Gli autori ringraziano Dan Bess di Sigma-Aldrich per presentare il video. Ringraziamo anche Don Branch, Evgenij Cherny, Scott Chesla, Elisabetta Hadac, Amanda Harrison, Damien Heathcote, Annika Hult, Chuan-Ching Lan, Susannah McIntosh, Sarvani Komarraju, Elena Korchagina, Caroline Oliver, Martin Olsson, Stephen Parker, Igor Rodinov, Alexander Tuzikov, e Eleanor Williams per i loro risultati e contributi per la sintesi di design, di costrutti FSL e determinare l&#39;attività biologica.

Il protocollo che segue descrive la procedura generica per l&#39;inserimento di costrutti FSL (Figura 1) in membrane biologiche. Per semplicità il protocollo solo fare riferimento alle celle (kodecytes), che sono ad una concentrazione del 100%. Tuttavia, le cellule termine è intercambiabile con virioni (kodevirions) o organismi o strutture cellulari e la loro concentrazione nel diluente non è importante, a condizione che sia sempre coerente tra le prove, i controlli e gli esperimenti. Con globuli rossi l&#39;ematocrito è tipicamente l&#39;80%, ma con virioni, embrioni e cellule di altri è in genere inferiore all&#39;1%. Il metodo è molto robusto e produrrà le membrane modificate quando viene utilizzato da una delle sue variazioni, ma la raffinatezza saranno richiesti per ottimizzare e standardizzare il grado di modifica necessaria per applicazioni specifiche. 1. Preparazione del FSL Costruisce <ol><li> Per preparare il brodo FSL costruire ricostituire prima soluzione del prodotto secco FSL (Tabella 1) con l&#39;aggiunta di 1,0 ml di diluente (o come specificato nel foglietto illustrativo) al flaconcino del prodotto. Brevemente ultrasuoni (30 secondi). Questo preparerà una soluzione 1mg/mL, che può essere aliquotati in 100 microlitri contenitori sterili e conservati a 2-8 ° C per un massimo di una settimana, o congelati per un massimo di 3 mesi. </li><li> Per preparare il lavoro FSL costruire soluzioni per l&#39;inserimento, al momento dell&#39;uso brevemente ultrasuoni (30 secondi) della soluzione di riserva per omogeneizzare le micelle. Diluire il costrutto FSL nel buffer (preferibilmente non contenenti lipidi o materiale altamente idrofobi) alla concentrazione richiesta o in un intervallo se lo si desidera. </li></ol> Note: <ol><li> Costruisce FSL di solito inserire nelle cellule in mezzi contenenti lipidi, ma in genere richiedono tanto quanto un 50X concentrazioni più elevate FSL di lavoro che se in PBS o altri mezzi di lipidi liberi. </li><li> Le diluizioni campo di lavoro dipende l&#39;applicazione, la sensibilità del metodo di rilevamento, il tipo di FSL costruire, e il grado di modifica necessaria. Tipicamente la gamma di diluizione sarà tra 10-500 mg di FSL per ml di diluente per carboidrati costruisce FSL e 100-100 mg / ml per altri costrutti FSL come fluorofori e biotina. </li><li> Se la preparazione diluenti inserimento contenente più FSL costruire, basta aggiungere i costrutti insieme nella stessa diluente alla loro concentrazione normale di lavoro. Se un costrutto è ad una concentrazione molto più alta rispetto ad un altro, qualche aggiustamento (aumento) in concentrazione possono essere richieste per la costruzione di minore. In alternativa i costrutti possono essere aggiunti in sequenza, preferibilmente con la più alta concentrazione di costruire per primo, seguito dai minori. </li><li> FSL costruire concentrazioni superiori a 1000 mg / ml possono introdurre notevoli quantità di lipidi in una membrana cellulare, e può cambiare la forma della cella o rendono più suscettibili alla lisi. </li><li> FSL costruire soluzioni di lavoro devono essere conservati a 2-8 ° C e utilizzata entro pochi giorni. </li><li> Costruisce FSL può essere diluito in acqua, ma hanno ridotto la stabilità e deve essere usato entro poche ore. Se il foglietto illustrativo indica l&#39;acqua come diluente ricostituzione il prodotto nel flacone contiene anche sali (come specificato nel foglietto illustrativo). </li></ol> 2. L&#39;inserimento del FSL Construct (s) in Membrane <ol><li> Lavare le cellule per FSL modifica senza lipidi legati mediante centrifugazione e usare PBS o lipidi mezzi cella libera come soluzione di lavaggio. </li><li> Pacco o sospendere le cellule in 100 ml di diluente. </li><li> Contemporaneamente preparare i controlli, che idealmente dovrebbero essere entrambe le celle non modificato (incubati con PBS, piuttosto che la soluzione FSL) e / o cellule modificate con un benigno, ma legati FSL costruire. </li><li> Aggiungere 100 ml di una diluizione appropriata di FSL soluzione (contenente 1 o più costrutti FSL) alle cellule e incubare per 1-2 ore a 37 ° C. Un risultato simile può essere ottenuto da 6 ore di incubazione a 25 ° C o durante la notte (18 ore) a 4 ° C - miscelazione è consigliato ogni poche ore se sospensioni cellulari pesanti vengono utilizzati. </li><li> Lavaggio (opzionale) due volte con PBS o supporto di togliere qualunque costruisce libero FSL e preparare una sospensione appropriato. </li></ol> Note: <ol><li> Il diluente utilizzato per sospendere le cellule possono essere terreni di coltura cellulare, PBS, soluzioni di storage cellulare, etc, ma preferibilmente senza lipidi (es. siero fetale di vitello) o detergenti (ad es TWEEN). </li><li> Diversi volumi (oltre 100 mL) rapporti (a 1:1 cellule / soluzione FSL) o condizioni di incubazione di tempo e temperatura possono essere utilizzati, purché lo stesso rapporto, la concentrazione, e il volume vengono utilizzati per ottenere risultati riproducibili. </li></ol> 3. Gestione e visualizzazione <ol><li> Una volta che il processo di modifica FSL è stato completato il kodecytes può essere conservata a 4-8 ° C in lipidi media liberi o