Questo lavoro è stato finanziato dall&#39;Istituto Ontario di ricerca sul cancro (OICR), la Terry Fox Foundation e l&#39;American Association of Neurological Surgeons.

1. Cultura del tessuto cerebrale Tumore <ol><li> Aggiungere 200 microlitri Liberase scongelato (Roche Applied Science) a 15 ml di liquido cerebrospinale artificiale (aCSF-vedi tabella 1) e riporre in bagno d&#39;acqua a 37 ° C. Liberase TM è una miscela di enzimi proteolitici utilizzati per dissociare campioni di tessuto primari, così come tumorspheres coltura. Diversamente Tripsina-EDTA, il metodo Liberase conserva l&#39;antigene di superficie CD133. Per un campione di tessuto di circa 0,5 cm 3, si usa 200 ml di Liberase. Se il tessuto è più piccolo, usiamo 100 ul. </li><li> Portare soluzione di cloruro di ammonio (tecnologie di cellule staminali) a temperatura ambiente. Soluzione del cloruro di ammonio lisa delicatamente le cellule rosse del sangue, con effetto minimo sulle altre cellule. Non contiene un fissativo. </li><li> In sterile cappa di sicurezza biologica, aggiungere 5 ml di aCSF al contenitore del campione, turbine a sciacquare il tessuto, quindi pipettare off. Questo passaggio aiuta a rimuovere globuli rossi (RBC). </li><li> Trasferimento tumore al tessuto cerebrale a una sterile 100 millimetri di Petrish. </li><li> Utilizzando forbici fini o bisturi e pinze, disaggregare tessuto di consistenza liquami. </li><li> Raccogliere il campione con una pipetta 10 ml regolare o pinze e frammenti di trasferimento nella provetta contenente preriscaldata aCSF con Liberase. </li><li> Posto su incubatore-agitatore (30 rpm) e impostare a 37 ° C, per 15 minuti. </li><li> Filtrare il lisato tessuto filtro a 70 micron cella in una provetta da 50 ml Falcon. </li><li> Centrifugare il filtrato fino a 280 xg per 5 min. </li><li> Rimuovere il surnatante con attenzione e valutare le dimensioni e il colore del pellet cellulare risultante: pellet, che sono di colore rosa o rosso indicano un crescente numero di globuli rossi. </li><li> Risospendere il pellet in 1 ml di PBS. </li><li> Aggiungere una quantità appropriata di soluzione di cloruro di ammonio (4-12 ml) in base alle dimensioni di pellet e la contaminazione dei globuli rossi (soluzione di cloruro di ammonio è molto gentile e maggiori quantità non sono dannose per altre cellule dei globuli rossi). </li><li> Incubare a temperatura ambiente per 5 min. </li><li> Spin le cellulegiù a 280 xg per 5 min. </li><li> Risciacquare una volta con 10 ml di PBS sterile. </li><li> Risospendere in 5 ml di mezzo completo NSC (Tabella 2) e trasferimento ad un ultra-bassa attacco 60 piastra di coltura tissutale mm (Corning). Usiamo ultra-low piastre di coltura di legame con le superfici idrogel legati covalentemente che sono idrofili e carica neutra, per ridurre al minimo cellule attaccamento-mediata differenziazione. </li></ol> Per i primi giorni in coltura, non cambiano i mezzi di comunicazione: top-up solo con 1-2 ml supporti in base alle esigenze, quindi continuare a osservare terreni di coltura e il cambiamento quando il colore dei media diventa leggermente gialla. 2. Tumorsphere dissociazione per citometria a flusso <ol><li> Valutare tumorspheres al microscopio: se la dimensione della sfera è&gt; 100 micron, la dissociazione è raccomandato in quanto potrebbe diventare più grandi sfere necrotico al centro. </li><li> Trasferimento cultura a 15 tubo ml. </li><li> Aggiungere 2-3 ml sterile PBS di risciacquare a fondo piatto e aggiungere al tubo conico. </li><li> Centrifugare a 280 xg per 5 min. </li><li> Rimuovere il surnatante e risospendere in 1 - 2 ml PBS sterile. </li><li> Aggiungere 10 microlitri Liberase. </li><li> Incubare a 37 ° C bagno d&#39;acqua per 3 minuti. Rimuovere e valutare visivamente la sospensione, se ciuffi più visto, triturare delicatamente con una punta di 1000 microlitri pipetta. </li><li> Qualora invece ciò persiste, incubazione per altri 1-2 min. </li><li> Lavare le cellule aggiungendo 5 ml di PBS sterile e centrifugazione a 280 xg per 5 min. </li><li> Rimuovere il surnatante e risospendere in 500-1000 microlitri PBS sterile 2 mM EDTA. </li><li> Valutare il numero e la vitalità cellulare con trypan blu. </li><li> Regolare