Silicon Maestro Mold Fabrication Litografia Materiali: <ul><li> 75 wafer di silicio millimetri </li><li> SU-8 2 Fotoresist negativo (MicroChem, Boston, MA) </li><li> N2 </li></ul> Metodo: <ol><li> Disidratare wafer di silicio a 120 ° C per 2 ore. </li><li> UV trattamento superficiale di ozono per 7 minuti per rimuovere sostanze organiche. </li><li> Superficie colpo N2 per rimuovere il particolato. </li><li> Applicare SU-8 2 per coprire il 70% della superficie (~ 10 ml per 75 wafer mm). </li><li> Rotazione a 2000 giri per 20 secondi con 300 giri di accelerazione / s. </li><li> Posizionare la cialda su una piastra e rampa da temperatura ambiente a 95 ° C. </li><li> Softbake il photoresist per 15 minuti a 95 ° C. </li><li> Flood esporre wafer per 20-25 mJ/cm2 dosi a 365 nm (I-line) per formare lo strato inferiore. </li><li> Applicare SU-8 2 per strato fotosensibile secondo. </li><li> Girare a 550 giri per 20 secondi con 300 giri di accelerazione / s per un film di circa 11 micron di spessore. </li><li> Posizionare la cialda su una piastra e rampa da temperatura ambiente a 65 ° C. </li><li> Softbake il wafer a 65 ° C per 5 minuti. </li><li> Rampa la piastra da 65 ° C a 95 ° C. </li><li> Softbake il wafer per 55 minuti a 95 ° C. </li><li> Wafer raffreddare a temperatura ambiente per 20 minuti. </li><li> Allineare maschera mPAD su wafer ed esporre per 95-100 mJ/cm2 dosi a 365 nm (I-line). </li><li> Posizionare la cialda su una piastra e rampa da temperatura ambiente a 95 ° C. </li><li> Post-esposizione del photoresist cuocere per 25 minuti a 95 ° C. </li></ol> Sviluppare Materiali: <ul><li> Piatti di vetro 100mm (5) </li><li> Glicole propilenico etere acetato di metile (PGMEA) </li><li> Isopropanolo (IPA) </li><li> N2 </li></ul> Metodo: <ol><li> In una cappa chimica, riempire cinque piatti con PGMEA (2), IPA, e Esano (2). </li><li> Tenere wafer in 1a PGMEA per 10 secondi </li><li> Agitare wafer per 50 secondi </li><li> Trasferimento wafer al 2 PGMEA con menisco di PGMEA. </li><li> Agitare per 5 secondi. </li><li> Trasferimento wafer di IPA con menisco di PGMEA. </li><li> Agitare per 20 secondi. </li><li> Trasferimento wafer al 1 ° IPA. </li><li> Agitare per 5 secondi. </li><li> Trasferimento wafer di IPA 2. </li><li> Agitare per 5 secondi. </li><li> Rimuovere rapidamente wafer da IPA 2 ° con menisco di IPA e asciugare con N2 </li><li> Ispezionare modello. </li><li> Hardbake wafer a 120 ° C per 14-20 ore per cross-link SU-8. </li><li> Dice il wafer con un tagliatore di diamanti </li><li> Montare il wafer su un vetrino con resina epossidica </li><li> Fluorosilanize il wafer (vedi istruzioni in stampaggio replica) </li></ol> Stampaggio replica di mPADS Stampo negativo Materiali: <ul><li> Alluminio usa e getta di peso barca </li><li> Polidimetilsilossano (PDMS), base e catalizzatore (Dow, Midland, MI) </li><li> Razorblade </li><li> Silano: (tridecafluoro-1 ,1,2,2-tetrahyrooctyl)-1-triclorosilano </li><li> Vetrini </li><li> Pipetta Pasteur in vetro </li></ul> Metodo: <ol><li> Mescolare PDMS 10:01 in peso e Degas in sottovuoto per 1 ora per rimuovere le bolle. </li><li> Luogo maestro stampo in silicone in barca alluminio. </li><li> Versare 50-60 g di PDMS oltre stampo master in barca alluminio. </li><li> Degas sotto vuoto per 30 minuti per rimuovere le bolle. </li><li> Blow off superficie bolle d&#39;aria intrappolate nel PDMS con rapido colpo di N2. </li><li> Posto barca nel forno ventilato a 110 ° C per 15 minuti fino a PDMS è fermo. </li><li> Tagliare barca di alluminio. </li><li> Con la lametta, troncare PDMS silicio sotto padrone. </li><li> Sbucciare PDMS lontano dal maestro silicio lentamente e con movimento continuo in una direzione per evitare di distruggere il maestro. </li><li> Ispezionare maestro silicio per danni. </li><li> Tagliare stampo negativo in 4 pezzi. </li><li> Ripetere i passaggi 1-10 per una grande serie di stampi in negativo. </li><li> Plasma di ossigeno trattare stampo negativo per 1,5 minuti per attivare superficie, o </li><li> L&#39;ozono trattare stampo negativo per circa 10 minuti per attivare la superficie. </li><li> Mettere gli stampi in negativo essiccatore con caratteristiche mPAD esposti. </li><li> Diffusione 250-500 ml di silano su vetrino nel centro di essiccatore </li><li> Luogo pascolo pipetta di vetro con 150-200 ml di silano nella punta all&#39;interno essiccatore. </li><li> Camera a vuoto per far evaporare stampi negativi silani e cappotto per&gt; 14 ore. </li></ol> mPADS