Ringraziamo Alan Tasker (USDA-APHIS, Riverdale, MD), Stephen Compton (Clemson), Sherry Aultman (Clemson), Craig Ramsey (USDA-APHIS, Fort Collins, CO), e Betty Marose (UMD) per l&#39;assistenza per l&#39;ottenimento campioni . Ringraziamo gli studenti Andrew Adrian (UA-Huntsville) e Derek Thacker (UA-Huntsville) per la loro assistenza nel testare questo protocollo, e Giuseppe Herdy per il suo lavoro nelle riprese del video. Questo lavoro è stato finanziato dal National Fish e Wildlife Foundation.

1. Raccolta e Conservazione Questo metodo è stato sviluppato e testato utilizzando freschi, congelati e tessuti fogliari di recente secchi. <ol><li> Identificare cogongrass e / o JBG tessuti con l&#39;aiuto di un tassonomista specializzata nell&#39;identificazione delle specie erba. Con le sue foglie di colore rosso vivo, JBG ornamentale è facile distinguere visivamente da wild-type cogongrass e JBG tornare, tuttavia, cogongrass e JBG tornare sono quasi indistinguibili gli uni dagli altri. Cogongrass e il fenotipo JBG hanno ripristinato verdi, foglie, rizomi molto più grandi e più a lungo, e l&#39;area fogliare più di JBG 12 (Figura 1). </li><li> Tessuto fogliare Fresh offre il DNA qualità più abbondante e più alto e può essere raccolto dal campo o serra cresciuta I. cylindrica piante. Se il tessuto fresco deve essere utilizzato, estrarre il DNA entro 3 ore dalla raccolta per aiutare a prevenire il degrado. Altrimenti, preparare il tessuto per lo stoccaggio, keeping il tessuto fresco e dalla luce solare diretta. </li><li> Per memorizzare i tessuti di estrazione del DNA in una data successiva, il metodo più ottimale è di congelare il tessuto e conservare a -80 ° C immediatamente. Non permettere che il tessuto congelato a scongelare prima dell&#39;estrazione del DNA. Trasferire il tessuto congelato in azoto liquido prima delle fasi di macinazione di estrazione del DNA per evitare lo scongelamento. </li><li> Se un congelatore a -80 ° C non è disponibile, asciutto il tessuto immediatamente. Per lo stoccaggio secco, posizionare il tessuto in una busta di carta e memorizzare la busta in gel di silice disidratati o altri materiali essiccanti attivi a temperatura ambiente. Una piccola quantità di silice indicatore misto a non indica silice garantirà che la silice è completamente disidratato e adatto essiccazione tessuti vegetali. </li><li> Utilizzare almeno 10 volte superiore a gel di silice tessuto della foglia fresca in peso. Tessuto vegetale deve asciugare entro 24 ore. La qualità e la quantità di DNA viene ridotto mediante stoccaggio a secco nel tempo (come nel caso del campione erbarios). </li></ol> 2. Estrazione del DNA Per estrarre il DNA da tessuto vegetale, seguire la DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA; Cat # 69104 o 69106) le istruzioni del produttore con una modifica minore. Invece di utilizzare il suggerito meno di 100 mg di tessuto fresco o inferiore a 20 mg di tessuto secco, per ciascuna colonna, macinare superiore a 100 mg, e poi trasferire 100 mg di tessuto fresco o congelato (o&gt; 20 mg di tessuto asciutto) idonee provette per l&#39;estrazione. DNA nucleare e plastidio viene estratto simultaneamente. <ol><li> Prima di iniziare queste procedure, verificare che l&#39;etanolo è stato aggiunto al buffer AP3 / E e AW. </li><li> Macinare&gt; 100 mg di tessuto fogliare fresche o congelate (o&gt; 20 mg di tessuto fogliare secca) di una polvere fine con tre cicli di macinazione con azoto liquido in un mortaio e pestello refrigerati. Interruzione insufficiente del materiale di partenza o lisi insufficiente possono anche determinare una riduzione dei rendimenti di DNA. Con attenzione macinare il TISSue e non sovraccaricare le colonne con i tessuti troppo. </li><li> Trasferire 100 mg di polvere congelata da tessuto fresco o congelato (o 20 mg di polvere secca da tessuto) in una provetta da 1,5 ml contenente 400 pl di tampone AP1 e 4 pl di RNasi A. Ogni tubo può essere collocato in un rack su un piccolo equilibrio per monitorare il peso corretto del tessuto per provetta. </li><li> Campione Vortex o shake (s) per miscelare e incubare per 10 min a 65 ° C, invertendo il tubo (s) 2-3 volte durante l&#39;incubazione. </li><li> Aggiungere 130 ul di tampone AP2 a ciascun campione. Miscelare capovolgendo la provetta (s) più volte, e incubare per 5 min in ghiaccio. </li><li> Pipettare ogni lisato in una colonna separata rotazione Mini QIAshredder, e posizionare ogni colonna in un tubo di raccolta 2 ml (fornito con il kit). Centrifuga colonna (s) per 2 min a 20000 g (circa 14000 rpm), e trasferire ogni flusso-through frazione in un nuovo tubo (non fornito con il kit) senza interrompere alcuna forma pellet. </li><li> Aggiungere 1,5 volumi di Buffer AP3 /E, e mescolare pipettaggio. </li><li> Trasferire 650 ul di miscela in una colonna DNeasy giro Mini in una provetta 2 ml di raccolta. Centrifuga colonna (s) per 1 min a 6.000 g (~ 8000 rpm), ed eliminare il flusso-through. Ripetere questo passaggio con l&#39;impasto rimanente per ogni campione. </li><li> Porre la colonna spin (s) in un nuovo tubo di raccolta 2 ml (s), e aggiungere 500 microlitri di Buffer AW alla parte superiore di ogni colonna. Centrifuga colonna (s) per 1 min a 6.000 xg (~ 8000 rpm), e scartare flusso passante. </li><li> Aggiungere 500 pl di un tampone AW alla parte superiore di ciascuna colonna. Centrifugare per 2 min a 20000 g (circa 14000 rpm). Questo passaggio asciugare la colonna, eliminando così qualsiasi etanolo residua contenuta nel buffer che possono inibire PCR. </li><li> Trasferire ogni colonna di selezione per una nuova provetta da microcentrifuga 1,5 ml. Aggiungere 100 pl AE Buffer all&#39;inizio di ogni colonna di eluizione, e incubare colonna (s) per 5 min a temperatura ambiente. Centrifuga colonna (s) per 1 min a 6.000 xg (circa 8000 rpm) per raccogliere il DNA. </li><li> Ripetere questi passaggi eluizione una volta, eluendo il DNA nella stessa provetta 1,5 ml per microcentrifuga per dare 200 pl di campione. I campioni di DNA Conservare a -20 ° C fino all&#39;uso. Concentrazioni di DNA dipendono dal tipo di tessuto e le condizioni di conservazione. Rese ottimali si ottengono quando eluendo DNA con un totale di 200 pl di tampone AE, tuttavia, le concentrazioni