conteggio delle cellule a 1 milione / ml in PBS 2 mM EDTA. </li></ol> 3. Superficie di colorazione <ol><li> Trasferire 100 pl di sospensione di 1x10 6 cellule / ml in provette per test di flusso 12x75 mm. </li><li> Aggiungere la quantità appropriata di anticorpi. Controlli Isotype trovati deve essere utilizzato per ciascunanticorpo (vedi Tabella 3). </li><li> Incubare per 30 min in ghiaccio. </li><li> Aggiungere 2 ml di PBS 2 mM EDTA a ciascun tubo di flusso. </li><li> Centrifugare a 200 xg per 4 min, decantare e asciugare. </li><li> Risospendere il pellet in 300 ml di PBS 2 mM EDTA. </li><li> Aggiungere 10 microlitri colorante redditività 7AAD a ciascuna provetta e incubare per almeno 15 minuti in ghiaccio. </li><li> Analizzare tramite citometria a flusso. </li></ol> 4. Flusso di acquisizione e analisi Citometria Le specifiche di acquisizione e analisi dei dati di flusso sono strumento-dipendente. Rappresentativi campioni negativi sono gestiti e le impostazioni dello strumento istituito per Forward (dimensione) e laterale (granularità) dispersione. Questo modello di dispersione permette all&#39;utente finale di visualizzare tutte le celle nel campione, compresi detriti. Una regione è generalmente disegnato intorno alle cellule di interesse. (Figura 4a) Le impostazioni vengono quindi stabiliti per tutti i rivelatori di fluorescenza necessarie per posizionare le cellule negative entro la prima decade di afintensità trama luorescence. Quando più di un colorante o fluorocromo è utilizzato, singoli controlli colorati deve essere eseguito per stabilire valori di compensazione del colore (sottrazione di interferire emissioni di fluorescenza). Quando si esegue cellule vive, un colorante vitalità come 7-AAD (7-Amino-actinomicina D - eccitazione 488/emission 655) viene utilizzata e una seconda regione disegnata per escludere cellule morte (Figura 4b). Entrambe queste regioni sono applicate a qualsiasi ulteriore analisi dei campioni. 5. Auto-rinnovamento Assay Il dosaggio chiave che è molto facilitata dalla crescita clonale sfera è il test in vitro di auto-rinnovamento capacità, il saggio di diluizione limitante. Tumorspheres sono dissociati e distribuiti a diluizioni fino ad una singola cella per pozzetto, e il tasso di formazione sfera successiva più di 7 giorni di coltura viene calcolata. Il giorno 7, la percentuale di pozzetti non contenenti sfere per ciascuna densità di placcatura cella F (0) viene calcolato e tracciaticontro il numero di cellule per pozzetto (x). Il numero di cellule necessario per formare almeno una tumorsphere in ogni pozzetto è determinata dal punto in cui la linea attraversa il livello 0,37 (F = 0 e-x). In una distribuzione di Poisson di cellule, f 0 = 0,37 corrisponde alla diluizione di una cellula per pozzetto, in modo che questo calcolo (il 37% intersecano) riflette la frequenza di cellule staminali clonogeniche nella popolazione di cellula intera (Figura 5). 6. Single Cell RT-PCR Cellule singole a partire da diverse popolazioni sono ordinati per Beckman Coulter MoFlo XDP su siti di reazione su un vetrino AmpliGrid (Beckman Coulter cat # AG480F). Singola cella di RT-PCR viene eseguita utilizzando AmpliGrid singola One Step RT-PCR sistema (Beckman Coulter cat # OAX04515) secondo le specifiche del produttore. Brevemente, una singola cellula è depositato in ogni sito di reazione di una diapositiva AmpliGrid, la presenza di una singola cella in ciascunsito di reazione confermata mediante microscopia. Trascrizione inversa (RT) viene effettuata immediatamente dopo la cernita per evitare che il campione venga compromessa. Il mix RT master è preparato fresco, secondo le istruzioni del kit (Tabella 4). Abbiamo usato 0,03 pl di 25 pM primer casuali (Promega) per reazione; 1 ml di miscela principale viene aggiunto al centro di ogni sito di reazione. Questo viene immediatamente rivestito con 5 ml di soluzione di sigillatura (Beckman Coulter cat # OAX04503). Utilizzando un AmpliSpeed ​​diapositiva cycler (Beckman Coulter, cat # OAX04101), vetrini vengono incubati a 25 ° C per 10 min, 42 ° C per 10 min, e 55 ° C per 45 min. Dopo trascrizione inversa, 3 ml di DNasi / RNasi-free acqua viene aggiunta ad ogni sito di reazione, e la miscela in una