Materiali: <ul><li> Polidimetilsilossano (PDMS), base e catalizzatore (Dow, Midland, MI) </li><li> Bocca larga pipette usa e getta </li><li> 2 &quot;x 3&quot; Glass diapositive </li><li> Vetro Scribe </li><li> N2 </li></ul> Metodo: <ol><li> Mescolare PDMS 10:01 in peso e Degas in sottovuoto per 1 ora per rimuovere le bolle. </li><li> pizzo silanizzata stampi negativi in ​​&#39;croce&#39; </li><li> Pipettare PDMS in stampi negativo in modo che le caratteristiche sono interamente coperti da uno spessore 1mm. </li><li> Attendere 30 minuti per eventuali bolle d&#39;aria nel PDMS a salire in superficie. &lt;/ Li&gt; <li> In 30 &#39;i tempi di inattività, la polvere 22x22mm (n. 2) coprioggetto di vetro con un flusso di N2. </li><li> Ossigeno nel plasma vetrini trattare metà per 1,5 minuti per pulire e attivare vetro </li><li> Blow off superficie bolle d&#39;aria intrappolate nel PDMS con rapido colpo di N2. </li><li> Addagiate bordo del vetro coprioggetto sul PDMS con il lato pulito di fronte al plasma PDMS. Abbassare lentamente il vetrino in modo che il pieno PDMS contatti su tutta la superficie di vetro e di evitare bolle d&#39;aria intrappolati sotto il vetrino. </li><li> Luogo assemblati stampi in forno ventilato a 110 ° C per 20 ore per curare completamente. </li><li> Togliere gli stampi da forno e lasciarli raffreddare a RT. </li><li> Tenere vetrino con una mano sopra e lentamente buccia negativo via lo stampo negativo dal basso per liberare il mPAD. </li><li> Ispezionare la mPAD sotto un microscopio per i post è crollato. </li><li> Re-silanize stampo tramite il plasma e silano ogni quattro getti. La durata dello stampo negativo per la replica è di circa 6-20 buon cast. </li></ol> Cellule semina su mPADS Stampigliatura Materiali: <ul><li> PDMS francobolli per UCP (vedi Tien, J &amp; Chen, CS, in Metodi di Ingegneria dei Tessuti, 2001, pp 113-120). </li><li> Etanolo (100% e 70%) </li><li> Sterilizzati acqua deionizzata </li><li> 50 ug / ml fibronectina umani in acqua deionizzata sterile (BD Biosciences) </li><li> 5 ug / ml soluzione DII filtrata con membrana 0,2 micron (D-3886, Molecular Probes, OR) </li><li> 2% Pluronics F127 (BASF, Mount Olive, New Jersey) </li><li> 1X fosfato soluzione tampone. </li><li> 100 mm x 25 millimetri scatola di Petri (4) </li><li> 150 millimetri x 25 mm scatola di Petri (2) </li><li> Foglio di alluminio </li><li> N2 </li><li> Pinzetta </li><li> Cappuccio sterile </li></ul> Metodo: <ol><li> Trim PDMS eccesso mPADs </li><li> Se il timbro PDMS è stata utilizzata in precedenza, sonicare francobolli in etanolo 100% per 5 minuti a macchia di distanza proteine ​​contaminanti. </li><li> Nel cappuccio sterile, tenere timbri su un fianco con le pinzette e asciugare con N2 dopo immersione in acqua dolce francobolli etanolo al 100% e acqua sterile </li><li> Luogo in 150 millimetri piatto di Petri con il lavoro verso l&#39;alto. </li><li> Aliquota gocce di soluzione fibronectina su ogni francobollo. Inizia con gli angoli in ciascuno dei francobolli, poi i bordi, e infine le regioni interne. Inizialmente la superficie PDMS del francobollo è idrofobica, ma diventa idrofile come la proteina viene adsorbito. Lavoro &quot;dall&#39;esterno all&#39;interno&quot; cambia l&#39;angolo di contatto del PDMS in modo che un minor volume di soluzione fibronectina è necessaria per mano completamente il timbro. </li><li> Lasciate riposare per 1 ora nel cappuccio per delle proteine. </li><li> Lavare con acqua deionizzata francobolli versando nel piatto e lasciando che il livello dell&#39;acqua sale sopra i francobolli. </li><li> Lavare i francobolli in 100 millimetri piatto di Petri riempite con acqua deionizzata. </li><li> Rimuovere e secco con N2. </li><li> MPADS ozono per il trattamento di 7 minuti per attivare la superficie per la timbratura. </li><li> Sotto il cofano, timbro mPADS mettendo bordo timbro sulla mPAD e delicatamente abbassare di entrare in contatto pieno. Toccare leggermente la parte superiore del francobollo con pinzette per garantire tutte le aree hanno un buon contatto, ma attenzione a non comprimere il post. </li><li> Rimuovere con attenzione i francobolli con le pinzette. </li><li> MPADS immergere in 100 millimetri piatto di Petri con il 100% di etanolo per ~ 15 secondi. Tenere microaghi da dewetting durante il trasferimento con il trasferimento in fretta tra i piatti. </li><li> MPADS immergere in piatto mm 100 di Petri con etanolo al 70% per ~ 15 secondi. </li><li> MPADS