Questa ricerca è stata in parte finanziata dal National Institutes of Health, concedere R01 EB007594, il Dipartimento del Programma di Ricerca sul Cancro Seno Difesa, proposta BCO74699P7, e la Susan G. Komen Foundation concedere 26152/98188972.

1. Microendoscope Assemblea L&#39;alta risoluzione microendoscope qui descritto (figura 1a) dovrebbe essere considerata come una configurazione di base con diverse variazioni possibili in assemblea e di applicazione. Descriviamo in dettaglio in questa sede l&#39;incarnazione della piattaforma che è stato progettato per essere utilizzato con proflavina come agente di contrasto fluorescente. Proflavina nucleare è un luminoso macchia con l&#39;assorbimento di picco e lunghezze d&#39;onda di emissione di 445 nm e 515 nm rispettivamente. L&#39;uso di altri mezzi di contrasto richiede all&#39;utente di selezionare eccitazione, emissione e filtri dicroici in modo appropriato. Diversi elementi di alta risoluzione microendoscope sono generici e possono essere ottenute da fornitori diversi. Per esempio, i componenti di posizionamento optomechanical sono disponibili da Thorlabs, Newport, Linos tra gli altri. Compatte telecamere CCD sono disponibili da aziende quali Point Grey Research, Prosilica e Retiga; sensibilità della telecamera deve essere scelto tenendo in considerazione la luminosità del fluoroforo da utilizzare, così come il frame rate desiderato. Ad alta potenza diodi emettitori di luce (LED) possono essere ottenuti da Luxeon, Cree, e Nichia tra gli altri. Fasci di fibre ottiche sono disponibili da Sumitomo, Fujikura, e Schott. Nella scelta dei componenti per una specifica applicazione, l&#39;utente deve prendere in considerazione le relazioni inerenti coinvolti in microscopia a fluorescenza tra la concentrazione di fluoroforo, photobleaching, intensità di illuminazione, la sensibilità della telecamera, il guadagno e tempo di esposizione. <ol><li> Collegare i 6 &quot;gabbia di aste al 1,5&quot; aste gabbia, per formare una coppia di 7.5 &quot;aste lunghe. Avvitare queste aste in una faccia dell&#39;unità specchio piega. Avvitare il 0,5&quot; aste in faccia opposta. Far scorrere il cubo gabbia sulle aste gabbia, tramite il basso due fori passanti. Avvitare le 2 &quot;aste in faccia lato del cubo gabbia (figura 1b). </li><li> Fissare la fotocamera a un piatto gabbia utilizzando un C-mount adattatore SM1. Fissare la piastra gabbia sul 0,5 &quot;aste gabbia, a filo con la faccia dell&#39;unità specchio piega. </li><li> Inserire l&#39;obiettivo &quot;tubo&quot; in un &quot;3 tubo lente lungo e sicuro l&#39;obiettivo con un anello di sicurezza. La lunghezza focale dell&#39;obiettivo dovrebbero essere selezionati in modo che il core della fibra ottica fascio sono campionati da almeno due pixel quando proiettato sulla fotocamera. Rilasciare il filtro per le emissioni nel tubo sulla parte superiore del primo anello di sostegno, e aggiungere un altro anello per fissare il filtro in posizione. Osservare la convenzione filtro orientamento indicato dal produttore del filtro. Avvitare il tubo lente nella parte del gabbia cubo più vicino alla fotocamera CCD. noti che nella figura 1c, questo obiettivo e filtro sono riportate senza il &quot;3 tubi lente per chiarezza. </li><li> Collegare la fotocamera a un computer e visualizzare l&#39;immagine sullo schermo. Diretto il gruppo telaio ad un oggetto distante e far scorrere il cubo gabbia lungo i binari fino a quando l&#39;immagine appare a fuoco. Bloccare il cubo gabbia in questa posizione. (Questo è un metodo semplice per garantire che la lente del tubo formerà una immagine messa a fuoco quando combinato con l&#39;infinità-corretti lente dell&#39;obiettivo). </li><li> Inserire lo specchio dicroico nel supporto e posto a 45 ° nel cubo gabbia. </li><li> Avvitare l&#39;obiettivo, attraverso un RMS per SM1 adattatore filettato e tubo lente regolabile, nella faccia del cubo gabbia di fronte al tubo porta-lente. A z-traduttore può essere usato al posto del tubo lente regolabile per facilitare la messa a fuoco. Vite di un connettore SMA in un piatto e montare questa gabbia sulle aste, a circa la distanza di lavoro della lente obiettiva. </li><li> Montare un LED su un piatto gabbia e far scorrere sulla fine del 2 &quot;aste. Aggiungere una lente ad un 0,5&quot; tubo lenti in modo che quando questo tubo è avvitato nel lato del cubo gabbia, formerà l&#39;immagine del LED che riempie l&#39;apertura posteriore della lente obiettiva. Questo (Kohler illuminazione) di configurazione in modo che la faccia prossimale del fascio di fibre ottiche è uniformemente illuminato. Aggiungere il filtro di eccitazione al &quot;0,5 tubo lente e fissarlo in posizione con un anello di sicurezza (figura 1c). </li><li> Collegare un connettore SMA ad un fascio di fibre ottiche. Avvitare il fascio di connettore SMA nella presa SMA montati sulle aste gabbia. Diretta l&#39;estremità distale del fascio verso una sorgente di luce a banda larga (illuminazione fluorescente è sufficiente) e osservare l&#39;immagine del volto fascio prossimale sulla fotocamera CCD. Regolare la posizione della lente obiettivo avvitando dentro o fuori del cubo gabbia fino a quando il fascio di fibre immagine appare a fuoco. I singoli core dovrebbe essere chiaramente visibile (Figura 2). </li></ol> 2. GRIN Lens Assemblea La risoluzione spaziale del microendoscope può essere aumentata collegando un micro-lente o gruppo ottico alla punta distale del fascio di fibre. Queste ottiche sono configurati in modo tale che invece di mettere la punta pacco direttamente sul tessuto, la punta è ripreso sulla superficie del tessuto con demagnification, aumentando così la frequenza spaziale di campionamento imposto dalla luce-guidnuclei zione del fascio di fibre. Il grado di demagnification corrisponde l&#39;aumento della risoluzione spaziale, e allo stesso tempo, ad una diminuzione proporzionale nel campo di vista. Componenti lente gradiente di indice (GRIN) sono compatibili con fibre ottiche e sono disponibili da GrinTech, NSG, Schott, tra gli altri, e può essere direttamente legato alla punta distale di un fascio di fibre. <ol><li> Seleziona una lente GRIN con l&#39;ingrandimento desiderato e distanza di lavoro per l&#39;applicazione. Assicurarsi che il diametro della lente è superiore a quella del fascio di fibre che si intende lavorare. È consigliabile che il fascio di fibre ottiche e lenti GRIN essere montato sui palcoscenici manuale separato 3-asse di posizionamento al microscopio a bassa potenza o stereoscopio per l&#39;allineamento preciso prima dell&#39;incollaggio. </li><li> Mettere una goccia di adesivo ottico (es. adesivi UV Noland cura) su entrambi l&#39;obiettivo o il viso fascio. Portare i due