provetta da PCR (1 tubo / sito). In una piastra di PCR, un volume di reazione di 10 microlitri è utilizzato per la PCR quantitativa: 8 microlitri qPCR Master Mix (5 pl SYBR Green (Quanta), 1 microlitri di acqua, 1 ml di 10 pM avanti e mix primer reverse) più 2 &amp;mu, l della miscela RT. Tempo reale quantificazione, i campioni vengono eseguiti in un cycler BioRad utilizzando il seguente programma: 95 ° C per 10 min, 45 cicli di 95 ° C per 30 sec, 60 ° C per 60 sec, 72 ° C per 60 sec, seguita da 10 min a 72 ° C e analisi della curva di fusione. Valori Ct sono stati determinati utilizzando Opticon Monitor 3 (BioRad). Tre geni possono essere valutati per cella, anche GAPDH come gene housekeeping. L&#39;espressione genica è normalizzato espressione GAPDH, secondo 2-ACT. Almeno una dozzina di singole celle della stessa popolazione della stessa specie può essere usato come biologico replicati per compensare la mancanza di tecnica replicati. 7. Risultati rappresentativi La figura 1 mostra una risonanza magnetica (MRI) di un paziente con un rappresentante GBM. Campioni tumorali cerebrali sono ottenuti da pazienti consenzienti subito dopo l&#39;intervento chirurgico, come approvato dalla Hamilton Health Sciences / McMaster Salute Sciences ricerca Comitato Etico. Una parte di ciascun campione è dato al neuropathologist per la diagnosi clinica di routine. Il campione rimanente viene elaborato come mostrato in Figura 2. Le cellule tumorali, una volta piastrate in mezzi completi staminali neurali cellulari con fattori di crescita, tumorspheres forma come mostrato in Figura 3. Le cellule tumorali sono marcati con marcatori neurali superficie di cellule staminali CD133 e CD15 e analizzate mediante citometria di flusso, come mostrato in Figura 4. Cellule singole a partire da popolazioni diverse per esempio, CD15 + / CD133 +, CD15 + / CD133-, CD15-/CD133 +, CD15-/CD133- vengono poi ordinati in piastre a 96 pozzetti (Figura 5a) o in diapositive AmpliGrid (Figura 6a). Nella piastra a 96 pozzetti, singole cellule che possiedono la capacità di auto-rinnovamento (ad esempio cellule CD133 +), (figura 5b), possono formare tumorspheres (Figura 5c) seguendo incudi incubazione. A autorinnovamento grafico può essere tracciato (Figura 5d) contando il numero di sfere formate per pozzetto. Singole cellule ordinati nel sito di reazione della slitta Ampligrid (Figura 6a). Gli RNA estratto da cellule singole possono essere retrotrascritto utilizzando il AmpliSpeed ​​Advalytix (Figura 6b). Il cDNA ottenuto viene utilizzato per eseguire in tempo reale RT-PCR (figura 6c). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4111/4111fig1.jpg" /> Figura 1. Immagine di risonanza magnetica (MRI) di un GBM paziente. Risonanza magnetica del cervello di una ragazza di 16 anni con un mese di storia di mal di testa e una storia settimana di vomito, letargia e offuscamento della vista. Sequenza FLAIR assiale mostra una grande bi-emisferica (&quot;farfalla&quot;) GBM. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4111/4111fig2.jpg" /> Figura 2. Trattamento del tumore al cervello. Campioni di tumori cerebrali sono obtainato da pazienti consenzienti subito dopo l&#39;intervento chirurgico. Essi sono dissociate meccanicamente come illustrato (a) e sono quindi dissociate enzimaticamente in aCSF con Liberase incubando in un rpm 30 dondolo incubatore a 37 ° C per 15 min (b). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4111/4111fig3.jpg" /> Figura 3. Popolazioni BTIC formare tumorspheres nella cultura. Dissociati cellule tumorali cerebrali placcati in mezzi completi staminali neurali cellulari con fattori di crescita forma tumorspheres. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/4111/4111fig4.jpg" /> Figura 4. L&#39;analisi citofluorimetrica delle popolazioni BTIC. (A) in avanti rispetto a proprietà scatter laterali forniscono l&#39;immagine di tutte le cellule, compresi i residui (b) Le cellule che macchiano con il colorante vitalità 7-AAD sono esclusi dall&#39;analisi. (C) La posizione dei quadranti statistici è determinato mediante opportuni controlli Isotype (d) cellule tumorali colorate con superficie markers CD15 e CD133-PE-APC. (D) Moflo cell sorter XDP. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4111/4111fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/4111/4111fig5.jpg" /> Figura 5. Limitando l&#39;analisi di diluizione BTICs rivela la loro capacità di auto-rinnovamento. (A) Cellule di diluizioni differenti sono ordinati in 96 pozzetti contenenti 200 ml di NSC a (b) una singola cellula per pozzetto. (C) Dopo un periodo di 7 giorni di incubazione, si forma un tumorsphere. La morfologia di tumorspheres secondari è identica a quella di tumorspheres primari. (D) La media intercetta x valori possono essere calcolati da limitare l&#39;analisi di diluizione per ciascun sottotipo di tumore per rivelare il numero di cellule necessario per formare almeno una tumorsphere per pozzetto. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/4111/4111fig6.jpg" /> Figura 6. Analisi dell&#39;espressione genica di una singola cellula BTICè possibile utilizzando singola cellula RT-PCR tecnologia. (a) cellule singole da una popolazione BTIC possono essere ordinati su vetrini AmpliGrid. (B) sintesi di cDNA viene eseguita su singole cellule su vetrini AmpliGrid utilizzando il AmpliSpeed ​​Advalytix. (C) PCR quantitativa in tempo reale viene eseguita sul cDNA sintetizzato da singole cellule BTIC. <table border="1"><tbody><tr><td> 2M NaCl </td><td> 62 ml </td></tr><tr><td> KCl 1M </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> 1M MgCl 2 </td><td> 3,2 ml </td></tr><tr><td> 155 mm NaHCO 3 </td><td> 169 ml </td></tr><tr><td> Glucosio 1M </td><td> 10 ml </td></tr><tr><td> 108 mM CaCl 2 </td><td> 0,9256 ml </td></tr><tr><td> Purelab Ultra H 2 0 </td><td> 749,84 ml </td></tr></tbody></table> Tabella 1 artificiale liquido cerebrospinale (aCSF) -. 1.000 ml. <table border="1"><tbody><tr><td> Archivio multimediale basali </td><td> 500 ml </td></tr><tr><td> 01:01 DMEM: F12 </td><td> 480 ml </td></tr><tr><td> N2 supplemento </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> HEPES 1M </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> Glucosio </td><td> 3,0 g </td></tr><tr><td> N-acetilcisteina (60 mg / ml) </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> Sopravvivenza neurale fattore-1 (NSF-1) </td><td> 10 ml </td></tr></tbody></table> Tabella 2. Supporto di cellule staminali neurali. Supporto NSC completi (preparato fresco prima dell&#39;uso): Supporti NSC basali + 20 ng / ml EGF (epidermal growth factor) + 20 ng / ml bFGF (fattore di crescita dei fibroblasti) + 10 ng / ml LIF (fattore inibitorio di leucemia) * + 10 microlitri / ml antibiotico-antimicotico * Fattore inibitorio della leucemia (LIF): Questo reagente da Millipore contiene una classe citochina interleuchina 6, una protein che sopprime la differenziazione spontanea delle cellule staminali che promuovono la manutenzione a lungo termine di colture di cellule staminali. <table border="1"><tbody><tr><td> Anticorpi </td><td> Fornitore / CAT # </td><td> pl / test (in 100 pl) </td></tr><tr><td> CD133 / 2 APC (293C3) </td><td> Miltenyi Biotec/130-090-854 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> IgG2b APC (Isotype controllo) </td><td> Miltenyi Biotec/130-092-217 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> CD15PE </td><td> Beckman Coulter/IM1954U </td><td> 5 </td></tr><tr><td> IgG2a PE (Isotype controllo) </td><td> Beckman Coulter/A09141 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> 7AAD </td><td> Beckman Coulter/A07704 </td><td> 10 </td></tr></tbody></table> Tabella 3. Anticorpi di flusso. <table border="1"><tbody><tr><td> Componente </td><td> Volume (1 reazione) </td><td> Volume (48 reazione) </td></tr><tr><td> 2x singola cella tampone di reazione RT </td><td> 0,50 pl </td><td> 30,0 pl </td></tr><tr><td> RNase Inhibitor (10 U / pl) </td><td> 0,02 pl </td><td> 1,2 pl </td></tr><tr><td> 5X singola cella RT enhancer </td><td> 0,15 pl </td><td> 9,00 pl </td></tr><tr><td> RT singola cella Enzyme Mix </td><td> 0,04 pl </td><td> 2,4 pl </td></tr><tr><td> Advablue (OAX04227) </td><td> 0,1 pl </td><td> 6,00 pl </td></tr><tr><td> Acqua priva di nucleasi </td><td> portare a 1 pl </td><td> portare a 60 pl </td></tr></tbody></table> Tabella 4. Composizione della miscela RT master per RTPCR singola cella (cat # OAX04515).