immergere in piatto mm 100 di Petri con acqua deionizzata per ~ 15 secondi. </li><li> MPADS immergere nel secondo piatto 100 millimetri di Petri con acqua deionizzata per ~ 15 secondi. </li><li> MPADS immergere in 150 millimetri piatto di Petri con acqua deionizzata. </li><li> MPADS immergere in 150 millimetri piatto di Petri con 100 mL di soluzione DII. </li><li> Coprire con un foglio di alluminio e di ammollo per 1 ora. </li><li> MPADS immergere in piatto mm 100 di Petri con acqua deionizzata per ~ 15 secondi. </li><li> MPADS immergere in 150 millimetri piatto di Petri con 10 ml del 2% Pluronics e 90 ml di PBS per la concentrazione totale del 0,2% Pluronics. </li><li> Coprire e ammollo per 1 ora. </li><li> MPADS immergere in piatto mm 100 di Petri con acqua deionizzata per ~ 15 secondi. </li><li> MPADS immergere nel secondo piatto 100 millimetri di Petri con acqua deionizzata per ~ 15 secondi. </li><li> MPADS immergere in terza piatto 100 millimetri di Petri con PBS per ~ 15 secondi. </li></ol> Semina Materiali: <ul><li> Linea cellulare scelto </li><li> Tripsina-EDTA (0,25% tripsina con EDTA • 4NA, Cat. Gibco. No. 25200-056) </li><li> Crescita media </li><li> 1X fosfato soluzione tampone. </li></ul> Metodo: <ol><li> Nel cappuccio sterile, mPADS posto in piatto mm 100 petri e riempite con 17 ml di mezzo. </li><li> Luogo Petri in incubatore per scaldare a 37 ° C </li><li> Sospendere le cellule tramite tripsina </li><li> Aspirare ripetutamente di rompere gruppi di cellule. </li><li> Pipettare sospensione cellulare nella capsula di Petri con il mPADS. Aggiungi tali cellule rimarranno singole cellule (senza cellula-cellula contatti) al momento dell&#39;analisi. L&#39;esatta quantità di cellule da aggiungere è cellule di tipo specifico edipende dalla superficie delle cellule diffusione e tasso di crescita. </li><li> Delicatamente le cellule si disperdono in capsula di Petri con pippetting lento. </li><li> Posto in incubatrice per 2 ore per permettere alle cellule di stabilirsi e di aderire su microaghi. </li><li> Ispezionare mPADS per vedere se le cellule si sono diffuse. Le cellule appiattite e sarà durata sei o più messaggi. </li><li> Se le cellule sono distribuite, il trasferimento mPADS di nuovo 100 millimetri piatto di Petri con 21 ml di terreno fresco. </li><li> Il mPADS sono pronti per l&#39;esperimento. </li></ol> Colorazione e montaggio mPADS Fissaggio Materiali: <ul><li> Acqua deionizzata </li><li> Paraformeldahyde (16%) fiala </li><li> 10X fosfato soluzione tampone. </li><li> 1X fosfato soluzione tampone. </li></ul> Metodo: <ol><li> In un tubo di centrifuga 50 mL, aggiungere 30 ml di DI, 10 ml di paraformeldahyde (fiala intera), e 4,5 ml di PBS 10X per la soluzione di fissaggio. </li><li> Aggiungi ~ 25 mL di soluzione di fissaggio per un piatto di 100 mm di Petri. </li><li> MPAD immergere delicatamente con le cellule di fissaggio in piatto e lasciare incubare per 20 minuti. </li><li> MPADS immergere in 100 mm con piatto 1X PBS per tre volte. </li><li> Pronto per immunostaining e montaggio. </li></ol> Analizzando Forze cellulare sul mPADS Confocale Imaging Materiali: <ul><li> Microscopio confocale </li><li> Obiettivo 63x </li><li> Cubetti di filtro per gli anticorpi secondari </li><li> Filtro verde cubo (Rhodamine) per l&#39;imaging di DII microaghi. </li></ul> Metodo: <ol><li> MPADs posto sul palco e trovare singole cellule con 300 ms di esposizione, senza binning. </li><li> Cime immagine di microaghi per IMAGE TOP. </li><li> Usando z-controllo lettura, dell&#39;immagine di microaghi per immagine in basso. </li><li> Immagine tutti gli altri canali che avete a macchie (Hoechst, falloidina ecc) </li></ol> Analisi dell&#39;immagine Materiali: <ul><li> MATLAB con Image Processing Toolbox </li></ul> Metodo: <ol><li> Ruota e registrare le immagini superiore e inferiore </li><li> Centroidi di misura inferiore (undeflected) e superiore (deviato) le posizioni </li><li> Calcolare lo spostamento </li><li> Utilizzando la costante della molla per i posti (noto, dipende dalla geometria del post), calcolare vettore forza ad ogni messaggio </li><li> Analisi degli errori è basata sulla capacità di risolvere le forze, e dipende dalla risoluzione dell&#39;immagine e la risoluzione di rilevamento centroide </li><li> Organizzare i dati secondo i vostri bisogni personalizzati - per esempio, grandezze forza e / o direzione, come un corso di tempo, molte misure diverse per le varie patologie, ecc </li></ol>