componenti in contatto utilizzando la posizionatori manuale. Esporre l&#39;interfaccia ai raggi UV per la dose raccomandata dal produttore. </li><li> Per proteggere la lente GRIN e all&#39;interfaccia collegata, un breve tratto di tubo in alluminio capillare (parti piccole Inc.) possono essere utilizzate per racchiudere il comune. Far scorrere il tubo sopra il giunto e fissarlo in posizione con resina epossidica. Guaina termorestringente può essere utilizzato per completare l&#39;assemblaggio. </li></ol> 3. Microendoscope Imaging <ol><li> Applicare il mezzo di contrasto alle cellule o tessuti da acquisire. Con proflavina (0,01% w / v in PBS), nella diagnostica per immagini in vitro di cellule in coltura può essere effettuata mediante incubazione breve (&lt;1 minuto) e un accurato risciacquo. Imaging di ex campioni di tessuto vivo o in tessuti in vivo è possibile dopo l&#39;applicazione topica del colorante. La diffusione delle proflavina in queste condizioni è stato trovato per essere quasi istantanea, con l&#39;imaging possibile in pochi secondi e duratura per diversi minuti. </li><li> Posizionare il fascio di fibre ottiche in leggero contatto con il campione da acquisire. Quando le cellule in coltura di imaging o ex campioni di tessuto vivo, è consigliato il montaggio della parte distale del fascio di fibre in un dispositivo di sicurezza con le fasi di posizionamento manuale sugli assi XYZ per la stabilità durante l&#39;imaging. </li></ol> 4. Rappresentante dei risultati: Quando assemblate correttamente, il microendoscope opererà come un epi-microscopio a fluorescenza, diffusa attraverso un coerente fibra ottica fascio. Per ottenere risultati ottimali di imaging, l&#39;attenzione dovrebbe essere rivolta a garantire che le tre condizioni fondamentali requisiti: <ol><li> La faccia prossimale del fascio di fibre dovrebbe essere ripreso sul CCD senza defocus, al fine di ottenere la risoluzione completa del sistema. Figura 2a, b, c dimostrare una porzione di un fascio di fibre ripreso con scarsa attenzione, defocus leggera e buona messa a fuoco, rispettivamente. La messa a fuoco ottimale si trova regolando la posizione assiale della lente obiettivo relativo al viso bundle. </li><li> La faccia prossimale del fascio di fibre dovrebbe essere uniformemente illuminata oltre il suo diametro totale (campo di vista). Come descritto nel testo del protocollo (1,7), ciò si ottiene mediante la configurazione delle ottiche di illuminazione per l&#39;illuminazione di Kohler. Figura 2d mostra un&#39;immagine acquisita quando un campione uniforme fluorescente è illuminato in questa configurazione preferita, con 2e figura dimostrando il corrispondente risultato in condizioni di illuminazione critiche. In quest&#39;ultimo caso, la struttura del LED è ripreso sul viso fascio di fibre, con la conseguente comparsa di questo modello indesiderate sovrapposto alla struttura del campione vero. </li><li> Entrambe le facce prossimale e distale del fascio di fibre devono essere pulite e prive di graffi e patatine. Figura 2f dimostra la presenza di detriti attacca alla faccia fagotto, con un danno sotto forma di un piccolo chip alle 5 sul perimetro fibra. Detriti possono essere rimossi dal fascio volti pulendo allo stesso modo come convenzionale connettori a fibre ottiche, con carta per lenti e isopropanolo, o standard in fibra ottica strumenti di pulizia. Se una delle estremità del fascio di fibre è graffiato o tagliato, o se il fascio rompe lungo la sua lunghezza, il volto può essere lucido piatto da manuale standard, o tecniche di lucidatura meccanica. Si consiglia di 12-15 micron lappatura della carta per una lucidatura iniziale ruvido, con un tocco finale su carta 0,5-1,0 micron. </li></ol> Figura 3a mostra immagini di 1483 cellule in vitro, a seguito di etichettatura con il posizionamento proflavina e la luce del fascio di fibre nude sul campione. Figura 3b mostra il miglioramento della risoluzione spaziale e la riduzione del campo di visualizzazione fornita da una lente GRIN 2.5x legato alla punta bundle. Movie 1 dimostra imaging in vivo del cuscinetto di grasso mammario in un modello murino. Qui, un fascio di fibre con 0,5 mm di diametro esterno (330 micron campo di vista) era passato attraverso un ago da 21 gauge e avanzato nel tessuto. Le cellule adipose sono ben visibili, con movimento a causa del ciclo cardiaco apparente in questa acquisizione a 15fotogrammi al secondo. Figura 3c mostra immagini della mucosa orale in un volontario sano, questa volta utilizzando un fascio di fibre più grande, con 1,5 mm di diametro esterno (1,4 mm campo di vista). In tutti gli esempi mostrati, proflavina è stato usato come agente di contrasto nucleare marcatura fluorescente. <img src="/files/ftp_upload/2306/2306fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Assemblaggio ad alta risoluzione microendoscope (HRME). (A) Schema del sistema HRME. (B) Montaggio della struttura principale di supporto optomechanical. (C) aggiunta di elementi ottici, illuminazione a LED, e camera CCD. (D) Fotografia del sistema HRME, confezionato in un 10 &quot;x 8&quot; x &quot;recinto 2.5. <img src="/files/ftp_upload/2306/2306fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Impostazione del HRME. Esempi di immagini con la fibra ottica in fascio (a) scarsa attenzione, (b) vicino ad una buona messa a fuoco, (c) messa a fuoco ideale. In (d), un obiettivo uniforme fluorescente all&#39;estremità distale del pacchetto è ripreso sotto Kohler (uniforme) illuminazione. (E) Un obiettivo uniforme fluorescenti ripreso in condizioni di illuminazione critiche, con la struttura sorgente apparente sull&#39;oggetto. (F) i tessuti e le cellule allentati possono aderire al viso fascio di fibre, che è anche soggetto a danni minori alla sua periferia. <img src="/files/ftp_upload/2306/2306fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Imaging con il HRME. (A) 1483 cellule in vitro, ripreso con un fascio di fibre nude (IGN-08/30) a seguito di etichettatura con proflavina 0,01% (w / v). (B) Lo stesso 1483 la coltura cellulare come mostrato in (a), ripreso con un fascio di fibre ottiche con lente GRIN 2.5x allegato. (C) Immagine di normale mucosa orale umana in vivo, a seguito di applicazione topica di proflavina 0,01% (w / v). Movie 1. Imaging il cuscinetto di grasso mammaria di un topo mediante inserimento di un bundle 450 diametro esterno in fibra di micron all&#39;interno del lume di una 21-gauge passato nel tessuto. Proflavina 0,01% (w / v) è stato consegnato al sito di immagini attraverso lo stesso ago prima dell&#39;inserimento della fibra di imaging. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2306/5-11-1 2306_Pierce_movie1.avi">Clicca qui per guardare il video</a>