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il gambo ipotesi cancro cella 10, sulla base di lavoro 21 nella leucemia, cancro al seno e cancro al cervello 11 4,5, suggerisce che solo una frazione relativamente piccola di cellule nel tumore, chiamate cellule staminali tumorali, possiedono la capacità di proliferare e ampiamente auto -rinnovo. La maggior parte delle cellule tumorali perdono la capacità di proliferare e auto-rinnovano come differenziarsi in cellule che diventano la firma fenotipica del tumore. Trovare le cellule chi...

I tumori cerebrali sono tra i tumori più aggressivi ed eterogenei conosciute negli esseri umani. Anche se la loro diagnosi precoce e la diagnosi sono state facilitate dalla moderna neuro-tecnologia di imaging, ci manca ancora terapie curative per i tumori cerebrali, in particolare per quelli invasivi diffuse, o quelle situate in profondità nel cervello. I tumori cerebrali rappresentano la principale causa di mortalità per cancro nei bambini a causa della loro natura altamente aggressiva e spesso incurabile. Glioblastoma (GBM), il più comune tumore cerebrale primario negli adulti, è uno dei tumori più aggressivi umani, temeva per la sua prognosi uniformemente fatale 1. Questo tumore altamente maligno astrocitari (di grado 4) di solito si verifica negli emisferi cerebrali degli adulti, e può verificarsi anche nei bambini piccoli e neonati. La sua crescita è rapida e infiltrante, e diagnostici caratteristiche patologiche includono pleomorfismo nucleare, la proliferazione microvascolare e necrosi 2,3. Per adults con GBM di recente diagnosi, la sopravvivenza mediana va raramente oltre 12 mesi 1, con le risposte in genere poveri a tutte le modalità terapeutiche. Abbiamo notato che ci sono molte somiglianze funzionali e genetici condivisi da cellule staminali somatiche e cellule tumorali, e che le vie molecolari che regolano lo sviluppo normale del cervello sono spesso alterata nelle cancro. Nell&#39;applicare staminali paradigmi biologia cellulare allo studio dei tumori cerebrali, siamo stati i primi ricercatori a identificare in modo prospettico e purificare una sottopopolazione di cellule di GBM umani che esibivano le proprietà delle cellule staminali di proliferazione, self-renewal e la differenziazione in vitro 4 e in vivo 5. Abbiamo applicato condizioni di coltura e saggi originariamente utilizzate per caratterizzare normali cellule staminali neurali (NSC) in vitro 6,7 a più tumori cerebrali pediatrici e adulti, e arricchito di questi-come le cellule staminali da cellule di ordinamento per la neurale marcatore di superficie delle cellule progenitrici CD133 8 ,9. Il CD133 + frazione di tumore al cervello conteneva cellule che hanno una frequenza molto più elevata di apertura del tumore rispetto al-CD133 frazione in NOD-SCID 5,10 topo cervello. Questo formalmente stabilito che solo un sottoinsieme rara di cellule cerebrali tumorali con caratteristiche di cellule staminali sono tumore avvio, guadagnandosi il nome di &quot;tumore al cervello iniziare cellule&quot; o &quot;BTICs&quot;. L&#39;identificazione romanzo di BTICs fornisce nuove intuizioni tumorigenesi cervello umano, dando un forte sostegno per l&#39;ipotesi delle cellule staminali del cancro 10-13 come base per molti tumori solidi, e stabilisce un nuovo bersaglio cellulare per ulteriori terapie antitumorali efficaci 14-20. Terapie che si concentrano a uccidere la maggior parte del tumore può perdere la rara simil-staminali frazione, permettendo al tumore di continuare a crescere. Terapie che si concentrano a uccidere le cellule staminali tumorali possono fornire un migliore trattamento e la prognosi per i pazienti con tumori cerebrali. Al fine di studiare le popolazioni BTIC, abbiamo affinato la nostra culture protocolli per selezionare specificamente per popolazioni di cellule all&#39;interno di tumori cerebrali umani che possiedono proprietà delle cellule staminali. Privo di siero, cellule staminali neurali (NSC) medie consente il mantenimento di uno stato indifferenziato di cellule staminali, e l&#39;aggiunta del fattore di crescita dei fibroblasti (bFGF), fattore di crescita epidermico (EGF) e fattore inibitorio di leucemia (LIF) consente la proliferazione di multi-potenti, auto-rigenerante, e espandibili tumorspheres umani. Qui, descriviamo i metodi coinvolti nel trattamento dei tumori cerebrali primari e coltura in mezzo NSC per arricchire per le popolazioni BTIC. Abbiamo chiamato il nostro sistema modello sperimentale &quot;isolati di pazienti BTIC&quot; per sottolineare il fatto che queste cellule sono solo in minima parte coltivate in staminali condizioni delle celle alla selezione di popolazioni di cellule staminali. immunolabelling successiva delle popolazioni BTIC di indicatori chiave di cellule staminali, quali CD133 e CD15 e citometria analisi dei flussi è anche descritto. Discutiamo poi l&#39;analisi di diluizione limitante,che aiuta nello studio del self-renewal potenziale di BTICs. Infine, abbiamo esplorare l&#39;analisi di espressione genica delle cellule rare ordinando singole cellule su vetrini AmpliGrid ed eseguendo singola cella RT-PCR. Queste tecniche sono applicabili anche ad altri tumori cerebrali come il medulloblastoma, ependimoma e gliomi pediatrici.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> 01:01 DMEM: F12 </td><td> Invitrogen </td><td> 11320-082 </td></tr><tr><td> N2 supplemento </td><td> Invitrogen </td><td> 17502-048 </td></tr><tr><td> HEPES 1M </td><td> Wisent </td><td> 330-050-EL </td></tr><tr><td> Glucosio </td><td> Invitrogen </td><td> 15023-021 </td></tr><tr><td> N-acetilcisteina </td><td> Sigma Aldrich </td><td> A9165-25g </td></tr><tr><td> Neural Fattore di sopravvivenza -1 (NSF-1) </td><td> Lonza Clonetics </td><td> CC-4323 </td></tr><tr><td> Il fattore di crescita epidermico (EGF) </td><td> Sigma Aldrich </td><td> E9644 </td></tr><tr><td> Base del fattore di crescita dei fibroblasti (bFGF) </td><td> Invitrogen </td><td> PHG0261 </td></tr><tr><td> Fattore inibitorio della leucemia (LIF) </td><td> Millipore </td><td> LIF1010 </td></tr><tr><td> Antibiotico / micotica </td><td> Wisent </td><td> 450-115-EL </td></tr><tr><td> Liberase TM </td><td> Roche </td><td> 05 401 119 001 </td></tr><tr><td> Soluzione di cloruro di ammonio </td><td> Stem Cell Technologies </td><td> 07850 </td></tr></tbody></table>