utilizzato. </li><li> Kodecytes e kodevirions generalmente comportano allo stesso modo le cellule non modificate / virioni e può essere Handled e visualizzati con i sistemi di test normale (microscopia, sierologia, citometria a flusso, ecc.) Di solito non hanno esigenze particolari, tranne per evitare di solventi / detergenti / lipidi che possono eluire i costrutti lipidi dalle membrane. </li></ol> Note: <ol><li> Costruisce rimarrà nella membrana delle cellule inattive, come i globuli rossi, se conservato in lipidi media liberi per la vita della cellula. Nelle cellule con membrane attivi i costrutti verrà interiorizzato e metabolizzato, ad un tasso dipendente l&#39;attività della membrana cellulare. </li><li> Le cellule morte di solito contengono alti livelli di costrutti FSL, questo può essere usato per separare le cellule non vitali da cellule vitali. </li><li> Se kodecytes sono conservati (o utilizzati in vivo) in lipidi contenenti media / gli ambienti, come ad esempio siero / plasma il costrutto lentamente eluire dalla membrana in un periodo di ore o giorni, a seconda della temperatura e le concentrazioni di lipidi / composizioni. </li></ol> 4. Rappresentante dei risultati: <ol><li> I risultati rappresentativi seguenti dipendono dal costrutto usato (Tabella 1), la sua concentrazione inserito e la sensibilità e specificità del sistema di rilevazione (s). In generale tutti i costrutti FSL inserisce nelle cellule dopo 1 ora, ma le condizioni ottimali dovrà essere stabilito per ogni situazione. </li><li> Costruisce FSL può essere usato per etichettare l&#39;esterno di una varietà di cellule vive 3-9,11,14. Negli esempi mostrati in figura 2 embrioni a diversi stadi sono stati utilizzati (in quanto sono una cellula fragile), ma altre cellule (Figura 3) o virioni avvolto (Figura 4) possono anche essere etichettati. FSL-fluoresceina permette di etichettatura diretta delle superfici (Figure 2-4), mentre FSL-biotina e altri costrutti FSL può richiedere l&#39;uso di un sistema di rilevamento secondario (di solito avidina / anticorpi / lectine) per mostrare la loro presenza (Fig. 5) . </li><li> Markers del gruppo sanguigno della specificità umana o animale può essere collegato alle cellule, comprese le cellule rosse 4-9 (Figura 6). Poiché la quantità di FSL costruire su un kodecyte è controllabile e riproducibile 4-6, kodecytes per la quantificazione degli anticorpi possono essere effettuate (Tabella 2 e Figura 6). La fonte reale di cellule non è importante, che può essere di qualsiasi specie, o addirittura della stessa origine come fonte di anticorpi, garantendo così il solo antigene incompatibili è quello adottato dalla FSL 7,8 (Figura 6). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/3289/3289table2.jpg" alt="Tabella 2" /> Tabella 2. Rappresentante reazioni sierologiche di tre diversi FSL-A (tri) kodecytes globuli rossi testati contro diluizioni di anticorpi monoclonali anti-A. La soluzione al 50 mM di FSL-A (tri) quando incubato con un uguale volume di gruppo O globuli rossi prodotta una forte cellule antigene positivo, che potrebbe essere rilevato da una diluizione 1:512 di anticorpi monoclonali anti-A. Il 5 - e 10 volte inferiore FSL-A (tri) soluzioni prodotte kodecytes con gruppo sanguigno A meno espressione dell&#39;antigene. <img src="/files/ftp_upload/3289/3289fig1.jpg" alt="FSL costruire panoramica" /> Figura 1. FSL costruire panoramica. Come un fiore costruisce FSL è costituito da tre componenti principali. La testa funzionale (F) nel caso del costrutto FSL può essere una varietà di diversi gruppi biologicamente funzionali, un distanziale (S) per indurre una distanza di F dalla membrana, migliorare disperdibilità acqua e non reattivi con il siero, mentre i lipidi diacyl permette la costruzione di incorporare spontaneamente in superficie. (I) FSL-GB3 con un gruppo sanguigno Gb 3 (o P k) trisaccaride Galα4Galβ4Glcβ epitopo. (II) FSL-A (tri) con un gruppo sanguigno A trisaccaride epitopo GalNAcα3 (Fucα2) Galβ. (III) FSL-fluoresceina. (IV) FSL-biotina con una singola porzione F biotina. Il gruppo funzionale di strutture in I-III sono coniugati con un derivato adipato attivata di dioleoylphosphatidylethanolamine (DOPE), mentre il distanziale della struttura IV è carboxymethylglycine-adipato base. <img src="/files/ftp_upload/3289/3289fig2.jpg" alt="FSL-fluoresceina embrioni murini etichetta" /> Figura 2. FSL-fluoresceina etichettati embrioni murini. Tutte le immagini sono di embrioni vivi che sono stati etichettati quando la loro zona pellucida (ZP) era intatto (cioè la FSL costruire passato attraverso il ZP di etichettare l&#39;embrione all&#39;interno). Immagini I-IV sono di ZP-free embrioni liberati dalla loro ZP con etichettatura acido messaggio tyrodes con FSL-fluoresceina. Colorazione identica si verifica indipendentemente dal fatto che gli embrioni sono stati modificati con FSL ZP intatti o ZP libero. Gli embrioni sono direttamente etichettati con FSL-fluorescina, a ore 2 37 ° C Metodo di mezzi di comunicazione cellulare i livelli di free cultura, lavati e quindi visualizzati al microscopio a fluorescenza. (I) ZP libero due cellule embrionali murine, anche mostrando classica colorazione intensa globulo polare. (II-III) ZP libero quattro celle e otto embrioni di cellule murine, che mostra sia le macchie d&#39;ombra delle cellule che sono outide microscopio il piano di messa a fuoco. (IV) ZP libero 16 embrionale delle cellule murine. (V) ZP embrioni intatto blastocisti murine (D4-D5), dove sono etichettati sia l&#39;embrione e la zona. <img src="/files/ftp_upload/3289/3289fig3.jpg" alt="FSL-fluoresceina e zebrafish" /> Figura 3. FSL-fluoresceina e zebrafish 14. (I) Microangiography