può essere aumentato se volumi di eluizione vengono ridotte a un minimo di 50 pl. </li></ol> 3. Verifica della qualità e quantità del DNA <ol><li> Testare la qualità e la quantità di DNA estratto prima configurazione PCR utilizzando uno spettrofotometro o fluorometro e elettroforesi su gel. Ciò contribuirà a garantire il successo delle fasi successive. </li><li> Utilizzando uno, spettrofotometro qualità e quantità del DNA di prova. Buone rese DNA dovrebbe essere tra 50 e 150 ng / ml con 260/280 e 230/280 rapporto vicino a 2,0. Come esempio, la Figura 2 mostra risultati di buona qualità utilizzando lo spettrofotometro NanoDrop (ThermoScientific,<html> Wilmington, DE). </li><li> Effettuare elettroforesi utilizzando uno standard di gel di agarosio all&#39;1%. Verificare la presenza di bande relativamente grandi (&gt; 10 Kb) senza striature di poco da contaminazione RNA (Figura 3). </li><li> Se la concentrazione di DNA è alta, campioni di DNA diluiti a 70 ng / pl per le fasi successive. </li></ol> 4. Primer PCR I primer PCR usati in questo protocollo si basano sulle differenze di sequenza tra il plastidio trnL-F regione spacer di genotipi cogongrass e JBG. Queste differenze si presentano sotto forma di SNP (polimorfismi a singolo nucleotide) e indels (Inserimenti ed eliminazioni) che hanno permesso lo sviluppo di varietà di primer specifici, individuando i primer nei siti di sequenze uniche (Figura 4). <ol><li> La qualità dei primer può avere un impatto significativo sui risultati PCR. Primer ordine da una società rispettabile. Ordiniamo i nostri primer da Oblique Bio, Inc. (:/ / Www.obliquebio.com/web/ &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; http://www.obliquebio.com/web/, Huntsville, AL), richiedendo solo procedure standard dissalazione. </li><li> trnL-F primer di controllo positivi: Questa serie di primer amplifica il plastidio trnL-F regione distanziatore di taxa più erba 11-13 e serve come un buon controllo positivo (risultante in una banda di 890 bp). <table border="1"><tbody><tr><td> Nome </td><td> Sequenza </td></tr><tr><td> TRNF (GAA)-F </td><td> 5&#39;-ATTTGAACTGGTGACACGAG-3 &#39; </td></tr><tr><td> trnL (5 &#39;esone)-C </td><td> 5&#39;-CGAAATCGGTAGACGCTACG-3 &#39; </td></tr></tbody></table></li><li> Wild-type primers cogongrass: Questa serie di primer è specifico per cogongrass e non amplificare il trnL-F regione JBG genotipi. I risultati esposti in una band che è 595 bp. <table border="1"><tbody><tr><td> Nome </td><td> Sequence </td></tr><tr><td> trnLF-C-F1 </td><td> 5&#39;-TCCACTTTTTTGAAAAAACAAGTGCAA-3 &#39; </td></tr><tr><td> trnLF-C-R1 </td><td> 5&#39;-GCCGATACTCTAATAAATAAAAAAAAAAAAGAAAT-3 &#39; </td></tr></tbody></table></li><li> JBG e JBG Revert primers: Questo set di primer specifico per JBG genotipo e non amplifica il trnL-F regione cogongrass. I risultati esposti in una band che è di 594 bp. <table border="1"><tbody><tr><td> Nome </td><td> Sequenza </td></tr><tr><td> trnLF-R-F2 </td><td> 5&#39;-CCAAATCCACTTTTTTGAAAAAACAAGTGGTT-3 &#39; </td></tr><tr><td> trnLF-R-R2 </td><td> 5&#39;-CGAGATTCCTTGCCGATACTCTAATAAAA-3 &#39; </td></tr></tbody></table></li><li> Risospendere ciascun primer in un volume sufficiente di nucleasi libera ddh 2 O per ottenere una soluzione stock di 100 mm che possono essere conservati a -20 ° C, a lungo termine. </li><li> Diluire ogni stock innesco a 12 mm prima delle operazioni di messa in PCR. </li></ol> 5. PCR Setup Estrazioni DNA sono amplificate utilizzando ciascuna delle serie di primer sopra nelle reazioni PCR. Includere un controllo positivo per assicurare che tutti i reagenti PCR stanno lavorando bene e in grado di generare una band. Includere un controllo negativo per garantire che nessuno dei reagenti sono contaminati con il DNA indesiderato. Il controllo negativo contiene no-modello e dovrebbe portare a nessuna produzione band. <ol><li> Preparare tutte le reazioni a tubi con pareti sottili PCR per consentire il trasferimento del calore tra il blocco termociclatore e il campione. Si consiglia di utilizzare commercialmente disponibili aerosol privi di punte di pipetta per evitare la contaminazione. </li><li> Per ciascun campione di DNA isolato, costituito da 50 pl reazioni PCR utilizzando ciascuno dei set di primer di cui sopra in 0,2 ml parete sottile provette PCR aggiungendo i seguenti reagenti on Ice nell&#39;ordine elencato di seguito. Se più campioni vengono preparati, un cocktail contenente tutti i reagenti trannedello stampo di DNA a stabilire condizioni uniformi tra tutte le reazioni. <table border="1"><tbody><tr><td> PCR Reagente </td><td> Volume Usato </td><td> Concentramento finale </td></tr><tr><td> Priva di nucleasi ddh 2 O </td><td> 40,5 pl </td><td></td></tr><tr><td> Vantaggio 2 10X PCR Buffer (Clonetech, CA) </td><td> 5,0 pl </td><td> 10% (v / v) </td></tr><tr><td> Advantage ultrapura PCR dNTP Mix (10 mm ciascuno, Clonetech, CA) </td><td> 1,0 pl </td><td> 0,2 mM </td></tr><tr><td> Primer 1 (12μM in ddh 2 O) </td><td> 1,0 pl </td><td> 0.24 pM </td></tr><tr><td> Primer 2 (12μM in ddh 2 O) </td><td> 1,0 pl </td><td> 0.24 pM </td></tr><tr><td> Vantaggio 2 Mix polimerasi (Clonetech, CA) </td><td> 0,5 pl </td><td> 1% (v / v) </td></tr><tr><td> Estrazione del DNA(70 ng / reazione, regolare il volume ddh 2 O, se necessario) </td><td> 1,0 pl </td><td> 1,4 ng / ul </td></tr><tr><td></td><td> Totale: 50,0 pl </td><td></td></tr></tbody></table></li><li> Per garantire che tutti i reagenti PCR stanno funzionando bene, impostare il controllo positivo utilizzando i primer di controllo positivo. Questo set di fondo funziona altrettanto bene per cogongrass, JBG, JBG ripristinare e altre erbe e si tradurrà in una band che è 890 bp. </li><li> Impostare il controllo negativo utilizzando il primer di controllo stessa impostato come controllo positivo, utilizzando ddh 2 O invece l&#39;estrazione del DNA. Se tutti i reagenti sono privi di DNA contamina, questa reazione comporta alcuna banda. </li><li> Se la concentrazione di DNA è bassa, più DNA può essere aggiunto a ciascuna reazione, regolando la quantità di priva di nucleasi ddh 2 O utilizzato per portare il volume totale di reazione di 50 pl. Non utilizzare più di 5 pl di DNA (10% dei il volume totale) per reazione, come possibili