<ol>
	<li>Pierce, M. C., Javier, D. J., Richards-Kortum, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+contrast+agents+and+imaging+systems+for+detection+and+diagnosis+of+cancer.">Optical contrast agents and imaging systems for detection and diagnosis of cancer.</a> Int. J. Cancer. 123, 1979-1990 (2008).</li><li>Muldoon, T. J., Pierce, M. C., Nida, D. L., Williams, M. D., Gillenwater, A., Richards-Kortum, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular-resolution+molecular+imaging+within+living+tissue+by+fiber+microendoscopy.">Subcellular-resolution molecular imaging within living tissue by fiber microendoscopy.</a> Opt. Express. 15, 16413-16423 (2007).</li><li>Muldoon, T. J., Anandasabapathy, S., Maru, D., Richards-Kortum, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+imaging+in+Barrett's+esophagus:+a+novel,+low-cost+endoscopic+microscope.">High-resolution imaging in Barrett's esophagus: a novel, low-cost endoscopic microscope.</a> Gastrointest. Endosc. 68, 737-744 (2008).</li><li>Muldoon, T. J., Thekkek, N., Roblyer, D., Maru, D., Harpaz, N., Potack, J., Anandasabapathy, S., Richards-Kortum, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+quantitative+image+analysis+criteria+for+the+high-resolution+microendoscopic+detection+of+neoplasia+in+Barrett's+esophagus.">Evaluation of quantitative image analysis criteria for the high-resolution microendoscopic detection of neoplasia in Barrett's esophagus.</a> J. Biomed. Opt. 15, 026027-026027 (2010).</li><li>Zhong, W., Celli, J. P., Rizvi, I., Mai, Z., Spring, B. Q., Yun, S. H., Hasan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+high-resolution+fluorescence+microendoscopy+for+ovarian+cancer+detection+and+treatment+monitoring.">In vivo high-resolution fluorescence microendoscopy for ovarian cancer detection and treatment monitoring.</a> Br. J. Cancer. 101, 2015-2022 (2009).</li><li>Dubaj, V., Mazzolini, A., Wood, A., Harris, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optic+fibre+bundle+contact+imaging+probe+employing+a+laser+scanning+confocal+microscope.">Optic fibre bundle contact imaging probe employing a laser scanning confocal microscope.</a> J. Microsc. 207, 108-117 (2002).</li><li>Dromard, T., Ravaine, V., Ravaine, S., L&#233;v&#234;que, J. -. L., Sojic, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+in+vivo+imaging+of+human+skin+corneocytes+by+means+of+an+optical+fiber+bundle.">Remote in vivo imaging of human skin corneocytes by means of an optical fiber bundle.</a> Rev. Sci. Inst. 78, 053709-05 (2007).</li><li>Udovich, J. A., Kirkpatrick, N. D., Kano, A., Tanbakuchi, A., Utzinger, U., Gmitro, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+background+and+transmission+characteristics+of+fiber+optic+imaging+bundles.">Spectral background and transmission characteristics of fiber optic imaging bundles.</a> Appl. Opt. 47, 4560-4568 (2008).</li><li>Barretto, R. P. J., Messerschmidt, B., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+fluorescence+imaging+with+high-resolution+microlenses.">In vivo fluorescence imaging with high-resolution microlenses.</a> Nat. Methods. 6, 511-512 (2009).</li><li>Rouse, A. R., Kano, A., Udovich, J. A., Kroto, S. M., Gmitro, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+demonstration+of+a+miniature+catheter+for+a+confocal+microendoscope.">Design and demonstration of a miniature catheter for a confocal microendoscope.</a> Appl. Opt. 43, 5763-5771 (2004).</li><li>Kester, R. T., Christenson, T., Richards-Kortum, R., Tkaczyk, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+cost,+high+performance,+self-aligning+miniature+optical+systems.">Low cost, high performance, self-aligning miniature optical systems.</a> Appl. Opt. 48, 3375-3384 (2009).</li></ol>