su un HPF 52 (ore dopo la fecondazione) larve di zebrafish iniettato direttamente in circolo con FSL-fluoresceina. La vascolarizzazione zebrafish è macchiato. (II) FSL-fluoresceina eterogeneo Zebrafish cellule del tessuto renale (ZK kodecytes) sono stati creati ex vivo allora micro-iniettati nella circolazione di un Zebrafish 52 hpf destinatario. Nelle osservazioni in vivo del kodecytes ZK sono state fatte due ore dopo l&#39;iniezione di imaging del vascolarizzazione in fluorescenza con microscopia time-lapse. Mostrato è un fotogramma video singola con grandi cellule si muovono lentamente o immobile (indicato con frecce arancioni) e le cellule in movimento veloce (immagini sfocate dovute al movimento - indicato con frecce verdi). Etichettatura permette in tempo reale in osservazione in vivo del comportamento e la biodistribuzione kodecytes ZK. (III) l&#39;assorbimento orale di FSL-fluoresceina ottiene immergendo in embrioni di zebrafish FSL-fluoresceina contenente i media per un massimo di 5 giorni. Lavaggio è stato ottenuto con il trasferimento di embrioni in mezzi non contenenti costruisce FSL (almeno 6 ore è necessario ma può essere per alcuni giorni). (IIIa) microscopia a campo luminoso della FSL-fluoresceina zebrafish trattati corrispondente all&#39;immagine adiacente fluorescenza (IIIb). Il fluoresence era preferenzialmente trova nel tratto intestinale. Nessuna colorazione è stata osservata negli embrioni di controllo non trattati (IVA e IVB). <img src="/files/ftp_upload/3289/3289fig4.jpg" alt="FSL-fluoresceina etichettatura dei virioni" /> Figura 4. FSL-fluoresceina etichettatura dei virioni 10 VSV e H1N1. (I) del virus stomatite vescicolare (VSV) era direttamente marcato con 10 mcg / ml FSL-fluoresceina per 2 ore a 37 ° C, seguita da fissare con il 4% paraformaldeide e poi citometria a flusso. Nessun purificazione del kodevirion VSV messaggio FSL etichettatura è stato richiesto. (II) La citometria a flusso delle cellule testicolari suini infettati da A / Puerto Rico/8/1934 (H1N1) kodevirions etichettati utilizzando FSL-fluoresceina. Cellule non infettate sono visti come la linea nera, mentre la fusione del kodevirion H1N1 con i risultati ST celle in una cella a fluorescenza (linea rossa). <img src="/files/ftp_upload/3289/3289fig5.jpg" alt="FSL-biotina cellule marcate" /> Figura 5. FSL-biotina cellule marcate e successiva visualizzazione tramite l&#39;etichetta avidina 7,8. Tutte le cellule sono stati etichettati con FSL-biotina per 1 ora a 37 ° C, lavate poi reagito con fluoroforo etichettati avidina, lavato e bagnato montate per la microscopia a fluorescenza. (I) Compilato immagine confocale di una blastocisti dell&#39;embrione murino. (II) Centrale fetta confocale dell&#39;embrione dall&#39;immagine precedente. (III) dal vivo mobili spermatozoi umani - sfocatura si verifica come conseguenza del loro moto. (IV) Fisso (4% inserimento post paraformaldeide) spermatozoi umani. (V) degli eritrociti umani. (VI) fisso (4% paraformaldeide pre-inserimento) RL95 carcinoma dell&#39;endometrio umano. (VII) non fissato RL95 umane di carcinoma endometriale linea cellulare. (VIII) Biotina RBC kodecytes osservato in un campione di sangue prelevato 2 ore dopo l&#39;infusione endovenosa di kodecytes con (VIII) che rappresenta un campo viste al microscopio ottico, mentre (VIII ter) è lo stesso campo visto in fluorescenza, identificando i due kodecytes presenti nel campo di vista. Calcolo del rapporto tra kodecytes alle cellule senza etichetta può essere utilizzata come un indicatore di sopravvivenza. (IX) dal vivo umano kodecytes biotina endometriale visualizzati legandosi a microsfere avidinylated. <img src="/files/ftp_upload/3289/3289fig6.jpg" alt="FSL-carboidrati per aggiungere marcatori gruppo sanguigno per il profiling sierologici" /> Figura 6. FSL-carboidrati per aggiungere marcatori gruppo sanguigno per il profiling sierologici. (I) di globuli rossi umani kodecytes Galili sono stati creati con una concentrazione serie di FSL-Galili (500 mg / mL) e testato contro le diluizioni di siero umano. Eritrociti umani non si presentano in natura con l&#39;antigene xenoantigen Galili. Kodecytes tale può essere usato per livelli quantitativi di anticorpi nel siero. In questo esempio, il donatore è stato determinato per avere un anti-Galili titolo di 1:32. (II) Con la creazione di kodecytes con livelli decrescenti di FSL (&quot;titoli antigenici&quot;), un livello ottimale di rilevare l&#39;antigene anticorpo può essere determinato (in questo esempio Le a). Le celle possono essere creati per dare solo un risultato positivo quando supera il livello di anticorpi un titolo specifico. Il livello di antigene FSL necessario per fornire un risultato positivo dipende dalla qualità e il livello di anticorpi essere rilevato. Per gli antigeni carboidrati, una soluzione FSL di 100 mg / ml avrà come risultato una forte reazione positiva. (III) Umani gruppo O globuli rossi sono stati modificati per avere un livello specifico di una formicaigen (standardizzato A kodecytes), e utilizzato per quantificare con precisione e riproducibile anti-A nel siero umano. In questo esempio l&#39;anti-A titolo nel gruppo O siero testato è 1:32 e le kodecytes sono stati preparati dalle stesse cellule rossi del donatore. (IV) Gruppo sanguigno antigeni A e B contemporaneamente inserita in un unico gruppo cella campione O rosso sono utilizzati per creare un kodecytes B debole debole. Questi kodecytes possono essere utilizzate per scopi ABO controllo della qualità. Questo risultato mostra l&#39;analisi di un specificamente formulato A kodecyte B debole debole testato contro i reagenti anti-A e anti-B e dà previsto reazioni deboli.