processing of primary brain tumor tissue for stem cell assays and flow sorting

Tumori cerebrali sono in genere costituito da cellule morfologicamente diverse che esprimono una varietà di marcatori neurali lignaggio. Solo una frazione relativamente piccola di cellule nel tumore con proprietà staminali, chiamate cellule tumorali cerebrali avvio (BTICs), possiedono una capacità di differenziare lungo linee multiple, auto-rinnovano, e avviare tumori in vivo. Abbiamo applicato condizioni di coltura in origine usati per le normali cellule staminali neurali (NSC) a una varietà di tumori del cervello umano e ha scoperto che questo metodo cultura seleziona appositamente per stelo tipo popolazioni. Terreno privo di siero (NSC) consente il mantenimento di uno stato indifferenziato di cellule staminali, e l&#39;aggiunta di EGF e bFGF permette la proliferazione di multi-potente, auto-rinnovano, e tumorspheres espandibili. Per caratterizzare ulteriormente popolazione BTIC ciascun tumore, valutiamo marcatori di superficie cellulare mediante citometria a flusso. Possiamo anche ordinare le popolazioni di interesse per caratteriz più specifichezione. Autorinnovamento saggi vengono eseguiti su singole BTICs filtrate in piastre a 96 pozzetti, la formazione di tumorspheres dopo l&#39;incubazione a 37 ° C indica la presenza di uno stelo o di cellule staminali. Il numero di cellule multiple di una particolare popolazione può anche essere ordinati in diversi pozzetti per limitare l&#39;analisi di diluizione, per analizzare la capacità di auto-rinnovamento. Possiamo anche studiare l&#39;espressione genica differenziale all&#39;interno di una popolazione cellulare particolare utilizzando singola cella RT-PCR. I protocolli seguenti descrivono le procedure per la dissociazione e la coltura di campioni umani primari per arricchire per popolazioni BTIC, così come la dissociazione di tumorspheres. Sono inclusi anche i protocolli per la colorazione per citometria a flusso o smistamento, self-renewal saggi, e singola cellula RT-PCR.

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Processing of Primary Brain Tumor Tissue for Stem Cell Assays and Flow Sorting

L&#39;identificazione delle cellule tumorali del cervello avvio (BTICs), le cellule rare all&#39;interno di una proprietà eterogenee di cellule staminali tumorali che possiedono, fornisce nuove intuizioni patogenesi umana tumore al cervello. Abbiamo affinato specifiche condizioni di coltura per arricchire per BTICs, e noi abitualmente uso citometria a flusso per arricchire ulteriormente queste popolazioni. Autorinnovamento saggi e analisi trascritto di singola cellula RT-PCR può successivamente essere eseguita su queste cellule isolate.

Lavorazione dei tessuti primaria tumore al cervello per saggi su cellule staminali e flusso di Ordinamento

Brain tumors are typically comprised of morphologically diverse cells that express a variety of neural lineage markers. Only a relatively small fraction ...

