Questo protocollo descrive un flusso di lavoro per la generazione, la manutenzione e l'analisi ottica degli sferoidi cardiaci. Questi sferoidi cardiaci sono essenziali per colmare la lacuna negli attuali modelli di malattia in vitro. Questa tecnica consente ai ricercatori di creare screening di nuova generazione ad alto rendimento e conservazione funzionale degli sferoidi cardiaci.
Inizia con l'aggiunta di un millilitro per centimetro quadrato di soluzione di distacco cardiaco sterile a ciascun pozzetto di una piastra di coltura contenente cardiomiociti confluenti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius per 15 minuti. Confermare il distacco delle cellule osservando cellule bianche e di forma rotonda sotto ingrandimento 4x di un microscopio a campo luminoso.
Utilizzando una pipetta da cinque millilitri, dissociare meccanicamente le cellule lavandole con due millilitri di mezzo basale caldo per preparare una sospensione a singola cella. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo conico da 15 millilitri e centrifugare per tre minuti a 300 g. Quindi aspirare il surnatante e risospendere le cellule in un millilitro di mezzo di placcatura hiPSC-CM.
Utilizzare una punta di pipetta da 1.000 microlitri per dissociare il pellet cellulare. Dopo tre o quattro miscele, quando la soluzione appare omogenea, caricarla in una cassetta per contare le celle e trasferire la quantità appropriata di celle in 100 microlitri di mezzo di riplaccatura a ciascun pozzetto di una piastra ultra-bassa, a fondo rotondo, a 96 pozzetti. Posizionare la piastra degli sferoidi cardiaci su uno shaker orbitale nell'incubatore a 70 giri / min con una temperatura di 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica, 21% di ossigeno e 90% di umidità per 24 ore.
Per evitare la rottura dello sferoide, aspirare solo 50 microlitri di terreno da ciascun pozzetto e aggiungere 100 microlitri di RPMI più B27 medio per pozzetto per le prime 48 ore. Quindi, aspirare 100 microlitri del mezzo da ciascun pozzetto e aggiungere 100 microlitri del mezzo di maturazione per pozzetto. Mantenere le cellule nel mezzo di maturazione e rinfrescare il terreno ogni due o tre giorni.
Posizionare la piastra sferoidale sul ghiaccio per 10 minuti per il pre-raffreddamento prima di centrifugare la piastra per tre minuti a 70 g. Rimuovere il mezzo fino a quando 50 microlitri rimangono nel pozzo. Quindi aggiungere 200 microlitri di mezzo di congelamento hiPSC ghiacciato per pozzetto.
Sigillare la piastra con un film sigillante a piastre. Per preparare lo stampo in silicone, mescolare i componenti del kit di elastomero di silicio in un rapporto 10 a 1 e aggiungere la soluzione all'interno della parte inferiore della piastra del pozzetto. Debollire la soluzione utilizzando una pompa per vuoto per 15-20 minuti.
Mettere lo stampo in forno e polimerizzarlo a 60 gradi Celsius per otto ore per ottenere un elastomero semi-flessibile che viene staccato dalla piastra. Posizionare con cura la piastra sigillata in uno stampo in silicone, garantendo uno scambio termico uniforme tra la piastra del pozzetto e il congelatore. Congelare la piastra a 80 gradi Celsius per un minimo di quattro ore nello stampo in silicone preparato prima di trasferire la piastra in un serbatoio di azoto liquido o in un congelatore a 150 gradi Celsius per la conservazione a lungo termine.
Per garantire un rapido scongelamento degli sferoidi cardiaci, raccogliere una piastra cellulare con sferoidi cardiaci alla volta dall'azoto liquido e metterla nell'incubatore per 15 minuti a 37 gradi Celsius, con il 5% di anidride carbonica, il 21% di ossigeno e il 90% di umidità. Rimuovere la pellicola sigillante dalla piastra e aspirare 150 microlitri di ciascun pozzetto prima di aggiungere 200 microlitri di un mezzo basale caldo a ciascun pozzetto. Centrifugare la piastra a 70g per tre minuti e ripetere il lavaggio con mezzo basale caldo.