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Deborah A. Blank e Stephen M. Henry sono i dipendenti e azionisti di Kode Biotech limitata il titolare del brevetto della tecnologia Kode. Dan Bess è un dipendente di Sigma-Aldrich, che ha sponsorizzato la produzione di questo video-articolo.

Cellule modifica e virioni con costrutti FSL è una tecnica molto semplice e robusto 3-11. Per descrivere e distinguere FSL costruire cellule modificate e virioni dalle cellule non modificate, sono chiamati kodecytes e kodevirions rispettivamente 6-10, ma solo quando il gruppo ha introdotto funzionale può dimostrare di essere presenti sulla loro membrana. Quando kodecytes sono realizzati con diverse concentrazioni di costrutti FSL, possono essere a cui si riferisce la concentrazione della soluzione FSL costrutto usato per crearli, ad esempio 15 mg / ml A kodecytes, o se più di un FSL è un termine usato poi combinati, ad esempio A + biotina kodecytes 7,8. Quando le cellule sono diverse da confrontare, tra cui il tipo di cellula nella descrizione si consiglia, per esempio globuli rossi kodecytes biotina o kodecytes biotina endometriale 7,8. Sebbene il processo di inserimento è molto robusto e l&#39;inserimento (anche se con tassi differenti) si verifica in un intervallo di temperatura 4-37 ° C e in pochi minuti ad ore, per ottenere il controllo riproducibile inserimento stretto tempo di contatto, temperatura, concentrazione FSL ( compresa la formulazione diluente) e, in misura minore concentrazione di cellule sono obbligatori. Ad oggi, tutti i costrutti FSL può essere usato per modificare le cellule con la stessa tecnica 4-11, tuttavia si prevede che alcune condizioni saranno più favorevoli per flusso di lavoro e / o le esigenze di gestione ottimale delle cellule / dei virioni da modificare . La concentrazione esatta FSL per ottenere l&#39;effetto desiderato deve essere determinato dal 4 utente. La risultante FSL costruire cellule modificate / virioni di solito può essere utilizzato nello stesso modo come una cellula non modificato / virione nei sistemi biologici o analitica 4-11. Come i costrutti FSL lentamente eluire dalle superfici modificate, a contatto con soluzioni di lipidi 7,8, o essere consumati da cellule attive 11, questi temi devono essere considerati in relazione al livello di segnale o attività ottenuti in periodi di tempo. Kodecytes può essere fisso (es. glutaraldeide / formalina) dopo l&#39;inserimento a condizione che il fissativo non contiene lipidi a eluizione di solventi e il gruppo funzionale è compatibile con il fissativo. Cellule in alternativa fissa possono essere modificati con costrutti FSL. Oltre alla modifica della superficie delle cellule e virione costruisce FSL può essere infuso direttamente nella circolazione degli animali da laboratorio causando una modificazione in vivo di cellule circolanti 7 e per inibire virus 12, tossine, 12 e gli anticorpi 7. Costruisce FLS sono stati utilizzati anche per decorare liposomi e possono essere stampati su superfici di carta 13, dove si immobilizzano, e può quindi essere utilizzato in test diagnostici. La possibilità di modificare facilmente le cellule vive con una gamma crescente di costrutti FSL deve dimostrare di essere una ricerca utile e tool di sviluppo per lo studio della biologia cellulare di superficie.

<img src="/files/ftp_upload/3289/3289table1.jpg" alt="Tabella 1" /> Tabella 1. Disponibili in commercio costruisce FSL descritte in questo documento.

fsl constructs: a simple method for modifying cell/virion surfaces with a range of biological markers without affecting their viability