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17.9K Views.  McMaster University. L'identificazione delle cellule tumorali del cervello avvio (BTICs), le cellule rare all'interno di una proprietà eterogenee di cellule staminali tumorali che possiedono, fornisce nuove intuizioni patogenesi umana tumore al cervello. Abbiamo affinato specifiche condizioni di coltura per arricchire per BTICs, e noi abitualmente uso citometria a flusso per arricchire ulteriormente queste popolazioni. Autorinnovamento saggi e analisi trascritto di singola cellula RT...

Video: Processing of Primary Brain Tumor Tissue for Stem Cell Assays and Flow Sorting

Preparation of Myeloid Derived Suppressor Cells (MDSC) from Naive and Pancreatic Tumor-bearing Mice using Flow Cytometry and Automated Magnetic Activated Cell Sorting (AutoMACS)

MDSC are a heterogeneous population of immature macrophages, dendritic cells and granulocytes that accumulate in lymphoid organs in pathological conditions including parasitic infection, inflammation, traumatic stress, graft-versus-host disease, diabetes and cancer1-7. In mice, MDSC express Mac-1 (CD11b) and Gr-1 (Ly6G and Ly6C) surface antigens7. It is important to note that MDSC are well studied in various tumor-bearing hosts where they are significantly expanded and suppress anti-tumor immune responses compared to na&iuml;ve counterparts7-10. However, depending on the pathological condition, there are different subpopulations of MDSC with distinct mechanisms and targets of suppression11,12. Therefore, effective methods to isolate viable MDSC populations are important in elucidating their different molecular mechanisms of suppression in vitro and in vivo.
Recently, the Ghansah group has reported the expansion of MDSC in a murine pancreatic cancer model. Our tumor-bearing MDSC display a loss of homeostasis and increased suppressive function compared to na&iuml;ve MDSC 13. MDSC percentages are significantly less in lymphoid compartments of na&iuml;ve vs. tumor-bearing mice. This is a major caveat, which often hinders accurate comparative analyses of these MDSC. Therefore, enriching Gr-1+ leukocytes from na&iuml;ve mice prior to Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) enhances purity, viability and significantly reduces sort time. However, enrichment of Gr-1+ leukocytes from tumor-bearing mice is optional as these are in abundance for quick FACS sorting. Therefore, in this protocol, we describe a highly efficient method of immunophenotyping MDSC and enriching Gr-1+ leukocytes from spleens of na&iuml;ve mice for sorting MDSC in a timely manner. Immunocompetent C57BL/6 mice are inoculated with murine Panc02 cells subcutaneously whereas na&iuml;ve mice receive 1XPBS. Approximately 30 days post inoculation; spleens are harvested and processed into single-cell suspensions using a cell dissociation sieve. Splenocytes are then Red Blood Cell (RBC) lysed and an aliquot of these leukocytes are stained using fluorochrome-conjugated antibodies against Mac-1 and Gr-1 to immunophenotype MDSC percentages using Flow Cytometry. In a parallel experiment, whole leukocytes from na&iuml;ve mice are stained with fluorescent-conjugated Gr-1 antibodies, incubated with PE-MicroBeads and positively selected using an automated Magnetic Activated Cell Sorting (autoMACS) Pro Separator. Next, an aliquot of Gr-1+ leukocytes are stained with Mac-1 antibodies to identify the increase in MDSC percentages using Flow Cytometry. Now, these Gr1+ enriched leukocytes are ready for FACS sorting of MDSC to be used in comparative analyses (na&iuml;ve vs. tumor- bearing) in in vivo and in vitro assays.

Preparation of Myeloid Derived Suppressor Cells MDSC from Naive and Pancreatic Tumor-bearing Mice using Flow Cytometry and Automated Magnetic Activated Cell Sorting AutoMACS

This is a rapid and comprehensive method of immunophenotyping Myeloid Derived Suppressor Cells (MDSC) and enriching Gr-1+ leukocytes from mouse spleens. This method uses flow cytometry and AutoMACS Cell Sorting to enrich for viable Gr-1+ leukocytes prior to FACS sorting of MDSC for use in vivo and in vitro assays.

Preparazione di cellule derivate mieloidi soppressore (MDSC) da Naive e Pancreatiche topi affetti da tumore in citometria a flusso e di smistamento automatico magnetico cellulare Attivato (AutoMACS)

MDSC are a heterogeneous population of immature macrophages, dendritic cells and granulocytes that accumulate in lymphoid organs in pathological ...