impurità contenute nei campioni di DNA può inibire reazioni PCR. </li></ol> 6. PCR Ciclismo <ol><li> Effettuare amplificazioni di PCR in un termociclatore dotato di un coperchio riscaldato utilizzando i seguenti parametri di ciclismo PCR. Usiamo il Mastercycle pro S termociclatore (Eppendorf, Hauppauge, NY) impostato per operare con condizioni standard Ramping temperatura. Qualsiasi termociclatore qualità dovrebbe funzionare bene. <table border="1"><tbody><tr><td> Ciclo </td><td> Denaturazione di ricottura </td><td> Polimerizzazione </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 2 minuti a 95 ° C </td><td></td></tr><tr><td> 2 </td><td> 30 sec a 95 ° C </td><td> 30 secondi a 61 ° C 90 sec a 68 ° C 35 cicli </td></tr><tr><td> 3 </td><td></td><td> 5 min a 68 ° C </td></tr><tr><td colspan="3"> Mantenere a 4 ° C fino a quando il campione viene rimosso </td&gt; </tr></tbody></table></li><li> Ottimizzare le condizioni di PCR (inclusa la temperatura di ricottura innesco, i tempi di estensione, e il numero di cicli) come necessario in base alla qualità del DNA, primer, polimerasi Taq o tipo di termociclatore utilizzato. Si consiglia di utilizzare un termociclatore gradiente per determinare il grado ottimale ricottura temperature. </li><li> Se il termociclatore utilizzata non ha un coperchio riscaldato, aggiungere 1 goccia di olio minerale all&#39;inizio di ciascun campione per impedire l&#39;evaporazione durante i cicli PCR. </li></ol> 7. Elettroforesi su gel dei prodotti PCR Per visualizzare i risultati dell&#39;analisi, separate prodotti di PCR su un gel di agarosio all&#39;1% mediante elettroforesi standard. <ol><li> Combinare 2 microlitri di tampone standard carico DNA (tipicamente una soluzione 5x o 6x) con 5 pl di ciascun prodotto amplificato PCR. </li><li> Caricare i campioni su un gel di agarosio 1% contenente EtBr (bromuro di etidio per la colorazione del DNA) e realizzato conither TAE o SB (borato di sodio) sistemi tampone 16. Usiamo 1 pl di una mg / ml 10 soluzione madre EtBr per 100 ml di 1% agarosio (0,1 mcg / ml). </li><li> Eseguire campioni a ~ 120V finché il fronte del colorante raggiunge ¾ della lunghezza totale del gel. </li><li> Sotto la luce UV (per esempio un breve box onda della luce UV), controllare le bande risultanti per vedere se un frammento del caso è stato amplificato. </li><li> Documentare il gel e le fasce risultanti disponibili utilizzando un sistema di documentazione fotografica o una telecamera. </li></ol> 8. Risultati rappresentativi Dopo visualizzazione dei prodotti PCR, cogongrass ha un modello unico bande rispetto a quella di JBG o ripristinato JBG (Figura 5). Per ciascun campione di DNA, il trnL-F positive set di primer di controllo dovrebbe sfociare in una singola ad alta intensità di banda a ~ 890 bp. Questo verifica che tutti i reagenti PCR stanno funzionando bene. Allo stesso modo, il controllo negativo (senza maschera) reazione dovrebbe contenere bande per ogni s innescoet utilizzato. Ciò verifica che nessuno dei reagenti sono stati contaminati. Se il campione di DNA è derivato dal tipo selvatico cogongrass, una reazione di PCR utilizzando il cogongrass-specifica serie di primer si tradurrà in una singola banda ~ 595 bp, mentre i primer specifici JBG comporta alcuna banda. Analogamente, se il campione di DNA è derivata da JBG o ripristinato JBG, una reazione di PCR utilizzando il JBG-specifica serie di primer si tradurrà in una singola banda ~ 594 bp, mentre i primer specifici cogongrass comporta alcuna banda. Perché JBG, tornando JBG hanno identica sequenza di acido nucleico, avranno quindi hanno identici modelli di bande. Se molti campioni devono essere confrontati su un gel al tempo stesso, si consiglia di eseguire tutti i campioni derivati ​​da ciascun primer uno accanto all&#39;altro, rendendo così più facile per la scansione dei campioni di risultati positivi. Differenze morfologiche tra JBG e JBG ritorna sono abbastanza evidenti (ad esempio il colore rosso delle foglie e piccoli di statura JB<html> G contro la colorazione verde, più grande statura e la crescita aggressiva della JBG tornare), così mentre i risultati PCR sarà lo stesso, le varietà JBG sono facili da distinguere utilizzando morfologia delle piante. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3265/3265fig1.jpg" /> Figura 1. Confronto tra effetto serra cresciuta Imperata cylindrica var. Koenigii (erba sangue giapponese), Annullate I. cylindrica var. koenigii (JBG Ripristina) e I. cylindrica (Wild-type cogongrass). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3265/3265fig2.jpg" /> Figura 2. Un esempio di campioni di DNA verificate utilizzando uno spettrofotometro NanoDrop. Si noti che, indipendentemente dalla spettrofotometro utilizzata, il rapporto di 260/280 deve essere vicino a 1,8 e il 260/230 dovrebbe rapporto vicino a 2,0. ONTENUTO &quot;&gt; <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3265/3265fig3.jpg" /> Campioni di DNA Figura 3. Verificata usando standard di gel elettroforesi su un gel di agarosio all&#39;1%. Un marcatore del DNA commerciale è stato utilizzato per l&#39;analisi dimensioni. Lane # 4 è un esempio di campione di DNA scarsa qualità, mostrando sbavature e qualche contaminazione RNA. <a href="/files/ftp_upload/3265/3265fig4_lg.jpg"><img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3265/3265fig4.jpg" /></a> Allineamenti di sequenza Figura 4. Delle trnL-F regioni Imperata cylindrica var. Koenigii (erba sangue giapponese), Annullate I. cylindrica var. koenigii (JBG Ripristina) e I. cylindrica (Wild-type cogongrass). Verticali frecce nere indicano differenze nelle sequenze risultanti dal SNP e indels. Orizzontali frecce verdi indicano le posizioni delle wild-type primers cogongrass utilizzati per cogongrass-PCR specifica. Orizzontali frecce rosse indicano il Poquisizioni della JBG e JBG Ripristina primers utilizzati per JBG-PCR specifica. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3265/3265fig5.jpg" /> Figura 5. Risultato rappresentativa di elettroforesi su gel di prodotti di PCR derivati ​​da cogongrass, JBG e JBG ripristinare campioni di DNA combinati con cogongrass-e JBG primer specifici nonché la trnL-F controllo positivo e un modello nessun controllo negativo.