La possibilità di modificare / visualizzare superfici biologiche, e quindi studiare la cellula modificata / virione in una serie di in vitro e in vivo ambienti è fondamentale per acquisire una visione più completa della funzione di molecole specifiche o l&#39;intera entità. Studi di modifica della superficie biologica sono in genere limitati a ingegneria genetica dell&#39;organismo o l&#39;attacco covalente di combinazione di sostanze chimiche al 1,2 superficie cellulare. Tuttavia queste tecniche tradizionali esporre la cellula di reagenti chimici, o richiedono la modifica significativa per ottenere il risultato desiderato, che li rende ingombranti, e possono anche involontariamente influenzare la vitalità / funzionalità della cellula modificata. Un metodo semplice per modificare innocuo superficie delle cellule è necessaria. Recentemente una nuova tecnologia, tecnologia Kode ha introdotto una serie di costrutti romanzo composto da tre componenti: un gruppo di testa funzionale (F), un distanziale (S) e una coda lipidica (L) e sono conosciuti come funzione-Spacer-Lipid o FSL constructs3. Il distanziatore (S) è stata selezionata per fornire un costrutto che si disperde in acqua, ma spontaneamente e stabilmente incorporare in una membrana. FSL costruire frazioni funzionale (F) finora includono una vasta gamma di saccaridi compreso il sangue di gruppo ai determinanti, acidi sialico, polisaccaridi acido ialuronico, fluorofori, biotina, radiolabels, e una serie di peptidi 3-12. Costruisce FSL sono stati utilizzati in embrioni di modificare, spermatozoi, pesce zebra, le cellule epiteliali / endometriali, globuli rossi, e virioni per creare controlli di qualità dei sistemi e pannelli diagnostici, di modificare l&#39;adesione cellulare / interazione / separazione / immobilizzazione, e per in vitro e in imaging in vivo di cellule / virioni 3-12. Il processo di modifica di cellule / virioni è generico ed estremamente semplice. La procedura più comune è l&#39;incubazione di cellule (in lipidi media liberi) con una soluzione per FSL costruisce per 1-2 ore a 37 ° C 4-10. Durante l&#39;incubazione del FSL costruisce spontaneamente incorporare nella membrana, e il processo è completo. Lavaggio è opzionale. Cellule modificate da costrutti FSL sono conosciuti come kodecytes 6-9, mentre virioni sono kodevirions 10. FSL costruisce come infusi diretta e kodecytes / kodevirions sono stati utilizzati in modelli sperimentali animali 7,8,10. Tutti kodecytes / kodevirions sembrano mantenere la loro vitalità e la funzionalità normale guadagnando la nuova funzione della frazione F 7,8,10,11. La combinazione di disperdibilità nei media biocompatibile, incorporazione spontanea nelle membrane cellulari, e apparente bassa tossicità, rende FSL costruisce preziosi strumenti di ricerca per lo studio delle cellule e dei virioni.

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FSL Constructs: A Simple Method for Modifying Cell/Virion Surfaces with a Range of Biological Markers Without Affecting their Viability

Funzione-Spacer-Lipid (FSL) costruisce permettere le caratteristiche della superficie delle cellule viventi e virioni essere modificate senza perdita di vitalità. Il metodo richiede solo semplice contatto di una soluzione di costruire una cella con FSL / virione e l&#39;incorporazione superficie spontanea e stabile si verifica.

FSL Costruisce: un metodo semplice per la modifica di Cell / Virion Superfici con una gamma di marcatori biologici senza compromettere la loro vitalità

The ability to modify/visualize biological surfaces, and then study the modified cell/virion in a range of in vitro and in vivo environments is essential ...

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13.7K Views.  AUT University and KODE Biotech Ltd. Funzione-Spacer-Lipid (FSL) costruisce permettere le caratteristiche della superficie delle cellule viventi e virioni essere modificate senza perdita di vitalità. Il metodo richiede solo semplice contatto di una soluzione di costruire una cella con FSL / virione e l'incorporazione superficie spontanea e stabile si verifica.

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Pyrosequencing: A Simple Method for Accurate Genotyping

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a tremendous amount of data available comes an explosion of genotyping methods. Pyrosequencing(R) is one of the most thorough yet simple methods to date used to analyze polymorphisms. It also has the ability to identify tri-allelic, indels, short-repeat polymorphisms, along with determining allele percentages for methylation or pooled sample assessment. In addition, there is a standardized control sequence that provides internal quality control. This method has led to rapid and efficient single-nucleotide polymorphism evaluation including many clinically relevant polymorphisms. The technique and methodology of Pyrosequencing is explained.


Pyrosequencing(R) is one of the most thorough yet simple methods to date used to analyze polymorphisms. This method has led to rapid and efficient single-nucleotide polymorphism evaluation including many clinically relevant polymorphisms. The technique and methodology of Pyrosequencing is explained.

Pirosequenziamento: un metodo semplice per genotipizzazione accurata

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a ...

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Biologia

Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson's Disease Genes

Improvements to the diagnosis and treatment of Parkinson's disease (PD) are dependent upon knowledge about susceptibility factors that render populations at risk. In the process of attempting to identify novel genetic factors associated with PD, scientists have generated many lists of candidate genes, polymorphisms, and proteins that represent important advances, but these leads remain mechanistically undefined. Our work is aimed toward significantly narrowing such lists by exploiting the advantages of a simple animal model system. While humans have billions of neurons, the microscopic roundworm Caenorhabditis elegans has precisely 302, of which only eight produce dopamine (DA) in hemaphrodites. Expression of a human gene encoding the PD-associated protein, alpha-synuclein, in C. elegans DA neurons results in dosage and age-dependent neurodegeneration.
Worms expressing human alpha-synuclein in DA neurons are isogenic and express both GFP and human alpha-synuclein under the DA transporter promoter (Pdat-1). The presence of GFP serves as a readily visualized marker for following DA neurodegeneration in these animals. We initially demonstrated that alpha-synuclein-induced DA neurodegeneration could be rescued in these animals by torsinA, a protein with molecular chaperone activity 1. Further, candidate PD-related genes identified in our lab via large-scale RNAi screening efforts using an alpha-synuclein misfolding assay were then over-expressed in C. elegans DA neurons. We determined that five of seven genes tested represented significant candidate modulators of PD as they rescued alpha-synuclein-induced DA neurodegeneration 2. Additionally, the Lindquist Lab (this issue of JoVE) has performed yeast screens whereby alpha-synuclein-dependent toxicity is used as a readout for genes that can enhance or suppress cytotoxicity. We subsequently examined the yeast candidate genes in our C. elegans alpha-synuclein-induced neurodegeneration assay and successfully validated many of these targets 3, 4.
Our methodology involves generation of a C. elegans DA neuron-specific expression vector using recombinational cloning of candidate gene cDNAs under control of the Pdat-1 promoter. These plasmids are then microinjected in wild-type (N2) worms, along with a selectable marker for successful transformation. Multiple stable transgenic lines producing the candidate protein in DA neurons are obtained and then independently crossed into the alpha-synuclein degenerative strain and assessed for neurodegeneration, at both the animal and individual neuron level, over the course of aging.

Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson&#039;s Disease Genes

This video demonstrates how to use C. elegans to assess dopaminergic neuron neurodegeneration as a model for Parkinson's disease. Furthermore, genetic screens are used to identify factors that either enhance degeneration or are neuroprotective.

L&#39;applicazione di una degenerazione C. elegans Dopamina Saggio Neuron per la convalida dei potenziali morbo di Parkinson geni

Improvements to the diagnosis and treatment of Parkinson's disease (PD) are dependent upon knowledge about susceptibility factors that render populations ...

Fabrication of Myogenic Engineered Tissue Constructs

Despite the fact that electronic pacemakers are life-saving medical devices, their long-term performance in pediatric patients can be problematic owing to the restrictions imposed by a child's small size and their inevitable growth. Consequently, there is a genuine need for innovative therapies designed specifically for pediatric patients with cardiac rhythm disorders. We propose that a conductive biological alternative consisting of a collagen-based matrix containing autologously-derived cells could better adapt to growth, reduce the need for recurrent surgeries, and greatly improve the quality of life for these patients. In the present study, we describe a procedure for incorporating primary skeletal myoblast cell cultures within a hydrogel matrix to fashion a surgically-implantable tissue construct that will serve as an electrical conduit between the upper and lower chambers of the heart. Ultimately, we anticipate using this type of engineered tissue to restore atrioventricular electrical conduction in children with complete heart block. In view of that, we isolate myoblasts from the skeletal muscles of neonatal Lewis rats and plate them onto laminin-coated tissue culture dishes using a modified version of established protocols[2, 3]. After one to two days, cultured cells are collected and mixed with antibiotics, type 1 collagen, Matrigel&trade;, and NaHCO3. The result is a viscous, uniform solution that can be cast into a mold of nearly any shape and size[1, 4, 5]. For our tissue constructs, we employ type 1 collagen isolated from fetal lamb skin using standard procedures[6]. Once the tissue has solidified at 37&deg;C, culture media is carefully added to the plate until the construct is submerged. The engineered tissue is then allowed to further condense through dehydration for 2 more days, at which point it is ready for in vitro assessment or surgical-implantation.

Here, we demonstrate fabrication of collagen-based, tissue constructs containing skeletal myoblasts. These 3-D engineered constructs may be used to replace or repair tissues in vivo. For our purposes, we have designed these as an atrioventricular electrical conduit for the repair of complete heart block[1].

Fabbricazione di miogenici Costrutti di ingegneria tessutale

Despite the fact that electronic pacemakers are life-saving medical devices, their long-term performance in pediatric patients can be problematic owing to ...

A Lectin HPLC Method to Enrich Selectively-glycosylated Peptides from Complex Biological Samples

Glycans are an important class of post-translational modifications. Typically found on secreted and extracellular molecules, glycan structures signal the internal status of the cell. Glycans on tumor cells tend to have abundant sialic acid and fucose moieties. We propose that these cancer-associated glycan variants be exploited for biomarker development aimed at diagnosing early-stage disease. Accordingly, we developed a mass spectrometry-based workflow that incorporates chromatography on affinity matrices formed from lectins, proteins that bind specific glycan structures. The lectins Sambucus nigra (SNA) and Aleuria aurantia (AAL), which bind sialic acid and fucose, respectively, were covalently coupled to POROS beads (Applied Biosystems) and packed into PEEK columns for high pressure liquid chromatography (HPLC). Briefly, plasma was depleted of the fourteen most abundant proteins using a multiple affinity removal system (MARS-14; Agilent). Depleted plasma was trypsin-digested and separated into flow-through and bound fractions by SNA or AAL HPLC. The fractions were treated with PNGaseF to remove N-linked glycans, and analyzed by LC-MS/MS on a QStar Elite. Data were analyzed using Mascot software. The experimental design included positive controls&mdash;fucosylated and sialylated human lactoferrin glycopeptides&mdash;and negative controls&mdash;high mannose glycopeptides from Saccharomyces cerevisiae&mdash;that were used to monitor the specificity of lectin capture. Key features of this workflow include the reproducibility derived from the HPLC format, the positive identification of the captured and PNGaseF-treated glycopeptides from their deamidated Asn-Xxx-Ser/Thr motifs, and quality assessment using glycoprotein standards. Protocol optimization also included determining the appropriate ratio of starting material to column capacity, identifying the most efficient capture and elution buffers, and monitoring the PNGaseF-treatment to ensure full deglycosylation. Future directions include using this workflow to perform mass spectrometry-based discovery experiments on plasma from breast cancer patients and control individuals.

Lectin-conjugated POROS beads were employed for HPLC. Glycopeptide standards served as positive and negative controls. MARS-14 depleted, trypsin-digested human plasma was chromatographed and flow-through (FT) and bound fractions collected for ESI-LC-MS/MS analyses. Glycopeptides were enriched in the bound fraction as compared to FT.