<ol>
	<li>Tan, J. L., Tien, J., Pirone, D., Gray, D. S., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+lying+on+a+bed+of+microneedles:+An+approach+to+isolate+mechanical+force.">Cells lying on a bed of microneedles: An approach to isolate mechanical force.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 100, 1484-1489 (2003).</li><li>Sniadecki, N. J., Chen, C. S., Wang, Y. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabricated+Silicone+Elastomeric+Post+Arrays+for+Measuring+Traction+Forces+of+Adherent+Cells.">Microfabricated Silicone Elastomeric Post Arrays for Measuring Traction Forces of Adherent Cells.</a> Methods in Cell Biology - Cell Mechanics. 83, 313-328 (2007).</li><li>Lemmon, C. A., Sniadecki, N. J., Ruiz, S. A., Tan, J. T., Romer, L. H., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+Force+at+the+Cell-Matrix+Interface:+Enhanced+Analysis+For+Microfabricated+Post+Array+Detectors.">Shear Force at the Cell-Matrix Interface: Enhanced Analysis For Microfabricated Post Array Detectors.</a> Mechanics &amp; Chemistry of Biosystems. 2, 1-16 (2005).</li></ol>

microfabricated post-array-detectors (mpads): an approach to isolate mechanical forces

In questo video, presenteremo il nostro approccio per misurare le forze di trazione cellulare utilizzando una matrice microfabbricazione di messaggi. Forze di trazione vengono generati tramite interazioni actina-miosina e svolgono un ruolo importante nella nostra fisiologia. Durante lo sviluppo, che permettono alle cellule di spostarsi da un luogo all&#39;altro per formare le strutture primi di tessuto. Forze di trazione aiuta nei processi di guarigione. Essi sono necessari per la corretta chiusura di ferite o la migrazione e la scansione dei leucociti attraverso il nostro corpo. Queste stesse forze possono essere dannosi per la nostra salute in caso di metastasi del cancro o di crescita vascolare verso un tumore. Il metodo più comune con cui studiare le cellule in vitro è stato quello di usare un bicchiere o un piatto di polistirolo. Tuttavia, la rigidità dei substrati rende fisicamente impossibile misurare le forze di trazione delle cellule, e ci sono metodi relativamente pochi per studiare le forze di trazione. Il nostro laboratorio ha sviluppato una tecnica per superare queste limitazioni. Il metodo si basa su un array verticale di cantilever flessibili, la rigidità e la scala di dimensioni tali che le singole cellule sparse cantilever molti e deviare nel processo. I pilastri che utilizziamo sono 3 micron di diametro, alto 10 micron, e sono configurati in una serie regolare con 9 micron da centro a centro spaziatura. Ma queste dimensioni fisiche possono essere facilmente variata per ospitare una varietà di studi. Si comincia con un master al silicio, ma i pali finali sono realizzati in gomma di silicone chiamato poli (dimetil silossani) o PDMS. Siamo in grado di misurare la deviazioni sotto un microscopio e calcolare l&#39;entità e la direzione delle forze di trazione necessaria per produrre le deformazioni osservate. Noi chiamiamo questi substrati microfabbricazione post-array-detector, o mPADs. Qui, vi mostreremo come fabbricare e usare il mPADs per valutare modulazioni della contrattilità cellulare.