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Non abbiamo nulla da rivelare.

<html> Il vivaio degli Stati Uniti e le industrie del paesaggio prosperano sulla coltivazione e la vendita di specie di piante esotiche e romanzo. Questo, unito alla crescente globalizzazione del commercio, aumenta le probabilità che una specie di piante invasive entreranno, stabilire e diffondere negli Stati Uniti la capacità di regolare federale tali impianti si basa su informazioni che spesso non è disponibile, compreso il potenziale per diventare invasive , tassonomia corretta e distinzione genetica taxa nativi e naturalizzati. Perché la nostra conoscenza delle piante invasive è spesso limitata, con piante importate nascosti caratteristiche invasive sono stati volontariamente introdotti solo per scoprire più tardi che invadono le nostre risorse agricole e naturali. Questo protocollo ha lo scopo di affrontare i problemi associati alla I. varietà cylindrica fornendo il primo metodo semplificato molecolare che può accuratamente distinguere tra wild-type e la forma cogongrass ritornò della sua controparte JBG ornamentali. jove_content &quot;&gt; Per lo sviluppo di questo protocollo, wild-type cogongrass sono stati raccolti da popolazioni naturalizzate presso l&#39;Unità di Pond Creek forestale di Santa Rosa nei pressi di Jay County, Florida, nel giugno del 2008. JBG è stato acquistato presso un vivaio commerciale (Bluebird Nursery, Inc ..) nel giugno 2008, nonché dalla collezione di una casa in Columbia, MO JBG torna sono stati ottenuti dal cortile del Museo Campbell Geological alla Clemson University, SC nel giugno 2008, presso l&#39;Università Park a Riverdale, MA nel mese di giugno 2009; dal cortile di una casa in Columbia, MO nel 2009 (identificato da Leland Cseke). Tutte le piante sono state mantenute in una serra situata presso l&#39;Università di Alabama a Huntsville (Huntsville, AL). Sequenziamento genetico di DNA raccolti da queste piante incluso il confronto in profondità di 9 regioni di DNA indipendenti comunemente usati per le piante di codici a barre 2. In tutti i casi, le sequenze di JBG erano una corrispondenza del 100% a quelle del JBG ripristinare, contribuendo così averificare che JBG effettivamente tornare ad un verde, forma invasiva. Solo il suo programma nucleare e le trnL-F regioni cloroplasti sono differenze che possono essere utilizzati per distinguere geneticamente tra cogongrass e JBG. La regione ITS ha un totale di 3 SNP (polimorfismi a singolo nucleotide) tra cogongrass e JBG, mentre il trnL-F regione ha due SNPs e 2 indels (inserimenti ed eliminazioni). Queste differenze genetiche ha permesso variety-PCR primer specifici da sviluppare in grado di distinguere tra wild-type cogongrass e JBG ritorna. I risultati più attendibili sono venuti da primers derivati ​​dalla plastidio trnL-F regione. Così, questo protocollo si basa sulle differenze di sequenza tra le trnL-F regioni del genoma di cloroplasto cogongrass, JBG e tornati JBG (Figura 4). Per contribuire a generare primers che sono più specifici per le varietà in questione e per evitare falsi positivi da specie strettamente correlate, All noti trnL-F sequenze di I. varietà cylindrica sono stati confrontati con trnL-F sequenze da specie erbacee legate (43 sequenze indipendenti provenienti da 29 specie, ad esempio, Cymbopogon citratus, i Sorghastrum incompletum e Coix lacryma-jobi, i Miscanthus sinensis e Saccharum officinarum e halepense Sorghum). Sebbene, abbiamo esaminato varietà specifiche sequenze di primer in 29 specie di erbe, la specificità dei vari primer specifici non è stato completamente esaminato per la sua capacità di amplificare il DNA dalla maggior parte delle specie erbacee altre. Di conseguenza, il tessuto usato per l&#39;estrazione del DNA deve essere attentamente identificato come I. cylindrica prima di iniziare questo protocollo. Se l&#39;erba non può essere identificato sia come cogongrass o JBG, allora vi consigliamo il sequenziamento del prodotto di PCR per assicurarsi che le sequenze sono una corrispondenza esatta per cogongrass o JBG. Attualmente, il metodo più accurato per verificare l&#39;identità di un campione erba è dato effettuare PCR sia sul tRNL-F e le sue regioni, seguita dalla verifica della sequenza dei prodotti di PCR e confronto delle sequenze a sequenze note da taxa identificato con precisione. Il DNA può essere amplificato utilizzando primer di controllo descritte in questo protocollo (per il trnL-F regione) o inneschi altre disponibili in altre pubblicazioni 13-15. Sequencing è molto più lavoro e costosa rispetto all&#39;utilizzo di nostra procedura semplificata. La qualità dei primer utilizzati per la PCR è fondamentale per il successo della procedura. Abbiamo fatto i primer per questa procedura disponibile presso Oblique Bio, Inc. ( <a href="http://www.obliquebio.com/web/" target="_blank">http://www.obliquebio.com/web/</a> , Huntsville, AL). Il vantaggio di ordinare i primer da Bio Oblique è quella di immagazzinare un gran numero di aliquote di ciascun primer dalla serie identiche di produzione del campione come primer che abbiamo usato per l&#39;ottimizzazione nel nostro laboratorio. Di conseguenza, non solo inneschi hanno la stessa sequenza, ma they provengono dalla partita esattamente stessa produzione che è stato utilizzato in questo protocollo. Usando primer dallo stesso lotto, può evitare variabili estranee nel procedimento che può derivare da differenze nella qualità di primer PCR. Analogamente, mentre altre polimerasi Taq dovrebbe funzionare bene per PCR, la qualità della polimerasi Taq utilizzato avranno un impatto sulla qualità dei risultati di PCR. Per consentire una migliore coerenza nella reagenti PCR, abbiamo ottimizzato il protocollo utilizzando reagenti da Clontech. Il 2 polimerasi Advantage (Clontech, Mountain View, CA, Cat # 639201 o 639202) è una miscela di un robusto, hot-start Taq polimerasi e una prova di lettura enzima che aiuta a fornire una elevata specificità e amplificazioni più accurate. Poiché questo protocollo si basa sul DNA dei cloroplasti, che è ereditato dalla madre in erba, eventi di ibridazione tra cogongrass e genotipi JBG non possono essere catturate con la nostra procedura di identificazione molecolare. Nei casi in cui è hypridization suspected, si consiglia di utilizzare le regioni nucleari che vengono ereditati da entrambi i genitori. Il più comunemente usato non plastidio regione variabile da considerare nella genotipizzazione impianto è la centrale nucleare ribosomale ITS regione 13-15,17. Attualmente, stiamo facendo progressi verso il multiplexing l&#39;amplificazione della regione cloroplasto trnL-F con quello della centrale nucleare di regione ITS nella stessa provetta PCR. Multiplexing plastidio con le regioni del DNA nucleare potrebbe potenzialmente aggirare le limitazioni di utilizzo sia da solo, tuttavia, tali metodi richiedono l&#39;ottimizzazione e la valutazione aggiuntivo per determinare la fattibilità caso per caso. L&#39;uso di quantitative real-time PCR (qPCR) e più recenti tecnologie, quali gli apparecchi di sonde molecolari (primer fluorescenti), sono anche in corso di valutazione come metodi di piante fail-safe e accurate di genotipizzazione. Il protocollo qui presentata fornisce un approccio veloce e affidabile per distinguere la JBG tornare da quella di wild-type cogongrass. Incoraggiamo utilizzarers di questo protocollo a contattarci per riportare i risultati derivanti dall&#39;utilizzo di questo protocollo. Tali informazioni condivise contribuirà a fornire informazioni sulla distribuzione della JBG ritorna. Questo aiuterà anche regolatori a USDA prendere decisioni informate sulle azioni che possono essere necessari per aggirare la diffusione e l&#39;ibridazione potenzialità delle varietà altamente invasive cogongrass.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> DNeasy Plant Mini Kit </td><td> Qiagen, Valencia, CA </td><td> 69104 o 69106 </td><td> Qualsiasi reputazione impianto kit DNA genomico che produce DNA di buona qualità dovrebbe funzionare bene per queste procedure. </td></tr><tr><td> TRNF (GAA)-F </td><td> Oblique Bio, Inc. </td><td> 3-0578 </td><td> Controllo primer forward positivo </td></tr><tr><td> trnL (5 &#39;esone)-C </td><td> Oblique Bio, Inc. </td><td> 3-0579 </td><td> Primer reverse di controllo positivo </td></tr><tr><td> trnLF-C-F1 </td><td> Oblique Bio, Inc. </td><td> 3-0864 </td><td> Forward wild-type cogongrass fondo </td></tr><tr><td> trnLF-C-R1 </td><td> Oblique Bio, Inc. </td><td> 3-0865 </td><td> Invertirewild-type cogongrass fondo </td></tr><tr><td> trnLF-R-F2 </td><td> Oblique Bio, Inc. </td><td> 3-0866 </td><td> Forward JBG e JBG tornare fondo </td></tr><tr><td> trnLF-R-R2 </td><td> Oblique Bio, Inc. </td><td> 3-0867 </td><td> Reverse JBG e JBG tornare fondo </td></tr><tr><td> Advantage ultrapura PCR dNTP Mix </td><td> Clontech, Mountain View, CA </td><td> 639125 </td><td></td></tr><tr><td> Vantaggio 2 polimerasi </td><td> Clontech, Mountain View, CA </td><td> 639201 o 639202 </td><td> Una buona correzione di bozze, hot-start Taq polimerasi </td></tr></tbody></table>