Un metodo HPLC lectina per arricchire Peptidi selettivamente glicosilata da campioni biologici complessi

Glycans are an important class of post-translational modifications. Typically found on secreted and extracellular molecules, glycan structures signal the ...

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA template is attached to a functionalized glass coverslip and replicated extensively after introduction of replication proteins and nucleotides (Figure 1). The growing product double-strand DNA (dsDNA) is extended with laminar flow and visualized by using an intercalating dye. Measuring the position of the growing DNA end in real time allows precise determination of replication rate (Figure 2). Furthermore, the length of completed DNA products reports on the processivity of replication. This experiment can be performed very easily and rapidly and requires only a fluorescence microscope with a reasonably sensitive camera.


This protocol demonstrates a simple single-molecule fluorescence microscopy technique for visualizing DNA replication by individual replisomes in real time.

Visualizzazione singola molecola di DNA replica con microscopia a fluorescenza

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

Synthesis and Calibration of Phosphorescent Nanoprobes for Oxygen Imaging in Biological Systems

Oxygen measurement by phosphorescence quenching [1, 2] consists of the following steps: 1) the probe is delivered into the medium of interest (e.g. blood or interstitial fluid); 2) the object is illuminated with light of appropriate wavelength in order to excite the probe into its triplet state; 3) the emitted phosphorescence is collected, and its time course is analyzed to yield the phosphorescence lifetime, which is converted into the oxygen concentration (or partial pressure, pO2). The probe must not interact with the biological environment and in some cases to be 4) excreted from the medium upon the measurement completion. Each of these steps imposes requirements on the molecular design of the phosphorescent probes, which constitute the only invasive component of the measurement protocol. Here we review the design of dendritic phosphorescent nanosensors for oxygen measurements in biological systems. The probes consist of Pt or Pd porphyrin-based polyarylglycine (AG) dendrimers, modified peripherally with polyethylene glycol (PEG's) residues. For effective two-photon excitation, termini of the dendrimers may be modified with two-photon antenna chromophores, which capture the excitation energy and channel it to the triplet cores of the probes via intramolecular FRET (F&ouml;rster Resonance Energy Transfer). We describe the key photophysical properties of the probes and present detailed calibration protocols.

We present principles of oxygen measurements by phosphorescence quenching and review design of porphyrin-based dendritic nanosensors for oxygen imaging in biological systems.

Sintesi e calibrazione di nanosonde fosforescenti per l&#39;imaging di ossigeno nei sistemi biologici

Oxygen measurement by phosphorescence quenching [1, 2] consists of the following steps: 1) the probe is delivered into the medium of interest (e.g. blood ...

Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran

A central problem in developmental biology is to deduce the origin of the myriad cell types present in vertebrates as they arise from undifferentiated precursors. Researchers have employed various methods of lineage labeling, such as DiI labeling1 and pressure injection of traceable enzymes2 to ascertain cell fate at later stages of development in model systems. The first fate maps in zebrafish (Danio rerio) were assembled by iontophoretic injection of fluorescent dyes, such as rhodamine dextran, into single cells in discrete regions of the embryo and tracing the labeled cell's fate over time3-5. While effective, these methods are technically demanding and require specialized equipment not commonly found in zebrafish labs. Recently, photoconvertable fluorescent proteins, such as Eos and Kaede, which irreversibly switch from green to red fluorescence when exposed to ultraviolet light, are seeing increased use in zebrafish6-8. The optical clarity of the zebrafish embryo and the relative ease of transgenesis have made these particularily attractive tools for lineage labeling and to observe the migration of cells in vivo7. Despite their utility, these proteins have some disadvantages compared to dye-mediated lineage labeling methods. The most crucial is the difficulty we have found in obtaining high 3-D resolution during photoconversion of these proteins. In this light, perhaps the best combination of resolution and ease of use for lineage labeling in zebrafish makes use of caged fluorescein dextran, a fluorescent dye that is bound to a quenching group that masks its fluorescence9. The dye can then be "uncaged" (released from the quenching group) within a specific cell using UV light from a laser or mercury lamp, allowing visualization of its fluorescence or immunodetection. Unlike iontophoretic methods, caged fluorescein can be injected with standard injection apparatuses and uncaged with an epifluorescence microscope equipped with a pinhole10. In addition, antibodies against fluorescein detect only the uncaged form, and the epitope survives fixation well11. Finally, caged fluorescein can be activated with very high 3-D resolution, especially if two-photon microscopy is employed 12,13. This protocol describes a method of lineage labeling by caged fluorescein and laser uncaging. Subsequenctly, uncaged fluorescein is detected simultaneously with other epitopes such as GFP by labeling with antibodies.

This protocol delineates a way to label and trace the fate of small groups of cells zebrafish embryos using UV-uncaging of caged fluorescein, followed by whole mount immunolabeling to amplify the signal from the uncaged fluorescein.

Etichettatura stirpe di cellule Zebrafish con laser Uncagable Fluoresceina Destrano

A central problem in developmental biology is to deduce the origin of the myriad cell types present in vertebrates as they arise from undifferentiated ...

