing metastasis within the mouse lung tissue.

Valutazione del polmone metastasi in mouse mammarie tumorali modelle da Quantitative Real-time PCR

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated ...

A Battery of Motor Tests in a Neonatal Mouse Model of Cerebral Palsy

As the sheer number of transgenic mice strains grow and rodent models of pediatric disease increase, there is an expanding need for a comprehensive, standardized battery of neonatal mouse motor tests. These tests can validate injury or disease models, determine treatment efficacy and/or assess motor behaviors in new transgenic strains. This paper presents a series of neonatal motor tests to evaluate general motor function, including ambulation, hindlimb foot angle, surface righting, negative geotaxis, front- and hindlimb suspension, grasping reflex, four limb grip strength and cliff aversion. Mice between the ages of post-natal day 2 to 14 can be used. In addition, these tests can be used for a wide range of neurological and neuromuscular pathologies, including cerebral palsy, hypoxic-ischemic encephalopathy, traumatic brain injury, spinal cord injury, neurodegenerative diseases, and neuromuscular disorders. These tests can also be used to determine the effects of pharmacological agents, as well as other types of therapeutic interventions. In this paper, motor deficits were evaluated in a novel neonatal mouse model of cerebral palsy that combines hypoxia, ischemia and inflammation. Forty-eight hours after injury, five tests out of the nine showed significant motor deficits: ambulation, hindlimb angle, hindlimb suspension, four limb grip strength, and grasping reflex. These tests revealed weakness in the hindlimbs, as well as fine motor skills such as grasping, which are similar to the motor deficits seen in human cerebral palsy patients.

Presented is a concise battery of mouse neonatal motor tests. Using these tests, neonatal motor deficits can be demonstrated in a variety of neonatal motor disorders. By having a standardized set of tests, results from different studies can be compared, allowing for better and accurate reporting between groups.

Una serie di test a motore in neonatale topo modello di paralisi cerebrale

As the sheer number of transgenic mice strains grow and rodent models of pediatric disease increase, there is an expanding need for a comprehensive, ...

Intraluminal Drug Delivery to the Mouse Arteriovenous Fistula Endothelium

Delivery of therapeutic agents to enhance arteriovenous fistula (AVF) maturation can be administered either via intraluminal or external routes. The simple murine AVF model was combined with intraluminal administration of drug solution to the venous endothelium at the same time as fistula creation. Technical aspects of this model are discussed. Under general anesthesia, an abdominal incision is made and the aorta and inferior vena cava (IVC) are exposed. The infra-renal aorta and IVC are dissected for clamping. After proximal and distal clamping, the puncture site is exposed and a 25 G needle is used to puncture both walls of the aorta and into the IVC. Immediately after the puncture, a reporter gene-expressing viral vector was infused in the IVC via the same needle, followed by 15 min of incubation. The intraluminal administration method enabled more robust viral gene delivery to the venous endothelium compared to administration by the external route. This novel method of delivery will facilitate studies that explore the role of the endothelium in AVF maturation and enable intraluminal drug delivery at the time of surgical operation.

After puncturing the aorta through the inferior vena cava (IVC) to create an aorto-caval fistula in the mouse, solution containing a drug is infused into the IVC via the same needle, followed by incubation. This method enables more robust drug delivery to the venous endothelium compared to the external route.

Intraluminale Drug Delivery per il mouse fistola artero-venosa endotelio

Delivery of therapeutic agents to enhance arteriovenous fistula (AVF) maturation can be administered either via intraluminal or external routes. The ...

Induction and Micro-CT Imaging of Cerebral Cavernous Malformations in Mouse Model

Mutations in the CCM1 (aka KRIT1), CCM2, or CCM3 (aka PDCD10) gene cause cerebral cavernous malformation (CCM) in humans. Mouse models of CCM disease have been established by tamoxifen induced deletion of Ccm genes in postnatal animals. These mouse models provide invaluable tools to investigate molecular mechanism and therapeutic approaches for CCM disease. An accurate and quantitative method to assess lesion burden and progression is essential to harness the full value of these animal models. Here, we demonstrate the induction of CCM disease in a mouse model and the use of the contrast enhanced X-ray micro computed tomography (micro-CT) method to measure CCM lesion burden in mouse brains. At postnatal day 1 (P1), we used 4-hydroxytamoxifen (4HT) to activate Cre recombinase activity from the Cdh5-CreErt2 transgene to cleave the floxed allele of Ccm2. CCM lesions in mouse brains were analyzed at P8. For micro-CT, iodine based Lugol&#39;s solution was used to enhance contrast in brain tissue. We have optimized the scan parameters and utilized a voxel dimension of 9.5 &#181;m, which lead to a minimum feature size of approximately 25 &#181;m. This resolution is sufficient to measure CCM lesion volume and number globally and accurately, and provide high-quality 3-D mapping of CCM lesions in mouse brains. This method enhances the value of the established mouse models to study the molecular basis and potential therapies for CCM and other cerebrovascular diseases.