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Microfabricated Post-Array-Detectors mPADs: an Approach to Isolate Mechanical Forces

In questo video ci dimostra come fabbricare e utilizzare microfabbricazione rivelatori gamma post (mPADs) per valutare modulazioni della contrattilità cellulare.

Microfabbricazione post-Array-Detector (mPADs): un approccio per isolare le forze meccaniche

In this video, we will present our approach to measure cellular traction forces using a microfabricated array of posts.  Traction forces are generated ...

microfabricated-post-array-detectors-mpads-an-approach-to-isolate

Research

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Biology

Microfabricated Post-Array-Detectors (mPADs): an Approach to Isolate Mechanical Forces

12.4K Views.  University of Pennsylvania. In questo video ci dimostra come fabbricare e utilizzare microfabbricazione rivelatori gamma post (mPADs) per valutare modulazioni della contrattilità cellulare.

Video: Microfabricated Post-Array-Detectors mPADs: an Approach to Isolate Mechanical Forces

Using Micro-Electro-Mechanical Systems (MEMS) to Develop Diagnostic Tools

Using Micro-Electro-Mechanical Systems MEMS to Develop Diagnostic Tools

Utilizzando Micro-Electro-Mechanical Systems (MEMS) per sviluppare strumenti diagnostici

Ricerca

Biologia

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for discovering new therapeutic strategies. Advancements in imaging technology have enabled quantitative investigation of the organization and maturing of the body plan, but later stage embryonic morphogenesis is less clear. Chicken embryos are an attractive vertebrate animal model system for this application because of its ease of culture and surgical manipulation. Early embryos can be cultured for a short time on filter paper rings, which enables complete optical access for cell patterning and fate studies1,2. Studying advanced developmental processes such as cardiac morphogenesis are traditionally performed through a window of the eggshell3-5, but this technique limits optical access due to window size. We previously developed a simple method to culture whole embryos ex-ovo on hexagonal weigh boats for up to 10 days, which enabled high resolution imaging via ultrasonography6,7. These cultures were difficult to transport, limiting the types of imaging tools available for live experiments. We here present an improved shell-less culture system with a cost-effective, portable environmental chamber. Eggs were cracked onto a hammock created by a polyurethane membrane (cling wrap) affixed circumferentially to a plastic cup partially filled with sterile water. The dimensions of the circumference and depth of the hammock were both critical to maintain surface tension, while the mechanics of the hammock and water beneath helped dampen vibrations induced by transportation. A small footprint circulating water bath was also developed to enable continuous temperature control during experimentation. We demonstrate the ability to culture embryos in this way for at least 14 days without morphogenic defect or delay and employ this system in several microsurgical and imaging applications.