MP e DY non hanno nulla da rivelare. RRK detiene brevetti relativi a piattaforme di imaging microendoscopica.

La tecnica ad alta risoluzione microendoscopy qui descritta fornisce ricercatori nel campo della ricerca biomedica di base e clinica con un metodo flessibile, robusta e conveniente per la visualizzazione dei dettagli cellulari in situ. Abbiamo descritto un protocollo per il montaggio del sistema di imaging e dimostrato il suo impiego in colture cellulari in vitro e in animali e tessuti umani in vivo. Mentre i risultati delle immagini qui presentate proflavina usato come agente di contrasto fluorescente, altri gruppi hanno dimostrato le versioni del sistema di illuminazione a LED con lunghezze d&#39;onda e filtri scelti per abbinare eccitazione / emissione spettri di altri coloranti 5-7. Risoluzione e campo di vista sono inizialmente determinati dal core-to-core spaziatura e il diametro di imaging della fibra ottica fascio. Abbiamo utilizzato fasci di circa 4 micron nucleo-core spaziatura, l&#39;imaging e diametri di 330 micron (filmato 1), 720 micron (Figura 2, Figura 3a, b), e 1400 micron (Figura 3c). I fasci più piccoli che possono essere passate aghi calibro più stretto e sono molto più flessibili rispetto alle fibre più grandi. Noi e gli altri 8 hanno, in alcuni casi, ha osservato la comparsa di emissioni di autofluorescenza dalla fibra stessa bundle. Quando si tenta di eccitare fluorofori a lunghezze d&#39;onda UV, o raccogliere emissione nella gamma spettrale rosso, l&#39;attenzione dovrebbe essere prestata al livello di autofluorescenza fascio di fibre che contribuiscono al segnale complessivo misurato. Mentre la maggior parte del lavoro ad alta risoluzione microendoscopy segnalato fino ad oggi hanno utilizzato un fascio di fibre nudo, un ingrandimento extra può essere fornito da uso di lenti GRIN legato alla punta distale. Le lenti GRIN offrono un modo semplice ed economico per aumentare la risoluzione spaziale, anche se la loro suscettibilità alle aberrazioni ottiche e limitato NA è ben riconosciuta. Se l&#39;obiettivo delle prestazioni GRIN è inadeguata per una particolare applicazione, GRIN ibrido / obiettivi lente sferica 9 o in miniatura assemblee lenti dell&#39;obiettivo 10-11 può essere impiegato. L&#39;alta risoluzione microendoscope qui descritto essenzialmente funziona come un grande campo epi-microscopio a fluorescenza, quindi non sezionamento ottico (come in microscopia confocale o non lineare) deve essere previsto. Nella nostra esperienza, usando luce di eccitazione 455 nm e proflavina attualità come agente di contrasto, la luce è in primo luogo raccolto da una profondità corrispondente ad un paio di strati di cellule. Questo protocollo deve permettere al lettore di assemblaggio ad alta risoluzione microendoscope sul bancone, con un ingombro compatto di 10 &quot;x 8&quot;. Se lo si desidera, il sistema può essere racchiuso in una scatola ed i componenti elettrici (LED e telecamera) alimentato da un pacco batteria (Figura 1d). Molte fotocamere compatte può essere alimentato da IEEE-1394 (Firewire) e le porte USB del computer host.

