Si tratta di strutture di protocollo complete, generazione di boost grezzi e utilizzo di colture specifiche per il paziente da cellule mononucleate del sangue periferico. Queste tattiche sono riproducibili e facili da seguire, specialmente per i principianti. E non richiedere, esperti speciali in ballate di cellule staminali o medicina cardiovascolare.
Il nostro protocollo può essere utilizzato per generare cardiomiociti specifici del paziente da un singolo prelievo di sangue che può essere utilizzato per modellare le malattie cardiovascolari e testare la tossicità cardiaca di nuovi farmaci. Questo protocollo richiede un impegno a lungo termine per la riprogrammazione delle cellule staminali e la differenziazione diretta. Tuttavia, apprezzi davvero i tuoi sforzi.
Quando vedi battere i cardiomiociti nel piatto. Quando le colonie umane di iPSC raggiungono oltre il 90% di confluenza, sciacquare ogni pozzetto con tre millilitri di DPBS prima di trattare le cellule con un millilitro di 0,5 millimolari EDTA in DPBS per pozzetto a 37 gradi Celsius. Dopo cinque-otto minuti, aggiungere un millilitro di mezzo di passaggio iPSC a ciascun pozzetto e rimuovere manualmente le cellule.
Trasferire da 600 a 900 microlitri delle cellule ai singoli pozzi hanno una membrana basale rivestita con una piastra a sei pozzi per un'incubazione notturna a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Quindi rinfrescare le colture con due millilitri di E8 medio completo ogni giorno per tre o quattro giorni. Quando la coltura ha raggiunto la confluenza, sostituire il mezzo con due millilitri di mezzo di differenziazione dei cardiomiociti, due per pozzetto.
Il secondo giorno, sostituire i supernatanti con due millilitri di mezzo di differenziazione dei cardiomiociti uno. Il terzo giorno, sostituire i supernatanti con due millilitri di differenziazione dei cardiomiociti mezzo tre. Il quinto giorno.
Sostituire il surnatante con due millilitri di mezzo di differenziazione dei cardiomiociti uno. Dal settimo al 10° giorno, sostituire il surnatante con due millilitri di mezzo di differenziazione dei cardiomiociti quattro. Nei giorni 11 e 13.
Quando si osservano cellule contraenti, sostituire il surnatante con due millilitri di mezzo di differenziazione dei cardiomiociti cinque. Nei giorni 15, 17, 19 e 21. Sostituire il surnatante con due millilitri di mezzo di differenziazione dei cardiomiociti quattro.
Dopo la pre-coltura con mezzo sanguigno completo per sette giorni, i PBMC diventano grandi con nuclei visibili e citoplasma che indicano che sono pronti per la trasfezione con fattori di riprogrammazione del virus Sendai. All'introduzione per completare il mezzo E8. Le cellule completamente riprogrammate si attaccheranno e inizieranno a formare colonie.
Dopo quattro o cinque passaggi, colonie di iPSC altamente pure si formeranno dalle cellule riprogrammate con pochissime cellule differenziate osservate. In questa fase, la maggior parte delle cellule sono OCT4 e NANOG positive indicative della loro pluripotenia. Battere i cardiomiociti sono di solito osservati dopo 12 giorni di differenziazione.
Dopo la fame di glucosio e la ripabulizzazione dei cardiomiociti iPSC mostrano, battito spontaneo e una struttura sarcomere allineata con troponina cardiaca intercalata T e espressione alfa actinina. Le colonie mantengono la loro purezza, come dimostra la loro espressione di troponina T. Sebbene i cardiomiociti iPSC siano relativamente immaturi rispetto ai cardiomiociti adulti.
Dimostrano potenziali d'azione ventricolari e atriali misurati da cerotto all'ingrosso, morsetto. I cardiomiociti ventricolari esprimono la catena leggera di miosina due, mentre i cardiomiociti iPSC atriali sono marcati dall'espressione di NR2F2. L'attivazione di Wnt stimola la divisione cellulare e promuove l'espressione dei regolatori del ciclo cellulare.
È interessante notare che l'attivazione di Wnt induce anche la robusta proliferazione dei cardiomiociti iPSC precoci per due passaggi rispetto ai controlli, sebbene questa capacità proliferativa diminuisca nel tempo. Assicurarsi che i PBMS siano ingranditi con il nucleare chiaro e il citoplasma prima che vengano introdotti i vettori di riprogrammazione iPSC poiché la condizione dei PBM è fondamentale per la riprogrammazione iPSC. I cardiomiociti specifici del paziente sono preziosi per modellare le malattie cardiovascolari in vitro e per fornire una tonnellata di cellule donatrici per la terapia con cellule staminali cardiache.