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

In this article, we present a simple methodology to enable long-term ex-ovo avian embryo culture. This technique is ideal for longitudinal experimentation requiring complete optical accessibility and/or sterile transportation in avian embryos.

Un Ex-ovo Sistema di embrioni di pollo Cultura Adatto per applicazioni di imaging e Microchirurgia

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway that polypeptide chain follows during co-translational folding to achieve its functional form is still an enigma. In order to understand this process and to determine the exact conformation of the co-translational folding intermediates, it is essential to develop techniques that allow the isolation of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes to allow their further structural analysis.
SecM (secretion monitor) is a 170 amino acid E. coli protein that regulates expression of the downstream SecA (secretion driving) ATPase in the secM-secA operon6. Nakatogawa and Ito originally found that a 17 amino acid long sequence (150-FSTPVWISQAQGIRAGP-166) in the C-terminal region of the SecM protein is sufficient and necessary to cause stalling of SecM elongation at Gly165, thereby producing peptidyl-glycyl-tRNA stably bound to the ribosomal P-site7-9. More importantly, it was found that this 17 amino acid long sequence can be fused to the C-terminus of virtually any full-length and/or truncated protein thus allowing the production of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes7. Thus, when fused or inserted into the target protein, SecM stalling sequence produces arrest of the polypeptide chain elongation and generates stable RNCs both in vivo in E. coli cells and in vitro in a cell-free system. Sucrose gradient centrifugation is further utilized to isolate RNCs.
The isolated RNCs can be used to analyze structural and functional features of the co-translational folding intermediates. Recently, this technique has been successfully used to gain insights into the structure of several ribosome bound nascent chains10,11. Here we describe the isolation of bovine Gamma-B Crystallin RNCs fused to SecM and generated in an in vitro translation system.

We describe here a technique that is now routinely used to isolate stably bound ribosome nascent chain complexes (RNCs). This technique takes advantage of the discovery that a 17 amino acid long SecM "arrest sequence" can halt translation elongation in a prokaryotic (E. coli) system, when inserted into (or fused to the C-terminus) of virtually any protein.

Utilizzando Sequence SECM arresto come uno strumento per isolare ribosoma Polipeptidi Bound

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

Many cellular processes are controlled by multisubunit protein complexes. Frequently these complexes form transiently and require native environment to assemble. Therefore, to identify these functional protein complexes, it is important to stabilize them in vivo before cell lysis and subsequent purification. Here we describe a method used to isolate large bona fide protein complexes from Drosophila embryos. This method is based on embryo permeabilization and stabilization of the complexes inside the embryos by in vivo crosslinking using a low concentration of formaldehyde, which can easily cross the cell membrane. Subsequently, the protein complex of interest is immunopurified followed by gel purification and analyzed by mass spectrometry. We illustrate this method using purification of a Tudor protein complex, which is essential for germline development. Tudor is a large protein, which contains multiple Tudor domains - small modules that interact with methylated arginines or lysines of target proteins. This method can be adapted for isolation of native protein complexes from different organisms and tissues.

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

Multi-component protein complexes play crucial roles during cellular function and development. Here we describe a method used to isolate native protein complexes from Drosophila embryos after in vivo crosslinking followed by purification of the crosslinked complexes for subsequent structure-function analysis.

Un In vivo La reticolazione Approccio per isolare complessi proteici da Drosophila Embrioni

Many cellular processes are controlled by multisubunit protein complexes. Frequently these complexes form transiently and require native environment to ...