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>CCD camera</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Point Grey Research</td>
<td>GRAS-14S5M</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LED</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thorlabs</td>
<td>M455L2</td>
<td>Selected for use with proflavine &#x2013; other fluorophores may require different parts</td>
</tr>
<tr>
<td>Excitation filter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Semrock</td>
<td>452/45</td>
<td>Selected for use with proflavine &#x2013; other fluorophores may require different parts</td>
</tr>
<tr>
<td>Emission filter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Semrock</td>
<td>550/88</td>
<td>Selected for use with proflavine &#x2013; other fluorophores may require different parts</td>
</tr>
<tr>
<td>Dichroic mirror</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Chroma</td>
<td>485 DCLP</td>
<td>Selected for use with proflavine &#x2013; other fluorophores may require different parts</td>
</tr>
<tr>
<td>Objective lens</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thorlabs (Olympus)</td>
<td>RMS 10X</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tube lens</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thorlabs</td>
<td>AC-254-150-A1</td>
<td>Select focal length to achieve required magnification to CCD</td>
</tr>
<tr>
<td>Condenser lens</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thorlabs</td>
<td>ACL2520</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cage cube unit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thorlabs</td>
<td>C6W, B1C, B3C, B5C, SM1CP2</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cage rods and plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thorlabs</td>
<td>ER05 (x4), ER1.5 (x2), ER2 (x2), ER6 (x2), CP02 (x3)</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fold mirror unit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thorlabs</td>
<td>KCB1, PF10-03-G01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lens tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thorlabs</td>
<td>SM1L05, SM1L30, SM1V05 (or SM1Z)</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Adapters / couplers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thorlabs</td>
<td>SM1A3, SM1A9, SM1T2 (x2)</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SMA connectors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thorlabs</td>
<td>SM1SMA, 11040A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LED driver</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thorlabs</td>
<td>LEDD1B TPS001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fiber optic bundle</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sumitomo</td>
<td>IGN-08/30</td>
<td>Larger or smaller bundles are available (Sumitomo / Fujikura)</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

high-resolution fiber-optic microendoscopy for in situ cellular imaging

Molti studi biologici e clinici richiedono lo studio longitudinale e l&#39;analisi della morfologia e funzione con risoluzione a livello cellulare. Tradizionalmente, gli esperimenti multipli sono in parallelo, con singoli campioni rimosso dallo studio in momenti sequenziali per la valutazione al microscopio ottico. Intravitale diverse tecniche sono state sviluppate, con confocale, multiphoton, e secondo microscopia armonica tutti dimostrando la loro capacità di essere utilizzato per l&#39;imaging in situ 1. Con questi sistemi, tuttavia, la cosa è tecnicamente complessa e costosa, che coinvolgono i sistemi di scansione laser e complessi sorgenti luminose. Qui vi presentiamo un protocollo per la progettazione e l&#39;assemblaggio di una ad alta risoluzione microendoscope che può essere costruita in un giorno con off-the-shelf componenti per meno di US $ 5.000. La piattaforma offre flessibilità in termini di risoluzione, campo di vista, e la lunghezza d&#39;onda di funzionamento, e viene descritto come questi parametri possono essere facilmente modificato per soddisfare le esigenze specifiche dell&#39;utente finale. Noi e gli altri hanno esplorato l&#39;utilizzo del microendoscope ad alta risoluzione (HRME) in coltura cellulare in vitro 2-5, in 6 asportato e tessuti animali che vivono 2,5, e nei tessuti umani in vivo 2,7. Gli utenti hanno segnalato l&#39;uso di diversi agenti di contrasto fluorescente, tra cui proflavina 2-4, benzoporfirina derivate anello monoacid A (BPD-MA) 5, e fluoroscein 6,7, che hanno ricevuto pieno, o l&#39;approvazione sperimentale da parte della FDA per l&#39;uso in soggetti umani. Ad alta risoluzione microendoscopy, nella forma descritta qui, può fare appello ad una vasta gamma di ricercatori che lavorano nel campo delle scienze di base e clinica. La tecnica offre un approccio efficace ed economica che integra microscopia tradizionali da banco, permettendo all&#39;utente di eseguire ad alta risoluzione, immagini longitudinale in situ.

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High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

In molte situazioni biologici e clinici è vantaggioso per lo studio dei processi cellulari, come si evolvono nel loro microambiente nativo. Qui si descrive il montaggio e l&#39;uso di un basso costo in fibra ottica microscopio in grado di fornire immagini in tempo reale in coltura cellulare, studi su animali e studi clinici del paziente.

Ad alta risoluzione in fibra ottica per Microendoscopy In situ Cellular Imaging

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution.  ...

high-resolution-fiber-optic-microendoscopy-for-situ-cellular

Research

JoVE Journal

Bioengineering

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

34.3K Views.  Rice University. In molte situazioni biologici e clinici è vantaggioso per lo studio dei processi cellulari, come si evolvono nel loro microambiente nativo. Qui si descrive il montaggio e l'uso di un basso costo in fibra ottica microscopio in grado di fornire immagini in tempo reale in coltura cellulare, studi su animali e studi clinici del paziente.