a pcr-based genotyping method to distinguish between wild-type and ornamental varieties of imperata cylindrica

Wild-type I. cylindrica (cogongrass) è uno dei dieci peggiori piante invasive al mondo, un impatto negativo risorse agricole e naturali in 73 paesi diversi in tutta l&#39;Africa, Asia, Europa, Nuova Zelanda, Oceania e Americhe 1-2. Cogongrass forma rapida diffusione, stand monodominant che dislocano una grande varietà di specie vegetali autoctone e, a sua volta minacciano gli animali autoctoni che dipendono dalle specie vegetali native per sfollati foraggio e riparo. Per aggiungere al problema, una varietà ornamentale [I. cylindrica var. koenigii (Retzius)] è ampiamente commercializzato con i nomi di &#39;Rubra&#39; Imperata cylindrica, Red Baron, e l&#39;erba del sangue giapponese (JBG). Questa varietà è putativamente sterile e non invasiva ed è considerato uno ornamentale auspicabile per le sue foglie di colore rosso. Tuttavia, in condizioni ottimali, JBG in grado di produrre semi vitali (Carol Holko, 2009 comunicazione personale) e può tornare a un verde iforma nvasive che è spesso indistinguibile da cogongrass in quanto assume le caratteristiche distintive della wild-type varietà invasivo 4 (Figura 1). Questo rende l&#39;identificazione con morfologia un compito difficile anche per i ben addestrati tassonomi vegetali. Tendenza della JBG ad un fenotipo aggressivo verde non è un evento raro. Usando confronti di sequenze di codifica e regioni variabili del DNA, sia nucleare e dei cloroplasti, abbiamo confermato che la JBG è tornato alla invasiva verde all&#39;interno degli Stati del Maryland, South Carolina e Missouri. JBG è stata venduta e piantati in stato di quasi tutti negli Stati Uniti continentali in cui non vi è una infestazione attiva cogongrass. L&#39;entità del problema tornare in non ben compreso perché le piante sono tornati privi di documenti e spesso distrutti. L&#39;applicazione di questo protocollo molecolare fornisce un metodo per identificare JBG ritorna e può aiutare a mantenere queste varietà di co-occorrenti unoND possibilmente ibridare. Cogongrass è un outcrosser obbligato e, se incrociate con un genotipo diverso, in grado di produrre vento disperse vitale semi che si diffondono cogongrass su grandi distanze 5-7. JBG ha un genotipo leggermente diversa cogongrass e può essere in grado di formare ibridi vitali con cogongrass. Per aggiungere al problema, JBG è più freddo e tollera l &#39;ombra di cogongrass 8-10, e il flusso genico tra queste due varietà è in grado di generare ibridi che sono più aggressive, ombra tollerante e resistente freddo di wild-type cogongrass. Mentre wild-type cogongrass infesta attualmente oltre 490 milioni di ettari nel mondo, negli Stati Uniti sud-est che infesta più di 500.000 ettari ed è in grado di occupare la maggior parte degli Stati Uniti come si diffonde rapidamente verso nord a causa della sua ampia nicchia geografica e potenzialità 3,7,11. Il potenziale di un incrocio genetico è una seria preoccupazione per l&#39;USDA-APHIS programma settimanale federale nocivi. Attualmente, l&#39;USDA-APHIS vieta JBG negli Stati whprima che ci sono maggiori infestazioni cogongrass (ad esempio, Florida, Alabama, Mississippi). Tuttavia, impedendo ai due varietà di combinare può rivelarsi più difficile in quanto cogongrass e JBG espandere le loro distribuzioni. Inoltre, la distribuzione della JBG ripristinare è attualmente sconosciuto e senza la capacità di identificare questi varietà attraverso morfologia, alcuni infestazioni cogongrass può essere il risultato di JBG ritorna. Sfortunatamente, gli attuali metodi molecolari di identificazione tipicamente si basano su AFLP (Polimorfismi dei frammenti amplificati) e sequenziamento del DNA, che sono entrambi tempo e costoso. Qui vi presentiamo il primo costo-efficace e affidabile PCR-based metodo molecolare genotipizzazione di distinguere con precisione tra cogongrass e JBG ripristinare.