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of plant leaves or vertebrate lungs further difficulties arise from multiple transitions in refractive index between cellular components, between cells and airspaces and between the biological tissue and the rest of the optical system. Moreover, refractive index mismatches lead to attenuation of fluorophore excitation and signal emission in fluorescence microscopy. We describe here the application of the perfluorocarbon, perfluorodecalin (PFD), as an infiltrative imaging medium which optically improves laser scanning confocal microscopy (LSCM) sample imaging at depth, without resorting to damaging increases in laser power and has minimal physiological impact2. We describe the protocol for use of PFD with Arabidopsis thaliana leaf tissue, which is optically complex as a result of its structure (Figure 1). PFD has a number of attributes that make it suitable for this use3. The refractive index of PFD (1.313) is comparable with that of water (1.333) and is closer to that of cytosol (approx. 1.4) than air (1.000). In addition, PFD is readily available, non-fluorescent and is non-toxic. The low surface tension of PFD (19 dynes cm-1) is lower than that of water (72 dynes cm-1) and also below the limit (25 - 30 dyne cm-1) for stomatal penetration4, which allows it to flood the spongy mesophyll airspaces without the application of a potentially destructive vacuum or surfactant. Finally and crucially, PFD has a great capacity for dissolving CO2 and O2, which allows gas exchange to be maintained in the flooded tissue, thus minimizing the physiological impact on the sample. These properties have been used in various applications which include partial liquid breathing and lung inflation5,6, surgery7, artificial blood8, oxygenation of growth media9, and studies of ice crystal formation in plants10. Currently, it is common to mount tissue in water or aqueous buffer for live confocal imaging. We consider that the use of PFD as a mounting medium represents an improvement on existing practice and allows the simple preparation of live whole leaf samples for imaging.

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

We describe the use of perfluorodecalin as an infiltrative mounting medium. This is a simple method for improving depth of imaging in Arabidopsis thaliana leaf tissue with minimal physiological impact.

Un metodo semplice per l&#39;imaging Arabidopsis Foglie Utilizzando Perfluorodecalin come Media Imaging infiltrativa

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of ...

A Simple Protocol for Extracting Hemocytes from Wild Caterpillars

Insect hemocytes (equivalent to mammalian white blood cells) play an important role in several physiological processes throughout an insect's life cycle 1. In larval stages of insects belonging to the orders of Lepidoptera (moths and butterflies) and Diptera (true flies), hemocytes are formed from the lymph gland (a specialized hematopoietic organ) or embryonic cells and can be carried through to the adult stage. Embryonic hemocytes are involved in cell migration during development and chemotaxis regulation during inflammation. They also take part in cell apoptosis and are essential for embryogenesis 2. Hemocytes mediate the cellular arm of the insect innate immune response that includes several functions, such as cell spreading, cell aggregation, formation of nodules, phagocytosis and encapsulation of foreign invaders 3. They are also responsible for orchestrating specific insect humoral defenses during infection, such as the production of antimicrobial peptides and other effector molecules 4, 5. Hemocyte morphology and function have mainly been studied in genetic or physiological insect models, including the fruit fly, Drosophila melanogaster 6, 7, the mosquitoes Aedes aegypti and Anopheles gambiae 8, 9 and the tobacco hornworm, Manduca sexta 10, 11. However, little information currently exists about the diversity, classification, morphology and function of hemocytes in non-model insect species, especially those collected from the wild 12.
Here we describe a simple and efficient protocol for extracting hemocytes from wild caterpillars. We use penultimate instar Lithacodes fasciola (yellow-shouldered slug moth) (Figure 1) and Euclea delphinii (spiny oak slug) caterpillars (Lepidoptera: Limacodidae) and show that sufficient volumes of hemolymph (insect blood) can be isolated and hemocyte numbers counted from individual larvae. This method can be used to efficiently study hemocyte types in these species as well as in other related lepidopteran caterpillars harvested from the field, or it can be readily combined with immunological assays designed to investigate hemocyte function following infection with microbial or parasitic organisms 13.

Insect hemocytes carry out many important functions, both immune and non-immune, throughout all stages of insect development. Our present knowledge of hemocyte types and function comes from studies on insect genetic models. Here, we present a method for extracting, quantifying and visualizing hemocytes from wild caterpillars.

Un protocollo semplice per Estrazione emociti da bruchi selvaggi

Insect hemocytes (equivalent to mammalian white blood cells) play an important role in several physiological processes throughout an insect's life cycle ...

Recombineering Homologous Recombination Constructs in Drosophila

The continued development of techniques for fast, large-scale manipulation of endogenous gene loci will broaden the use of Drosophila melanogaster as a genetic model organism for human-disease related research. Recent years have seen technical advancements like homologous recombination and recombineering. However, generating unequivocal null mutations or tagging endogenous proteins remains a substantial effort for most genes. Here, we describe and demonstrate techniques for using recombineering-based cloning methods to generate vectors that can be used to target and manipulate endogenous loci in vivo. Specifically, we have established a combination of three technologies: (1) BAC transgenesis/recombineering, (2) ends-out homologous recombination and (3) Gateway technology to provide a robust, efficient and flexible method for manipulating endogenous genomic loci. In this protocol, we provide step-by-step details about how to (1) design individual vectors, (2) how to clone large fragments of genomic DNA into the homologous recombination vector using gap repair, and (3) how to replace or tag genes of interest within these vectors using a second round of recombineering. Finally, we will also provide a protocol for how to mobilize these cassettes in vivo to generate a knockout, or a tagged gene via knock-in. These methods can easily be adopted for multiple targets in parallel and provide a means for manipulating the Drosophila genome in a timely and efficient manner.

Recombineering Homologous Recombination Constructs in Drosophila

Homologous recombination techniques greatly advance Drosophila genetics by enabling the creation of molecularly precise mutations. The recent adoption of recombineering allows one to manipulate large pieces of DNA and transform them into Drosophila6. The methods presented here combine these techniques to rapidly generate large homologous recombination vectors.

Recombineering costrutti omologhi ricombinazione<em&gt; Drosophila</em

The continued development of techniques for fast, large-scale manipulation of endogenous gene loci will broaden the use of Drosophila melanogaster as a ...