Video: High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized tomography (&mu;CT).
High resolution &mu;CT is a very versatile yet accurate (1-2 microns of resolution) technique for 3D examination of ex-vivo biological samples1, 2. As opposed to electron tomography, the &mu;CT allows the examination of up to 4 cm thick samples. This technique requires only few hours of measurement as compared to weeks in histology. In addition, &mu;CT does not rely on 2D stereologic models, thus it may complement and in some cases can even replace histological methods3, 4, which are both time consuming and destructive. Sample conditioning and positioning in &mu;CT is straightforward and does not require high vacuum or low temperatures, which may adversely affect the structure. The sample is positioned and rotated 180&deg; or 360&deg;between a microfocused x-ray source and a detector, which includes a scintillator and an accurate CCD camera, For each angle a 2D image is taken, and then the entire volume is reconstructed using one of the different available algorithms5-7. The 3D resolution increases with the decrease of the rotation step. The present video protocol shows the main steps in preparation, immobilization and positioning of the sample followed by imaging at high resolution.

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized tomography ( CT).

Ad alta risoluzione di immagini 3D Ex-Vivo I campioni biologici da Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized ...

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Video-rate Scanning Confocal Microscopy and Microendoscopy

Confocal microscopy has become an invaluable tool in biology and the biomedical sciences, enabling rapid, high-sensitivity, and high-resolution optical sectioning of complex systems. Confocal microscopy is routinely used, for example, to study specific cellular targets1, monitor dynamics in living cells2-4, and visualize the three dimensional evolution of entire organisms5,6. Extensions of confocal imaging systems, such as confocal microendoscopes, allow for high-resolution imaging in vivo7 and are currently being applied to disease imaging and diagnosis in clinical settings8,9.
Confocal microscopy provides three-dimensional resolution by creating so-called "optical sections" using straightforward geometrical optics. In a standard wide-field microscope, fluorescence generated from a sample is collected by an objective lens and relayed directly to a detector. While acceptable for imaging thin samples, thick samples become blurred by fluorescence generated above and below the objective focal plane. In contrast, confocal microscopy enables virtual, optical sectioning of samples, rejecting out-of-focus light to build high resolution three-dimensional representations of samples.
Confocal microscopes achieve this feat by using a confocal aperture in the detection beam path. The fluorescence collected from a sample by the objective is relayed back through the scanning mirrors and through the primary dichroic mirror, a mirror carefully selected to reflect shorter wavelengths such as the laser excitation beam while passing the longer, Stokes-shifted fluorescence emission. This long-wavelength fluorescence signal is then passed to a pair of lenses on either side of a pinhole that is positioned at a plane exactly conjugate with the focal plane of the objective lens. Photons collected from the focal volume of the object are collimated by the objective lens and are focused by the confocal lenses through the pinhole. Fluorescence generated above or below the focal plane will therefore not be collimated properly, and will not pass through the confocal pinhole1, creating an optical section in which only light from the microscope focus is visible. (Fig 1). Thus the pinhole effectively acts as a virtual aperture in the focal plane, confining the detected emission to only one limited spatial location.
Modern commercial confocal microscopes offer users fully automated operation, making formerly complex imaging procedures relatively straightforward and accessible. Despite the flexibility and power of these systems, commercial confocal microscopes are not well suited for all confocal imaging tasks, such as many in vivo imaging applications. Without the ability to create customized imaging systems to meet their needs, important experiments can remain out of reach to many scientists.
In this article, we provide a step-by-step method for the complete construction of a custom, video-rate confocal imaging system from basic components. The upright microscope will be constructed using a resonant galvanometric mirror to provide the fast scanning axis, while a standard speed resonant galvanometric mirror will scan the slow axis. To create a precise scanned beam in the objective lens focus, these mirrors will be positioned at the so-called telecentric planes using four relay lenses. Confocal detection will be accomplished using a standard, off-the-shelf photomultiplier tube (PMT), and the images will be captured and displayed using a Matrox framegrabber card and the included software.

The complete construction of a custom, real-time confocal scanning imaging system is described. This system, which can be readily used for video-rate microscopy and microendoscopy, allows for an array of imaging geometries and applications not accessible using standard commercial confocal systems, at a fraction of the cost.

Video-tasso di Microscopia confocale e scansione Microendoscopy

Confocal microscopy has become an invaluable tool in biology and the biomedical sciences, enabling rapid, high-sensitivity, and high-resolution optical ...

Continuous High-resolution Microscopic Observation of Replicative Aging in Budding Yeast

We demonstrate the use of a simple microfluidic setup, in which single budding yeast cells can be tracked throughout their entire lifespan. The microfluidic chip exploits the size difference between mother and daughter cells using an array of micropads. Upon loading, cells are trapped underneath these micropads, because the distance between the micropad and cover glass is similar to the diameter of a yeast cell (3-4 &mu;m). After the loading procedure, culture medium is continuously flushed through the chip, which not only creates a constant and defined environment throughout the entire experiment, but also flushes out the emerging daughter cells, which are not retained underneath the pads due to their smaller size. The setup retains mother cells so efficiently that in a single experiment up to 50 individual cells can be monitored in a fully automated manner for 5 days or, if necessary, longer. In addition, the excellent optical properties of the chip allow high-resolution imaging of cells during the entire aging process.

We describe here the operation of a microfluidic device that allows continuous and high-resolution microscopic imaging of single budding yeast cells during their complete replicative and/or chronological lifespan.