An Alternative Approach for Sample Preparation with Low Cell Number for TEM Analysis

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, especially cells in suspension such as hematopoietic stem cells (HSCs), remains limited due to the requirement of a high cell number during sample preparation. There are a few cytospin or monolayer approaches for TEM analysis from scarce samples, but these approaches fail to get significant quantitative data from the limited number of cells. Here, an alternative and novel approach for sample preparation in TEM studies is described for rare cell populations that enables quantitative analysis.
A relatively low cell number, i.e., 10,000 HSCs, was successfully used for TEM analysis compared to the millions of cells typically used for TEM studies. In particular, Evans blue staining was performed after paraformaldehyde-glutaraldehyde (PFA-GA) fixation to visualize the tiny cell pellet, which facilitated embedding in agarose. Clusters of numerous cells were observed in ultra-thin sections. The cells had a well preserved morphology, and the ultra-structural details of the Golgi complex and several mitochondria were visible. This efficient, easy and reproducible protocol allows sample preparation from a low cell number and can be used for qualitative and quantitative TEM analysis on rare cell populations from limited biological samples.

Here, we present a protocol to prepare samples with low cell numbers for transmission electron microscopy (TEM) analysis.

Un approccio alternativo per la preparazione del campione con un basso numero di cellule per l&#39;analisi TEM

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, ...

Analyzing Cell Surface Adhesion Remodeling in Response to Mechanical Tension Using Magnetic Beads

Mechanosensitive cell surface adhesion complexes allow cells to sense the mechanical properties of their surroundings. Recent studies have identified both force-sensing molecules at adhesion sites, and force-dependent transcription factors that regulate lineage-specific gene expression and drive phenotypic outputs. However, the signaling networks converting mechanical tension into biochemical pathways have remained elusive. To explore the signaling pathways engaged upon mechanical tension applied to cell surface receptor, superparamagnetic microbeads can be used. Here we present a protocol for using magnetic beads to apply forces to cell surface adhesion proteins. Using this approach, it is possible to investigate not only force-dependent cytoplasmic signaling pathways by various biochemical approaches, but also adhesion remodeling by magnetic isolation of adhesion complexes attached to the ligand-coated beads. This protocol includes the preparation of ligand-coated superparamagnetic beads, and the application of define tensile forces followed by biochemical analyses. Additionally, we provide a representative sample of data demonstrating that tension applied to integrin-based adhesion triggers adhesion remodeling and alters protein tyrosine phosphorylation.

Cell surface adhesions are central in mechanotransduction, as they transmit mechanical tension and initiate the signaling pathways involved in tissue homeostasis and development. Here, we present a protocol for dissecting the biochemical pathways that are activated in response to tension, using ligand-coated magnetic microbeads and force application to adhesion receptors.

Analizzando cellulare superficie di adesione ritocca in risposta alla tensione meccanica utilizzando biglie magnetiche

Mechanosensitive cell surface adhesion complexes allow cells to sense the mechanical properties of their surroundings. Recent studies have identified both ...

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

Chemotaxis, or migration up a gradient of a chemoattractant, is the best understood mode of directed migration. Studies using social amoeba Dictyostelium discoideum revealed that a complex signal transduction network of parallel pathways amplifies the response to chemoattractants, and leads to biased actin polymerization and protrusion of a pseudopod in the direction of a gradient. In contrast, molecular mechanisms driving other types of directed migration, for example, due to exposure to shear flow or electric fields, are not known. Many regulators of chemotaxis exhibit localization at the leading or lagging edge of a migrating cell, as well as show transient changes in localization or activation following global stimulation with a chemoattractant. To understand the molecular mechanisms of other types of directed migration we developed a method that allows examination of cellular response to acute mechanical stimulation based on brief (2 - 5 s) exposure to shear flow. This stimulation can be delivered in a channel while imaging cells expressing fluorescently-labeled biosensors to examine individual cell behavior. Additionally, cell population can be stimulated in a plate, lysed, and immunoblotted using antibodies that recognize active versions of proteins of interest. By combining both assays, one can examine a wide array of molecules activated by changes in subcellular localization and/or phosphorylation. Using this method we determined that acute mechanical stimulation triggers activation of the chemotactic signal transduction and actin cytoskeleton networks. The ability to examine cellular responses to acute mechanical stimulation is important for understanding the initiating events necessary for shear flow-induced motility. This approach also provides a tool for studying the chemotactic signal transduction network without the confounding influence of the chemoattractant receptor.

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

Here we describe methods for assessing cellular response to acute mechanical stimulation. In the microscopy-based assay, we examine localization of fluorescently-labeled biosensors following brief stimulation with shear flow. We also test activation of various proteins of interest in response to acute mechanical stimulation biochemically.