Una volta fatto, rimuovere 150 microlitri del mezzo e aggiungere 200 microlitri di mezzo di scongelamento dei cardiomiociti in ciascun pozzetto. Quindi ripetere il lavaggio RPMI come menzionato durante la generazione di sferoidi cardiaci, seguito dal mantenimento delle cellule nel mezzo di maturazione. Dopo una settimana di coltura, gli sferoidi cardiaci scongelati sono ottimali per la gestione dell'imaging ottico del calcio.
Aspirare 150 microlitri di ciascun pozzetto. Trattare gli sferoidi cardiaci scongelati con 100 microlitri di Cal-520 AM calcium dye medium per pozzetto in condizioni di oscurità e incubare la piastra per 60 minuti. Preparare un sistema di acquisizione e analisi del calcio alimentando il microscopio e assicurandosi che l'opzione di controllo ambientale sia attiva.
Regolare le dimensioni dell'apertura della fotocamera e dell'inquadratura per ridurre al minimo l'area di sfondo. Per misurare il segnale di calcio, utilizzando un laser a 488 nanometri, impostare il contrasto su uno sfondo nero con un segnale verde brillante durante il rilascio di calcio. Registra un video con un flusso costante da 2 a 10 picchi entro 10 secondi.
Registra un video di 10 secondi e scansiona la piastra a 96 pozzetti, inizialmente spostandosi a sinistra, poi verso il basso a zigzag per coprire l'intera piastra. Dopo aver acquisito i transitori di calcio, analizzare i dati utilizzando il software di analisi delle tracce di fluorescenza. Gli sferoidi cardiaci hanno acquisito una struttura 3D entro il primo giorno dopo la semina, che potrebbe essere coltivata per un massimo di sei settimane.
La maggior parte degli sferoidi cardiaci di tre settimane ha espresso un'organizzazione regolare del sarcomero con alfa actinina e troponina T. Alti livelli di alfa actinina nel giorno zero e sferoidi cardiaci di tre settimane hanno indicato una composizione cellulare costante e altamente pura durante la coltivazione. Un aumento dell'espressione dei geni cardiaci, dei desmosomi e dei mitocondri è stato osservato negli sferoidi rispetto agli hiPSC-CM coltivati in 2D per 90 giorni. La percentuale di battito degli sferoidi cardiaci era simile nelle prime tre settimane post-generazione ed è diminuita significativamente nella sesta settimana a causa del deterioramento degli sferoidi cardiaci.
Il tasso di battitura è stato significativamente ridotto alla terza settimana rispetto e diminuito alla sesta settimana a causa del deterioramento. I parametri transitori del calcio hanno indicato un valore di picco più elevato alla seconda settimana, mentre il tempo di salita, il tempo di decadimento e la durata transitoria del calcio al 90% del decadimento sono aumentati significativamente alla terza settimana, dimostrando che gli sferoidi derivati da hiPSC-CM erano funzionalmente ottimali alle settimane due e tre dopo la generazione. La dimensione dello sferoide aumentava con il numero di cellule utilizzate per la semina.
In dimensioni maggiori, vecchi sferoidi, il battito era significativamente più alto. Un tasso di battitura simile e significativamente più alto è stato mostrato dagli sferoidi 5k, 10k e 20k rispetto agli sferoidi 2.5k. La crioconservazione non ha influenzato la vitalità cellulare all'interno degli sferoidi cardiaci.
Un'espressione simile di proteine sarcomeriche negli sferoidi scongelati e freschi di età corrispondente ha indicato l'efficienza della crioconservazione. Non c'è stato alcun cambiamento significativo nel tasso di battitura degli sferoidi cardiaci scongelati o freschi. Non sono stati osservati cambiamenti significativi nel tempo di salita, nel tempo di decadimento e nel CTD90 di CS scongelato o fresco. Oltre alla modellizzazione della malattia e agli screening farmacologici ad alto rendimento, questi sferoidi possono essere utilizzati anche per bioreattori della produzione di vescicole extracellulari e terapie correlate alla vescicola extracellulare.
Inoltre, il biobanking di questi sferoidi può essere utilizzato come nuova fornitura di cardiomiociti per strategie rigenerative. L'accumulo di prove suggerisce che le biobanche di modelli di cellule staminali derivate dal paziente per la fibrosi cistica, il cancro e gli sferoidi cardiaci hanno un grande potenziale per svelare i meccanismi molecolari per gli screening dei farmaci e per la medicina personalizzata.
