Questo protocollo è significativo per la produzione di organoidi epiteliali di memoria che vengono generati senza passaggio. Il principale vantaggio di questa tecnica è che gli organoidi possono essere isolati dal seno umano e di topo e dal tessuto di memoria dopo la digestione enzimatica. Eseguiamo una serie di fasi di centrifugazione differenziale che isolano gli organoidi epiteliali senza dover far passare le cellule.
Un individuo che esegue questa tecnica può affrontare sfide quando incorpora i tessuti nel collagene o nella matrice e li placca all'interno di una piastra a 96 pozzetti. Inoltre, l'uso di collagene correttamente polimerizzato e cupole stabili di placcatura è la chiave per vedere l'invasione. Per iniziare, raccogli il tessuto mammario di un topo eutanasia allargando gli arti del topo e usando quattro aghi calibro 19, blocca il topo per le zampe su una tavola coperta da un cuscinetto assorbente con il lato ventrale rivolto verso l'alto.
Spruzzare con etanolo al 70% per levigare il pelo e disinfettare la pelle e pulire le feci con una garza o un fazzoletto. Partendo appena sopra la regione anogenitale, tagliare verso l'alto dalla linea mediana usando le forbici chirurgiche facendo attenzione a non perforare il peritoneo. Una volta raggiunto il mento, effettuare tagli laterali lungo entrambe le clavicole e lungo le zampe posteriori e appuntare la pelle del topo tesa alla tavola per esporre i cuscinetti di grasso mammario.
Dopo aver individuato i cuscinetti di grasso mammario inguinale e toracico sui topi selvatici, utilizzare una pinza per elevare il cuscinetto di grasso mammario. Usando l'estremità smussata delle forbici smussate affilate, creare una tasca sotto il cuscinetto di grasso mammario lontano dalla pelle e tagliare via il cuscinetto di grasso mammario in un unico pezzo. Una volta rimossi i cuscinetti di grasso mammario, sciacquare in PBS prima di metterli in una capsula di coltura di tessuto sterile e quindi trasferire rapidamente in una cappa di coltura tissutale.
Tritare i tumori mammari con un bisturi numero 10 o numero 11 per allentare il tessuto fino a raggiungere una consistenza simile alla pasta. Trasferire il tessuto tritato in un tubo conico contenente da 10 a 30 millilitri di soluzione di collagenasi usando un bisturi. Per garantire che tutto il tessuto sia raccolto, pipettare un millilitro di soluzione di collagenasi sulla piastra di coltura tissutale e di nuovo nel tubo conico.
Posizionare il tubo conico in un'incubatrice da banco fino a quando il tessuto diventa stopposo e la soluzione di collagenasi diventa torbida. Centrifugare 50 millilitri di soluzione per cinque a 10 minuti a 1.500 giri / min. Aspirare il surnatante e aggiungere 12 millilitri del mezzo basale e mescolare pipettando su e giù tre o quattro volte o ruotare delicatamente il polso tenendo il tubo 15 volte.
Anche in questo caso, spin down aspirare il supernatante, aggiungere il mezzo basale e mescolare mediante pipettaggio o rotazione del tubo come dimostrato in precedenza. Una volta che i frammenti di tessuto più pesanti si depositano sul fondo, raccogliere il surnatante con una pipetta sierologica e trasferirlo in un tubo conico da 15 millilitri. Dopo ogni centrifugazione, assicurarsi che il pellet diventi sempre più opaco.
Aliquot sospensione appropriata di organoidi in provette da microcentrifuga in base alla densità degli organoidi rispetto alla quantità di BECM per pozzetto. Centrifugare le provette per microcentrifuga per 10 minuti a 300 G a temperatura ambiente ed eliminare il surnatante dalle provette. Spostare i tubi con pellet organoidi sul ghiaccio e aggiungere il volume appropriato di BECM a ciascuna provetta da microcentrifuga.
Pipettare delicatamente su e giù per risospendere gli organoidi in BECM, facendo attenzione a non produrre bollicine. Pipettare lentamente e con cura gli organoidi sospesi BECM sulla superficie di placcatura e riempire tutti i pozzetti vuoti con PBS per mantenere l'umidità. Posizionare la piastra in un'incubatrice a 37 gradi Celsius per un'ora per consentire al BECM di solidificarsi e quindi coprire con il volume appropriato di supporto.
Per preparare la soluzione di collagene, combinare 375 microlitri di 10 volte la concentrazione di DMEM, 100 microlitri di un normale idrossido di sodio e tre millilitri di soluzione di collagene I a coda di ratto in un tubo conico da 15 millilitri. Mescolare le pipette, facendo attenzione a non formare bolle, e titolare la soluzione a un pH compreso tra 7,2 e 7,4 con una piccola quantità di idrossido di sodio o 10 volte la concentrazione di DMEM secondo necessità. Rivestire il fondo dei pozzetti con la quantità minima di collagene necessaria per coprire completamente il fondo del pozzetto posizionando una piccola quantità di collagene e scuotere la piastra da un lato all'altro per rivestire.
Lasciare che i sottostrati di collagene si stabilizzino a 37 gradi Celsius per 30 minuti a due ore. Aliquot la sospensione appropriata di organoidi in provette da microcentrifuga in base alla densità organoide relativa alla quantità di collagene per pozzetto. Conservare la soluzione di collagene a quattro gradi Celsius e monitorare la polimerizzazione controllando la formazione di fibre al microscopio ogni 10 minuti.
Centrifugare le provette da microcentrifuga a 300 G per 10 minuti a temperatura ambiente ed eliminare il surnatante dalle provette. Spostare i pellet organoidi sul ghiaccio e aggiungere il volume appropriato di collagene a ciascuna provetta di microcentrifuga. Pipettare delicatamente su e giù per risospendere gli organoidi nel collagene, facendo attenzione a non produrre bolle.
Pipettare lentamente e con attenzione gli organoidi sospesi al collagene sulla superficie di placcatura. Le immagini immunofluorescenti di organoidi incorporati nella matrice extracellulare basale o nel collagene sono state ottenute per studiare le somiglianze della composizione tissutale inter-specie. Gli organoidi incorporati nella matrice di collagene possono essere utilizzati per un test di invasione e analizzati monitorando l'espansione dei viticci che si diramano dall'organoide stesso attraverso l'etichettatura del pomodoro di membrana o la colorazione falloidina dell'actina.
Infine, la colorazione con ematossilina ed eosina degli organoidi incorporati in paraffina mostra che gli organoidi mantengono la stessa istologia del cancro al seno. È fondamentale mantenere freddi BECM e collagene durante il pipettaggio delle cupole gelificate per evitare la polimerizzazione prematura. Inoltre, il fissaggio prolungato delle cupole in PFA porterà a una soluzione gelificata se si esegue la colorazione immunofluorescente.
Gli organoidi possono anche essere utilizzati in procedure in vitro e in vivo come screening di farmaci e modelli murini di metastasi. Questi metodi possono fornire approfondimenti sulla sensibilità terapeutica del tessuto tumorale, sulle proprietà metastatiche e sulle interazioni immunitarie.