Valutazione della risposta di Dictyostelium discoideum alla stimolazione meccanica acuta

Chemotaxis, or migration up a gradient of a chemoattractant, is the best understood mode of directed migration. Studies using social amoeba Dictyostelium ...

Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for cartilage tissue engineering. MSCs from synovial fluid (SF-MSCs) have been considered promising candidates for articular regeneration, and their potential therapeutic benefit has made them an important research topic of late. SF-MSCs from the knee cavity of the New Zealand white rabbit can be employed as an optimized translational model to assess human regenerative medicine. By means of CD90-based magnetic activated cell sorting (MACS) technologies, this protocol successfully obtains rabbit SF-MSCs (rbSF-MSCs) from this rabbit model and further fully demonstrates the MSC phenotype of these cells by inducing them to differentiate to osteoblasts, adipocytes, and chondrocytes. Therefore, this approach can be applied in cell biology research and tissue engineering using simple equipment and procedures.

This article presents a simple and economic protocol for the straightforward isolation and purification of mesenchymal stem cells from New Zealand white rabbit synovial fluid.

Magnetico-Activated Cell Sorting strategie per isolare e purificare Synovial cellule staminali mesenchimali liquido derivato da un modello di coniglio

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for ...

Protrusion Force Microscopy: A Method to Quantify Forces Developed by Cell Protrusions

In numerous biological contexts, animal cells need to interact physically with their environment by developing mechanical forces. Among these, traction forces have been well-characterized, but there is a lack of techniques allowing the measurement of the protrusion forces exerted by cells orthogonally to their substrate. We designed an experimental setup to measure the protrusion forces exerted by adherent cells on their substrate. Cells plated on a compliant Formvar sheet deform this substrate and the resulting topography is mapped by atomic force microscopy (AFM) at the nanometer scale. Force values are then extracted from an analysis of the deformation profile based on the geometry of the protrusive cellular structures. Hence, the forces exerted by the individual protruding units of a living cell can be measured over time. This technique will enable the study of force generation and its regulation in the many cellular processes involving protrusion. Here, we describe its application to measure the protrusive forces generated by podosomes formed by human macrophages.

Here, we detail the experimental techniques used to evaluate the protrusion forces that podosomes apply on a compliant film, from the preparation of the film to the automated analysis of topographical images.

Microscopia a forza protrusione: Un metodo per quantificare le forze sviluppate dalla cella sporgenze

In numerous biological contexts, animal cells need to interact physically with their environment by developing mechanical forces. Among these, traction ...

A High Output Method to Isolate Cerebral Pericytes from Mouse

In recent years, cerebral pericytes have become the focus of extensive research in vascular biology and pathology. The importance of pericytes in blood brain barrier formation and physiology is now demonstrated but its molecular basis remains largely unknown. As the pathophysiological role of cerebral pericytes in neurological disorders is intriguing and of great importance, the in vitro models are not only sufficiently appropriate but also able to incorporate different techniques for these studies. Several methods have been proposed as in vitro models for the extraction of cerebral pericytes, although an antibiotic-free protocol with high output is desirable. Most importantly, a method that has increased output per extraction reduces the usage of more animals.
Here, we propose a simple and efficient method for extracting cerebral pericytes with sufficiently high output. The mouse brain tissue homogenate is mixed with a BSA-dextran solution for the separation of the tissue debris and microvascular pellet. We propose a three-step separation followed by filtration to obtain a microvessel rich filtrate. With this method, the quantity of microvascular fragments obtained from 10 mice is sufficient to seed 9 wells (9.6 cm2 each) of a 6-well plate. Most interestingly with this protocol, the user can obtain 27 pericyte rich wells (9.6 cm2 each) in passage 2. The purity of the pericyte cultures are confirmed with the expression of classical pericyte markers: NG2, PDGFR-&#946; and CD146. This method demonstrates an efficient and feasible in vitro tool for physiological and pathophysiological studies on pericytes.

We present a protocol for the extraction of murine cerebral pericytes. Based on an antibiotic-free enrichment oriented pericyte extraction, this protocol is a valuable tool for in vitro studies providing high purity and high yield, thus decreasing the number of experimental animals used.

Un metodo ad alta uscita per isolare i periciti cerebrali dal mouse

In recent years, cerebral pericytes have become the focus of extensive research in vascular biology and pathology. The importance of pericytes in blood ...