This protocol demonstrates the induction of cerebral cavernous malformation disease in a mouse model and uses contrast enhanced micro computed tomography to measure lesion burden. This method enhances the value of established mouse models to study the molecular basis and potential therapies for cerebral cavernous malformation and other cerebrovascular diseases.

Induzione e Micro-CT Imaging delle malformazioni cavernose cerebrali nel modello del topo

Mutations in the CCM1 (aka KRIT1), CCM2, or CCM3 (aka PDCD10) gene cause cerebral cavernous malformation (CCM) in humans. Mouse models of CCM disease have ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and drugs. It is widely used in many studies on the physiological functions of vascular smooth muscle, the pathogenesis of vascular diseases such as hypertension, and the development of smooth muscle relaxant drugs. The mouse is a widely used model animal with a large pool of disease models and genetically modified strains. We introduced this method to measure the isometric contraction of mouse mesenteric artery in detail. A 1.4-mm segment of mouse mesenteric resistance artery was isolated and mounted on a myograph chamber by passing two steel wires through its lumen. After equilibration and normalization steps, the vessel segment was potentiated by a high-K+ solution twice prior to the contraction assay. As an example of the application of this method in drug development, we measured the relaxant effect of a novel natural substance, neoliensinine, isolated from a Chinese herb, embryos of the lotus seed (Nelumbo nucifera Gaertn.) on mouse mesenteric arteries. The vessel segments mounted on the myograph chamber were stimulated with a high-K+ solution. When the force tension reached a stable sustained phase, cumulative doses of neoliensinine were added to the chamber. We found that neoliensinine had a dose-dependent relaxant effect on smooth muscle contraction, thus suggesting that it bears potential activity against hypertension. In addition, as the vessel segment can survive at least 4 hours after mounting and maintain contractility induced by the high-K+ solution for many times, we suggest that the wire myograph system may be used for the time-consuming process of drug screening.

The wire myograph technique is used to investigate vascular smooth muscle functions and screen new drugs. We report a detailed protocol for measuring the isometric contractility of the mouse mesenteric artery and for screening new relaxants of vascular smooth muscle.

Misurazione di contrattilità isometrica dell'arteria mesenterica Mouse con filo Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

Two-vessel Occlusion Mouse Model of Cerebral Ischemia-reperfusion

In this study, a middle cerebral artery (MCA) occlusion mouse model is employed to study cerebral ischemia-reperfusion. A reproducible and reliable mouse model is useful for investigating the pathophysiology of cerebral ischemia-reperfusion and determining potential therapeutic strategies for patients with stroke. Variations in the anatomy of the circle of Willis of C57BL/6 mice affects their infarct volume after cerebral-ischemia-induced injury. Studies have indicated that distal MCA occlusion (MCAO) can overcome this problem and result in a stable infarct size. In this study, we establish a two-vessel occlusion mouse model of cerebral ischemia-reperfusion through the interruption of the blood flow to the right MCA. We distally ligate the right MCA and right common carotid artery (CCA) and restore blood flow after a certain period of ischemia. This ischemia-reperfusion injury induces an infarct of stable size and a behavioral deficit. Peripheral immune cells infiltrate the ischemic brain within the 24 h infiltration period. Additionally, the neuronal loss in the cortical area is less for a longer reperfusion duration. Therefore, this two-vessel occlusion model is suitable for investigating the immune response and neuronal recovery during the reperfusion period after cerebral ischemia.

A mouse model of cerebral ischemia-reperfusion is established to investigate the pathophysiology of stroke. We distally ligate the right middle cerebral artery and right common carotid artery and restore blood flow after 10 or 40 min of ischemia.

Occlusione del vaso due Mouse modello di Ischemia-riperfusione cerebrale

In this study, a middle cerebral artery (MCA) occlusion mouse model is employed to study cerebral ischemia-reperfusion. A reproducible and reliable mouse ...