Continuo ad alta risoluzione osservazione microscopica di replicativo invecchiamento nel lievito germogliante

We demonstrate the use of a simple microfluidic setup, in which single budding yeast cells can be tracked throughout their entire lifespan. The ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., kinetics, coexistence of different states and populations, transient interactions), which are typically hidden in ensemble measurements, such as those obtained with standard biochemical or microscopy methods. Thus, dynamic events, such as receptor-receptor interactions, can be followed in real time in a living cell with high spatiotemporal resolution. This protocol describes a method based on labeling with small and bright organic fluorophores and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize single receptors on the surface of living cells. This approach allows one to precisely localize receptors, measure the size of receptor complexes, and capture dynamic events such as transient receptor-receptor interactions. The protocol provides a detailed description of how to perform a single-molecule experiment, including sample preparation, image acquisition and image analysis. As an example, the application of this method to analyze two G-protein-coupled receptors, i.e., &#946;2-adrenergic and &#947;-aminobutyric acid type B (GABAB) receptor, is reported. The protocol can be adapted to other membrane proteins and different cell models, transfection methods and labeling strategies.

This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins.

Ad alta risoluzione Spatiotemporal Analisi del recettore Dynamics per singola molecola di microscopia a fluorescenza

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction with other compounds, such as drugs or peptides. However SLB characteristics differ depending on the support used. 
Commonly used techniques for SLB imaging and measurements are single molecule fluorescence microscopy, FCS and atomic force microscopy (AFM). Because most optical imaging studies are carried out on a glass support, while AFM requires an extremely flat surface (generally mica), results from these techniques cannot be compared directly, since the charge and smoothness properties of these materials strongly influence diffusion. Unfortunately, the high level of manual dexterity required for the cutting and gluing thin slices of mica to the glass slide presents a hurdle to routine use of mica for SLB preparation. Although this would be the method of choice, such prepared mica surfaces often end up being uneven (wavy) and difficult to image, especially with small working distance, high numerical aperture lenses. Here we present a simple and reproducible method for preparing thin, flat mica surfaces for lipid vesicle deposition and SLB preparation. Additionally, our custom made chamber requires only very small volumes of vesicles for SLB formation. The overall procedure results in the efficient, simple and inexpensive production of high quality lipid bilayer surfaces that are directly comparable to those used in AFM studies.

We present a method of preparing mica supported lipid bilayers for high resolution microscopy. Mica is transparent and flat on an atomic scale, but rarely used in imaging because of handling difficulties; our preparation results in even deposition of the mica sheet, and reduces the material used in bilayer preparation.

Preparazione di Mica supportati doppi strati lipidici per alta risoluzione microscopia ottica Imaging

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

Multimodal Imaging and Spectroscopy Fiber-bundle Microendoscopy Platform for Non-invasive, In Vivo Tissue Analysis

Recent fiber-bundle microendoscopy techniques enable non-invasive analysis of in vivo tissue using either imaging techniques or a combination of spectroscopy techniques. Combining imaging and spectroscopy techniques into a single optical probe may provide a more complete analysis of tissue health. In this article, two dissimilar modalities are combined, high-resolution fluorescence microendoscopy imaging and diffuse reflectance spectroscopy, into a single optical probe. High-resolution fluorescence microendoscopy imaging is a technique used to visualize apical tissue micro-architecture and, although mostly a qualitative technique, has demonstrated effective real-time differentiation between neoplastic and non-neoplastic tissue. Diffuse reflectance spectroscopy is a technique which can extract tissue physiological parameters including local hemoglobin concentration, melanin concentration, and oxygen saturation. This article describes the specifications required to construct the fiber-optic probe, how to build the instrumentation, and then demonstrates the technique on in vivo human skin. This work revealed that tissue micro-architecture, specifically apical skin keratinocytes, can be co-registered with its associated physiological parameters. The instrumentation and fiber-bundle probe presented here can be optimized as either a handheld or endoscopically-compatible device for use in a variety of organ systems. Additional clinical research is needed to test the viability of this technique for different epithelial disease states.

Multimodal Imaging and Spectroscopy Fiber-bundle Microendoscopy Platform for Non-invasive, In Vivo Tissue Analysis

The assembly and use of a multimodal microendoscope is described which can co-register superficial tissue image data with tissue physiological parameters including hemoglobin concentration, melanin concentration, and oxygen saturation. This technique can be useful for evaluating tissue structure and perfusion, and can be optimized for individual needs of the investigator.

Imaging Multimodale e la piattaforma Microendoscopy Spettroscopia Fiber-fascio per non invasiva,<em&gt; In Vivo</em&gt; Analisi dei tessuti

Recent fiber-bundle microendoscopy techniques enable non-invasive analysis of in vivo tissue using either imaging techniques or a combination of ...

Proper Positioning and Restraint of a Rat Hind Limb for Focused High Resolution Imaging of Bone Micro-architecture Using In Vivo Micro-computed Tomography

The use of in vivo micro-computed tomography (&#181;CT) is a powerful tool which involves the non-destructive imaging of internal structures at high resolutions in live animal models. This allows for repeated imaging of the same rodent over time. This feature not only reduces the total number of rodents required in an experimental design and thereby reduces the inter-subject variation that can arise, but also allows researchers to assess longitudinal or life-long responses to an intervention. To acquire high quality images that can be processed and analyzed to more accurately quantify outcomes of bone micro-architecture, users of in vivo &#181;CT scanners must properly anesthetize the rat, and position and restrain the hind limb. To do this, it is imperative that the rat be anesthetized to a level of complete relaxation, and that pedal reflexes are lost. These guidelines may be modified for each individual rat, as the rate of isoflurane metabolism can vary depending on strain and body size. Proper technique for in vivo &#181;CT image acquisition enables accurate and consistent measurement of bone micro-architecture within and across studies.