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A PCR-based Genotyping Method to Distinguish Between Wild-type and Ornamental Varieties of Imperata cylindrica

Forniamo un protocollo conveniente e rapido genotipizzazione molecolare che impiega varietà-specifici primer PCR che bersaglio differenze di sequenza del DNA all&#39;interno della regione cloroplasto trnL-F distanziatore per differenziare varietà di<em&gt; Imperata cylindrica</em&gt; (Cogongrass) che non può essere distinto da sola morfologia. Queste varietà sono l&#39;erba federale elencati nocive, cogongrass ed affine, diffusa varietà ornamentale, I<em&gt;. cylindrica</em&gt; Var.<em&gt; Koenigii</em&gt; (Erba sangue giapponese).

A PCR-based metodo di genotipizzazione di distinguere tra le varietà selvatiche di tipo ornamentale e di Imperata cylindrica</em

Wild-type I. cylindrica (cogongrass) is one of the top ten worst invasive plants in the world, negatively impacting agricultural and natural resources in ...

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Research

JoVE Journal

Biology

A PCR-based Genotyping Method to Distinguish Between Wild-type and Ornamental Varieties of Imperata cylindrica

31.4K Views.  The University of Alabama, Huntsville. Forniamo un protocollo conveniente e rapido genotipizzazione molecolare che impiega varietà-specifici primer PCR che bersaglio differenze di sequenza del DNA all'interno della regione cloroplasto trnL-F distanziatore per differenziare varietà di Imperata cylindrica (Cogongrass) che non può essere distinto da sola morfologia. Queste varietà sono l'erba federale elencati nocive, cogongrass ed affine, diffusa varietà ornamentale, I. cylindr...

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Pyrosequencing: A Simple Method for Accurate Genotyping

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a tremendous amount of data available comes an explosion of genotyping methods. Pyrosequencing(R) is one of the most thorough yet simple methods to date used to analyze polymorphisms. It also has the ability to identify tri-allelic, indels, short-repeat polymorphisms, along with determining allele percentages for methylation or pooled sample assessment. In addition, there is a standardized control sequence that provides internal quality control. This method has led to rapid and efficient single-nucleotide polymorphism evaluation including many clinically relevant polymorphisms. The technique and methodology of Pyrosequencing is explained.


Pyrosequencing(R) is one of the most thorough yet simple methods to date used to analyze polymorphisms. This method has led to rapid and efficient single-nucleotide polymorphism evaluation including many clinically relevant polymorphisms. The technique and methodology of Pyrosequencing is explained.

Pirosequenziamento: un metodo semplice per genotipizzazione accurata

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a ...

Ricerca

Biologia

Identifying the Effects of BRCA1 Mutations on Homologous Recombination using Cells that Express Endogenous Wild-type BRCA1

The functional analysis of missense mutations can be complicated by the presence in the cell of the endogenous protein. Structure-function analyses of the BRCA1 have been complicated by the lack of a robust assay for the full length BRCA1 protein and the difficulties inherent in working with cell lines that express hypomorphic BRCA1 protein1,2,3,4,5. We developed a system whereby the endogenous BRCA1 protein in a cell was acutely depleted by RNAi targeting the 3'-UTR of the BRCA1 mRNA and replaced by co-transfecting a plasmid expressing a BRCA1 variant. One advantage of this procedure is that the acute silencing of BRCA1 and simultaneous replacement allow the cells to grow without secondary mutations or adaptations that might arise over time to compensate for the loss of BRCA1 function. This depletion and add-back procedure was done in a HeLa-derived cell line that was readily assayed for homologous recombination activity. The homologous recombination assay is based on a previously published method whereby a recombination substrate is integrated into the genome (Figure 1)6,7,8,9. This recombination substrate has the rare-cutting I-SceI restriction enzyme site inside an inactive GFP allele, and downstream is a second inactive GFP allele. Transfection of the plasmid that expresses I-SceI results in a double-stranded break, which may be repaired by homologous recombination, and if homologous recombination does repair the break it creates an active GFP allele that is readily scored by flow cytometry for GFP protein expression. Depletion of endogenous BRCA1 resulted in an 8-10-fold reduction in homologous recombination activity, and add-back of wild-type plasmid fully restored homologous recombination function. When specific point mutants of full length BRCA1 were expressed from co-transfected plasmids, the effect of the specific missense mutant could be scored. As an example, the expression of the BRCA1(M18T) protein, a variant of unknown clinical significance10, was expressed in these cells, it failed to restore BRCA1-dependent homologous recombination. By contrast, expression of another variant, also of unknown significance, BRCA1(I21V) fully restored BRCA1-dependent homologous recombination function. This strategy of testing the function of BRCA1 missense mutations has been applied to another biological system assaying for centrosome function (Kais et al, unpublished observations). Overall, this approach is suitable for the analysis of missense mutants in any gene that must be analyzed recessively.

We provide a method for testing BRCA1 variants in a tissue culture based assay for homologous recombination repair of DNA damage by depleting endogenous BRCA1 protein from a cell using RNAi and replacing it with a BRCA1 point mutant that contains a coding change.

Identificare gli effetti delle mutazioni BRCA1 sulla ricombinazione omologa utilizzando cellule che esprimono endogeno wild-type BRCA1

The functional analysis of missense mutations can be complicated by the presence in the cell of the endogenous protein. Structure-function analyses of the ...

Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

Validating interactions between different proteins is vital for investigation of their biological functions on the molecular level. There are several methods, both in vitro and in vivo, to evaluate protein binding, and at least two methods that complement the shortcomings of each other should be conducted to obtain reliable insights. 
For an in vivo assay, the bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assay represents the most popular and least invasive approach that enables to detect protein-protein interaction within living cells, as well as identify the intracellular localization of the interacting proteins 1,2. In this assay, non-fluorescent N- and C-terminal halves of GFP or its variants are fused to tested proteins, and when the two fusion proteins are brought together due to the tested proteins&#x2019; interactions, the fluorescent signal is reconstituted3-6. Because its signal is readily detectable by epifluorescence or confocal microscopy, BiFC has emerged as a powerful tool of choice among cell biologists for studying about protein-protein interactions in living cells 3. This assay, however, can sometimes produce false positive results. For example, the fluorescent signal can be reconstituted by two GFP fragments arranged as far as 7 nm from each other due to close packing in a small subcellular compartment, rather that due to specific interactions7.
Due to these limitations, the results obtained from live cell imaging technologies should be confirmed by an independent approach based on a different principle for detecting protein interactions. Co-immunoprecipitation (Co-IP) or glutathione transferase (GST) pull-down assays represent such alternative methods that are commonly used to analyze protein-protein interactions in vitro. However, iIn these assays, however, the tested proteins must be readily soluble in the buffer that supportsused for the binding reaction. Therefore, specific interactions involving an insoluble protein cannot be assessed by these techniques.
 Here, we illustrate the protocol for the protein membrane overlay binding assay, which circumvents this difficulty. In this technique, interaction between soluble and insoluble proteins can be reliably tested because one of the proteins is immobilized on a membrane matrix. This method, in combination with in vivo experiments, such as BiFC, provides a reliable approach to investigate and characterize interactions faithfully between soluble and insoluble proteins. In this article, binding between Tobacco mosaic virus (TMV) movement protein (MP), which exerts multiple functions during viral cell-to-cell transport8-14, and a recently identified plant cellular interactor, tobacco ankyrin repeat-containing protein (ANK) 15, is demonstrated using this technique.

Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

Testing protein-protein interaction is indispensable for dissection of protein functionality. Here, we introduce an in vitro protein-protein binding assay to probe a membrane-immobilized protein with a soluble protein. This assay provides a reliable method to test interaction between an insoluble protein and a protein in solution.

Proteine ​​di membrana Overlay saggio: un protocollo di prova interazione tra proteine ​​solubili e insolubili In vitro</em

Validating interactions between different proteins is vital for investigation of their biological functions on the molecular level.  There are several ...

Optimized PCR-based Detection of Mycoplasma

The maintenance of contamination-free cell lines is essential to cell-based research. Among the biggest contaminant concerns are mycoplasma contamination. Although mycoplasma do not usually kill contaminated cells, they are difficult to detect and can cause a variety of effects on cultured cells, including altered metabolism, slowed proliferation and chromosomal aberrations. In short, mycoplasma contamination compromises the value of those cell lines in providing accurate data for life science research.
The sources of mycoplasma contamination in the laboratory are very challenging to completely control. As certain mycoplasma species are found on human skin, they can be introduced through poor aseptic technique. Additionally, they can come from contaminated supplements such as fetal bovine serum, and most importantly from other contaminated cell cultures. Once mycoplasma contaminates a culture, it can quickly spread to contaminate other areas of the lab. Strict adherence to good laboratory practices such as good aseptic technique are key, and routine testing for mycoplasma is highly recommended for successful control of mycoplasma contamination.
PCR-based detection of mycoplasma has become a very popular method for routine cell line maintenance. PCR-based detection methods are highly sensitive and can provide rapid results, which allows researchers to respond quickly to isolate and eliminate contamination once it is detected in comparison to the time required using microbiological techniques. The LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit is highly sensitive, with a detection limit of only 2 genomes per &mu;l. Taking advantage of the highly specific JumpStart Taq DNA Polymerase and a proprietary primer design, false positives are greatly reduced. The convenient 8-tube format, strips pre-coated with dNTPs, and associated primers helps increase the throughput to meet the needs of customers with larger collections of cell lines.
Given the extreme sensitivity of the kit, great care must be taken to prevent inadvertent contamination of samples and reagents. The step-by-step protocol we demonstrate highlights the precautions and practices required for reliable mycoplasma detection. We also show and discuss typical results and their interpretation. Our goal is to ensure the success of researchers using the LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit.

The LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit utilizes the polymerase chain reaction (PCR), which is established as the method of choice for highest sensitivity in the detection of Mycoplasma, Acholeplasma, and Ureaplasma contamination in cell cultures and other cell culture derived biologicals.

Ottimizzati basati sulla PCR Rilevazione di Mycoplasma

The maintenance of contamination-free cell lines is essential to cell-based research. Among the biggest contaminant concerns are mycoplasma contamination. ...

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping project is to collect a tissue sample from each individual plant. The traditional approach to this task is to sample plants one-at-a-time. If one wishes to genotype hundreds or thousands of individuals, however, using this strategy results in a significant bottleneck in the genotyping pipeline. The Ice-Cap method that we describe here provides a high-throughput solution to this challenge by allowing one scientist to collect tissue from several thousand seedlings in a single day 1,2. This level of throughput is made possible by the fact that tissue is harvested from plants 96-at-a-time, rather than one-at-a-time.
The Ice-Cap method provides an integrated platform for performing seedling growth, tissue harvest, and DNA extraction. The basis for Ice-Cap is the growth of seedlings in a stacked pair of 96-well plates. The wells of the upper plate contain plugs of agar growth media on which individual seedlings germinate. The roots grow down through the agar media, exit the upper plate through a hole, and pass into a lower plate containing water. To harvest tissue for DNA extraction, the water in the lower plate containing root tissue is rapidly frozen while the seedlings in the upper plate remain at room temperature. The upper plate is then peeled away from the lower plate, yielding one plate with 96 root tissue samples frozen in ice and one plate with 96 viable seedlings. The technique is named "Ice-Cap" because it uses ice to capture the root tissue. The 96-well plate containing the seedlings can then wrapped in foil and transferred to low temperature. This process suspends further growth of the seedlings, but does not affect their viability. Once genotype analysis has been completed, seedlings with the desired genotype can be transferred from the 96-well plate to soil for further propagation. We have demonstrated the utility of the Ice-Cap method using Arabidopsis thaliana, tomato, and rice seedlings. We expect that the method should also be applicable to other species of plants with seeds small enough to fit into the wells of 96-well plates.

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

The Ice-Cap method allows one to grow plants in 96-well plates and non-destructively harvest root tissue from each seedling. DNA extracted from this root tissue can be used for genotyping reactions. We have found that Ice-Cap works well for Arabidopsis thaliana, tomato, and rice seedlings.

Ice-Cap: Un metodo per la Crescita Arabidopsis E piante di pomodoro in piastre con 96 pozzetti di High-Throughput Genotipizzazione

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping ...

