Questo protocollo consente di isolare e coltivare con successo fibroblasti associati al cancro primario dal cancro al seno murin, per lo screening di nuove nanoparticelle progettate per colpire il microambiente tumorale. I CAF primari rappresentano il modello più affidabile e fisiologico per gli studi in vitro dello stroma tumorale. In questo protocollo, descriviamo come ottenere una resa ottimale.
Per iniziare, preparare un mix di digestione per la dissociazione del tumore e immergere i frammenti tumorali da tre a cinque millimetri nella soluzione dopo aver chiuso ermeticamente il tubo. Capovolgere il tubo, controllando che tutti i pezzi di tumore siano nella parte inferiore del tubo verso il cappuccio. Quindi collegare il tubo a un dissociaro meccanico nell'alloggiamento appropriato ed eseguire un programma di dissociazione specificamente progettato per i tumori duri.
Dopo la corsa, staccare il tubo e posizionarlo a testa in giù per incubare il campione a 37 gradi Celsius per 40 minuti con un leggero scuotimento. Quindi ricollegare il tubo al dissociatere nell'alloggiamento appropriato ed eseguire il programma di dissociazione per i tumori duri due volte, assicurandosi che non rimangano pezzi di tessuto di grandi dimensioni alla fine della procedura. Filtrare il campione attraverso un filtro cellulare da 40 micron in un tubo da 50 millilitro.
Quindi lavare il filtro con 10 millilitri di mezzo RPMI 1640 e centrifuga. Dopo la centrifugazione, risuscidere il pellet in tampone PBE, composto da PBS, 0,5% BSA e due EDTA millimolari, e contare le celle con Trypan Blue. Riparare il tampone legante per la rimozione delle cellule morte diluendo la soluzione tampone legante 20X con acqua sterile a doppia distillazione.
Lavare le celle con cinque millilitri di tampone legante 1X e centrifuga. Dopo la centrifugazione, risospendare il pellet cellulare con 0,1 millilitro di microsfere di rimozione delle cellule morte per un massimo di 10-10 celle e incubare a temperatura ambiente per 15 minuti. Durante l'incubazione, preparare un supporto magnetico sotto il cofano e appendere colonne di separazione ferromagnetica ad esso, con le punte che puntano verso il basso.
Equilibrare le colonne con 0,5 millilitri di tampone legante a freddo e attendere che la soluzione sia passata. Dopo l'incubazione, aggiungere 400 microlitri di tampone legante a freddo al perla e alla sospensione cellulare. Caricare l'intero volume sulla colonna e raccogliere l'effluente in un tubo da 15 millilitro.
Lavare la colonna quattro volte con 0,5 millilitri di tampone legante a freddo e raccogliere l'effluente totale nello stesso tubo. Per l'esaurimento dei fibroblasti non associati al cancro, filtrare la sospensione cellulare utilizzando un filtro cellulare da 70 micron inumidito con PBS e centrifugare le cellule. Rimuovere il surnatante e risuscidere il pellet in 80 microlitri di tampone PBE freddo.
Aggiungere 20 microlitri di cocktail di esaurimento dei fibroblasti non associati al tumore. Mescolare bene e incubare il campione a 4 gradi Celsius per 15 minuti al buio. Durante l'incubazione con perle, preparare colonne di esaurimento ferromagnetico su un supporto magnetico.
Equilibrare le colonne con due millilitri di tampone PBE freddo e attendere che la soluzione sia passata. Dopo l'incubazione, aggiungere 400 microlitri di tampone al perla e alla sospensione cellulare. Caricare l'intero volume sulla colonna e raccogliere l'effluente in un tubo da 15 millilitro.
Lavare la colonna due volte con due millilitri di PBE. Raccogliere l'effluente totale nello stesso tubo e centrifugare l'effluente. Per la selezione positiva dei fibroblasti associati al cancro, riconsedere il pellet in 80 microlitri di tampone PBE freddo.
Quindi a 20 microlitri di fibroblasti associati al tumore microsfere e incubare i campioni a 4 gradi Celsius per 15 minuti al buio. Durante l'incubazione, preparare le colonne di separazione ferromagnetica su un supporto magnetico ed equilibrarle con 0,5 millilitri di tampone PBE freddo. Dopo l'incubazione, aggiungere 400 microlitri di PBE alla sospensione di pere e cellule.
Caricare l'intero volume sulla colonna e lasciare che le celle senza etichetta fluiscano in un tubo da 15 millilitro. Lavare la colonna tre volte con 0,5 millilitri di tampone PBE e raccogliere l'effluente totale nello stesso tubo. Rimuovere la colonna dal magnete e posizionarla in un tubo da 1,5 millilitro.
Aggiungere un millilitro di PBE sulla colonna e spingere immediatamente lo stantuffo nella colonna per svuotare le celle. Dopo la centrifugazione, risuscibare il pellet cellulare in un volume appropriato di DMEM e seminare le cellule in una piastra di coltura tissutale. Controllare la densità cellulare al microscopio e posizionare la piastra a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per consentire alle cellule di aderire e crescere.
L'iniezione di cellule di 4T1 luciferasi nel cuscinetto di grasso mammario dei topi femmina ha portato alla crescita di una massa tumorale rilevabile cinque giorni dopo l'impianto. Per trovare una finestra di sacrificio adeguata per l'isolamento CAF, è stato cercato un compromesso ottimale tra dimensioni tumorali più elevate e imaging a bioluminescenza da un lato e un'ulcerazione e necrosi tumorale emergente dall'altro. Il giorno 20 è stato impostato come punto temporale per ottimizzare il recupero cellulare, dopo il processo di isolamento.
Sono stati necessari altri due passaggi per isolare la popolazione di CAF, dal pannello di cellule vitali raccolte, dall'esaurimento dei fibroblasti non associati al tumore e dall'arricchimento dei fibroblasti associati al tumore. Le cellule CAF hanno rivelato una grande morfologia a forma di fuso, tipica dei fibroblasti, ed erano diverse dalle cellule tumorali 4T1. L'espressione fap seguita in cinque passaggi conferma che la cultura CAF primaria ha mantenuto le sue caratteristiche originali.
Quando la durata e la temperatura delle incubazioni con microsfere non sono state mantenute, sono stati trovati cloni con morfologia diversa tra le culture isolate. Queste cellule contaminanti sono cresciute più velocemente e hanno prevalso sulla coltura CAF primaria. Il legame dei CAF con il nano farmaco funzionalizzato Hfn-FAP della ferritina umana è aumentato di tre volte a una e le concentrazioni di frammenti di anticorpi da uno a cinque.
Al contrario, per le cellule tumorali 4T1, l'HFN nudo ha mostrato un legame più elevato rispetto all'HFN funzionalizzato. Per aumentare la resa impurità del CAF isolato, mantenere freddi i tamponi, rispettare il tempo di incubazione con le perle e tirare fino a quattro tumori per colonna prima della fase finale di arricchimento. I CAF isolati possono essere utilizzati per lo screening di diversi nano farmaci candidati in termini di legame, assorbimento ed efficacia farmacologica prima di procedere con esperimenti preclinici in vivo.
L'isolamento CAF ci ha permesso di verificare se le nanoparticelle possono essere utilizzate per colpire il microambiente tumorale. Aprendo così la strada a nuove terapie mirate che lavorano in sinergia con la chemioterapia.