Proper Positioning and Restraint of a Rat Hind Limb for Focused High Resolution Imaging of Bone Micro-architecture Using In Vivo Micro-computed Tomography

This paper instructs users of in vivo micro-computed tomography (&#181;CT) scanners how to anesthetize, correctly position and restrain the hind limb of a rat for minimal movement during high-resolution imaging of the tibia. The result is high quality images that can be processed to accurately quantify bone micro-architecture.

Corretto posizionamento e trattenuta di un ratto dell'arto per l'Imaging mirato ad alta risoluzione dell'osso utilizzando Micro-architettura In Vivo Micro-tomografia computerizzata

The use of in vivo micro-computed tomography (&#181;CT) is a powerful tool which involves the non-destructive imaging of internal structures at high ...

Optimized Setup and Protocol for Magnetic Domain Imaging with In Situ Hysteresis Measurement

This paper elaborates the sample preparation protocols required to obtain optimal domain patterns using the Bitter method, focusing on the extra steps compared to standard metallographic sample preparation procedures. The paper proposes a novel bespoke rig for dynamic domain imaging with in situ BH (magnetic hysteresis) measurements and elaborates the protocols for the sensor preparation and the use of the rig to ensure accurate BH measurement. The protocols for static and ordinary dynamic domain imaging (without in situ BH measurements) are also presented. The reported method takes advantage of the convenience and high sensitivity of the traditional Bitter method and enables in situ BH measurement without interrupting or interfering with the domain wall movement processes. This facilitates establishing a direct and quantitative link between the domain wall movement processes&#8211;microstructural feature interactions in ferritic steels with their BH loops. This method is anticipated to become a useful tool for the fundamental study of microstructure&#8211;magnetic property relationships in steels and to help interpret the electromagnetic sensor signals for non-destructive evaluation of steel microstructures.

Optimized Setup and Protocol for Magnetic Domain Imaging with In Situ Hysteresis Measurement

This paper elaborates the sample and sensor preparation procedures and the protocols for using the test rig particularly for dynamic domain imaging with in situ BH measurements in order to achieve optimal domain pattern quality and accurate BH measurements.

Installazione ottimizzata e protocollo per l'Imaging di dominio magnetico con In Situ isteresi misura

This paper elaborates the sample preparation protocols required to obtain optimal domain patterns using the Bitter method, focusing on the extra steps ...

High Resolution 3D Imaging of the Human Pancreas Neuro-insular Network

Using traditional histological methods, researchers are hampered in their ability to image whole tissues or organs in large-scale 3D. Histological sections are generally limited to &#60;20 &#181;m as formalin fixed paraffin section on glass slides or &#60;500 &#181;m for free-floating fixed sections. Therefore, extensive efforts are required for serial sectioning and large-scale image reconstruction methods to recreate 3D for samples &#62;500 &#181;m using traditional methods. In addition, light scatters from macromolecules within tissues, particularly lipids, prevents imaging to a depth &#62;150 &#181;m with most confocal microscopes. To reduce light scatter and to allow for deep tissue imaging using simple confocal microscopy, various optical clearing methods have been developed that are relevant for rodent and human tissue samples fixed by immersion. Several methods are related and use protein crosslinking with acrylamide and tissue clearing with sodium dodecyl sulfate (SDS). Other optical clearing techniques used various solvents though each modification had various advantages and disadvantages. Here, an optimized passive optical clearing method is described for studies of the human pancreas innervation and specifically for interrogation of the innervation of human islets.

Here, we present a protocol to image human pancreas sections in three dimensions (3D) using optimized passive clearing methods. This manuscript demonstrates these procedures for passive optical clearing followed by multiple immunofluorescence staining to identify key elements of the autonomic and sensory neural networks innervating human islets.

Immagini 3D ad alta risoluzione della rete Neuro-insulari Pancreas umano

Using traditional histological methods, researchers are hampered in their ability to image whole tissues or organs in large-scale 3D. Histological ...

High-resolution Patterned Biofilm Deposition Using pDawn-Ag43

Spatial structure and patterning play an important role in bacterial biofilms. Here we demonstrate an accessible method for culturing E. coli biofilms into arbitrary spatial patterns at high spatial resolution. The technique uses a genetically encoded optogenetic construct&#8212;pDawn-Ag43&#8212;that couples biofilm formation in E. coli to optical stimulation by blue light. We detail the process for transforming E. coli with&#160;pDawn-Ag43, preparing the required optical set-up, and the protocol for culturing patterned biofilms using pDawn-Ag43 bacteria. Using this protocol, biofilms with a spatial resolution below 25 &#956;m can be patterned on various surfaces and environments, including enclosed chambers, without requiring microfabrication, clean-room facilities, or surface pretreatment. The technique is convenient and appropriate for use in applications that investigate the effect of biofilm structure, providing tunable control over biofilm patterning. More broadly, it also has potential applications in biomaterials, education, and bio-art.

We demonstrate a method for depositing Escherichia coli bacterial biofilms in arbitrary spatial patterns with a high resolution using optical stimulation of a genetically encoded surface-adhesion construct.

Alta risoluzione svevapacifico modellato mediante deposizione di Biofilm-Ag43

Spatial structure and patterning play an important role in bacterial biofilms. Here we demonstrate an accessible method for culturing E. coli biofilms ...