Genotyping of Plant and Animal Samples without Prior DNA Purification

The Direct PCR approach facilitates PCR amplification directly from small amounts of unpurified samples, and is demonstrated here for several plant and animal tissues (Figure 1). Direct PCR is based on specially engineered Thermo Scientific Phusion and Phire DNA Polymerases, which include a double-stranded DNA binding domain that gives them unique properties such as high tolerance of inhibitors.
PCR-based target DNA detection has numerous applications in plant research, including plant genotype analysis and verification of transgenes. PCR from plant tissues traditionally involves an initial DNA isolation step, which may require expensive or toxic reagents. The process is time consuming and increases the risk of cross contamination1, 2. Conversely, by using Thermo Scientific Phire Plant Direct PCR Kit the target DNA can be easily detected, without prior DNA extraction. In the model demonstrated here, an example of derived cleaved amplified polymorphic sequence analysis (dCAPS)3,4 is performed directly from Arabidopsis plant leaves. dCAPS genotyping assays can be used to identify single nucleotide polymorphisms (SNPs) by SNP allele-specific restriction endonuclease digestion3. 
Some plant samples tend to be more challenging when using Direct PCR methods as they contain components that interfere with PCR, such as phenolic compounds. In these cases, an additional step to remove the compounds is traditionally required2,5. Here, this problem is overcome by using a quick and easy dilution protocol followed by Direct PCR amplification (Figure 1). Fifteen year-old oak leaves are used as a model for challenging plants as the specimen contains high amounts of phenolic compounds including tannins. 
Gene transfer into mice is broadly used to study the roles of genes in development, physiology and human disease. The use of these animals requires screening for the presence of the transgene, usually with PCR. Traditionally, this involves a time consuming DNA isolation step, during which DNA for PCR analysis is purified from ear, tail or toe tissues6,7. However, with the Thermo Scientific Phire Animal Tissue Direct PCR Kit transgenic mice can be genotyped without prior DNA purification. In this protocol transgenic mouse genotyping is achieved directly from mouse ear tissues, as demonstrated here for a challenging example where only one primer set is used for amplification of two fragments differing greatly in size.

The Direct PCR approach presented here facilitates PCR amplification directly from small amounts of unpurified plant and animal tissue.

Genotipizzazione di campioni di piante e degli animali, senza purificazione del DNA Prima

The Direct PCR approach facilitates PCR amplification directly from small amounts of unpurified samples, and is demonstrated here for several plant and ...

Infinium Assay for Large-scale SNP Genotyping Applications

Genotyping variants in the human genome has proven to be an efficient method to identify genetic associations with phenotypes. The distribution of variants within families or populations can facilitate identification of the genetic factors of disease. Illumina&#39;s panel of genotyping BeadChips allows investigators to genotype thousands or millions of single nucleotide polymorphisms (SNPs) or to analyze other genomic variants, such as copy number, across a large number of DNA samples. These SNPs can be spread throughout the genome or targeted in specific regions in order to maximize potential discovery. The Infinium assay has been optimized to yield high-quality, accurate results quickly. With proper setup, a single technician can process from a few hundred to over a thousand DNA samples per week, depending on the type of array. This assay guides users through every step, starting with genomic DNA and ending with the scanning of the array. Using propriety reagents, samples are amplified, fragmented, precipitated, resuspended, hybridized to the chip, extended by a single base, stained, and scanned on either an iScan or Hi Scan high-resolution optical imaging system. One overnight step is required to amplify the DNA. The DNA is denatured and isothermally amplified by whole-genome amplification; therefore, no PCR is required. Samples are hybridized to the arrays during a second overnight step. By the third day, the samples are ready to be scanned and analyzed. Amplified DNA may be stockpiled in large quantities, allowing bead arrays to be processed every day of the week, thereby maximizing throughput.

A protocol is described that uses Illumina&#39;s Infinium assays to perform large-scale genotyping. These assays can reliably genotype millions of SNPs across hundreds of individual DNA samples in three days. Once generated, these genotypes can be used to check for associations with a variety of different diseases or phenotypes.

Infinium Assay per i grandi SNP genotipizzazione Applicazioni

Genotyping variants in the human genome has proven to be an efficient method to identify genetic associations with phenotypes. The distribution of ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic tools have been introduced, including multiple strategies for inducing mutations and generating transgenic lines. However, large-scale screening is limited by traditional genotyping methods, which are time-consuming and labor-intensive. Here we describe a technique to analyze zebrafish genotypes by PCR combined with high-resolution melting analysis (HRMA).&#160;This approach is rapid, sensitive, and inexpensive, with lower risk of contamination artifacts.&#160;Genotyping by PCR with HRMA can be used for embryos or adult fish, including in high-throughput screening protocols.

PCR combined with high-resolution melt analysis (HRMA) is demonstrated as a rapid and efficient method to genotype zebrafish.

Rapido ed efficiente Zebrafish genotipizzazione Uso PCR con ad alta risoluzione Melt Analysis

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic chromosome, synIII1, and one synthetic chromosome arm, synIXR2, have been constructed and their in vivo function validated in the absence of the corresponding wild type chromosomes. An important design feature of Sc2.0 chromosomes is the introduction of PCRTags, which are short, re-coded sequences within open reading frames (ORFs) that enable differentiation of synthetic chromosomes from their wild type counterparts. PCRTag primers anneal selectively to either synthetic or wild type chromosomes and the presence/absence of each type of DNA can be tested using a simple PCR assay. The standard readout of the PCRTag assay is to assess presence/absence of amplicons by agarose gel electrophoresis. However, with an average PCRTag amplicon density of one per 1.5 kb and a genome size of ~12 Mb, the completed Sc2.0 genome will encode roughly 8,000 PCRTags. To improve throughput, we have developed a real time PCR-based detection assay for PCRTag genotyping that we call qPCRTag analysis. The workflow specifies 500 nl reactions in a 1,536 multiwell plate, allowing us to test up to 768 PCRTags with both synthetic and wild type primer pairs in a single experiment.

Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

Analisi qPCRTag - A High Throughput, Real Time PCR Assay per Sc2.0 genotipizzazione

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

Determination of Sialic Acids in Liver and Milk Samples of Wild-type and CMAH Knock-out Mice.

CMAH (cytidine monophosphate-N-acetylneuraminic acid hydroxylase) is responsible for the oxidation of cytidine monophosphate-N-acetylneuraminic acids in mammals. However, humans cannot oxidize cytidine monophosphate-N-acetylneuraminic acid to cytidine monophosphate-N-glycolylneuraminic acid due to a primary exon deletion of the CMAH gene. To understand the effects and implications of the lack of CMAH activity in more detail, a Cmah knock-out model in mice is of keen interest in basic and applied research. The analysis method to determine the phenotype of this mouse model is herein described in detail, and is based on the detection of both N-acetylneuraminic acid and N-glycolylenuraminic acid in the liver and milk of wild-type and Cmah knock-out mice. Endogenous sialic acids are released and derivatized with o-phenylenediamine to generate fluorogenic derivatives, which can be subsequently analyzed by HPLC. The presented protocol can be also applied for the analysis of milk and tissue samples from various other origins, and may be of use to investigate the nutritional and health effects of N-glycolylneuraminic acid.

Determination of Sialic Acids in Liver and Milk Samples of Wild-type and CMAH Knock-out Mice.

We describe a HPLC-based method for the determination of N-acetylneuraminic acid and N-glycolylenuraminic acid in mouse liver and milk.

Determinazione degli acidi sialici nei campioni di fegato e latte di tipo selvatico e<em&gt; CMAH</em&gt; Mouse Knock-out.

CMAH (cytidine monophosphate-N-acetylneuraminic acid hydroxylase) is responsible for the oxidation of cytidine monophosphate-N-acetylneuraminic acids in ...