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Medicina

Isolation of Cardiomyocyte Nuclei from Post-mortem Tissue

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events in cardiac myocytes such as proliferation and apoptosis require an accurate identification of cardiac myocyte nuclei to analyze cellular renewal in homeostasis and in pathological conditions2. Here, we provide a method to isolate cardiomyocyte nuclei from post mortem tissue by density sedimentation and immunolabeling with antibodies against pericentriolar material 1 (PCM-1) and subsequent flow cytometry sorting. This strategy allows a high throughput analysis and isolation with the advantage of working equally well on fresh tissue and frozen archival material. This makes it possible to study material already collected in biobanks. This technique is applicable and tested in a wide range of species and suitable for multiple downstream applications such as carbon-14 dating3, cell-cycle analysis4, visualization of thymidine analogues (e.g. BrdU and IdU)4, transcriptome and epigenetic analysis.

Cardiac nuclei are isolated via density sedimentation and immunolabeled with antibodies against pericentriolar material 1 (PCM-1) to identify and sort cardiomyocyte nuclei by flow cytometry.

Isolamento dei Nuclei Cardiomyocyte dal post-mortem del tessuto

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human pulp-derived stem cells (hDPSCs) possess high proliferation potential with multi-lineage differentiation capacity compare to the ordinary source of adult stem cells1-8; therefore, hDPSCs could be the good candidates for autologous transplantation in tissue engineering and regenerative medicine. Along with these benefits, possessing the mesenchymal stem cells (MSC) features, such as immunolodulatory effect, make hDPSCs more valuable, even in the case of allograft transplantation6,9,10. Therefore, the primary step for using this source of stem cells is to select the best protocol for isolating hDPSCs from pulp tissue. In order to achieve this goal, it is crucial to investigate the effect of various isolation conditions on different cellular behaviors, such as their common surface markers &amp; also their differentiation capacity.
Thus, here we separate human pulp tissue from impacted third molar teeth, and then used both existing protocols based on literature, for isolating hDPSCs,11-13 i.e. enzymatic dissociation of pulp tissue (DPSC-ED) or outgrowth from tissue explants (DPSC-OG). In this regards, we tried to facilitate the isolation methods by using dental diamond disk. Then, these cells characterized in terms of stromal-associated Markers (CD73, CD90, CD105 &amp; CD44), hematopoietic/endothelial Markers (CD34, CD45 &amp; CD11b), perivascular marker, like CD146 and also STRO-1. Afterwards, these two protocols were compared based on the differentiation potency into odontoblasts by both quantitative polymerase chain reaction (QPCR) &amp; Alizarin Red Staining. QPCR were used for the assessment of the expression of the mineralization-related genes (alkaline phosphatase; ALP, matrix extracellular phosphoglycoprotein; MEPE &amp; dentin sialophosphoprotein; DSPP).14

The method described isolation and characterization of human Dental Pulp Stem Cells (hDPSCs) by using either enzymatic dissociation of pulp (DPSC-ED) or direct outgrowth of stem cells from pulp tissue explants (DPSC-OG). Then followed by in vitro comparative differentiation of both types of hDPSCs into odontoblasts.

Differenziazione Isolamento, caratterizzazione e comparata delle cellule umane Dental Pulp staminali derivate da denti permanenti mediante due diversi metodi

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for progression-free and overall survival. Therefore, translational research needs to provide further molecular evidence to improve targeted therapies for malignant melanomas. In the past, oncogenic mechanisms related to melanoma were extensively studied in established cell lines. On the way to more personalized treatment regimens based on individual genetic profiles, we propose to use patient-derived cell lines instead of generic cell lines. Together with high quality clinical data, especially on patient follow-up, these cells will be instrumental to better understand the molecular mechanisms behind melanoma progression.
Here, we report the establishment of primary melanoma cultures from dissected fresh tumor tissue. This procedure includes mincing and dissociation of the tissue into single cells, removal of contaminations with erythrocytes and fibroblasts as well as primary culture and reliable verification of the cells' melanoma origin.
Recent reports revealed that melanomas, like the majority of tumors, harbor a small subpopulation of cancer stem cells (CSCs), which seem to exclusively fuel tumor initiation and progression towards the metastatic state. One of the key markers for CSC identification and isolation in melanoma is CD133. To isolate CD133+ CSCs from primary melanoma cultures, we have modified and optimized the Magnetic-Activated Cell Sorting (MACS) procedure from Miltenyi resulting in high sorting purity and viability of CD133+ CSCs and CD133- bulk, which can be cultivated and functionally analyzed thereafter.

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

This article describes the preparation of freshly obtained melanoma tissue into primary cell cultures, and how to remove contaminations of erythrocytes and fibroblasts from the tumor cells. Finally, we describe how CD133+ putative melanoma stem cells are sorted from the CD133- bulk using Magnetic Activated Cell Sorting (MACS).

Paziente coltura cellulare derivato e isolamento di CD133<sup&gt; +</sup&gt; Putativi staminali alle cellule tumorali di melanoma

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a novel platform that allows for direct long-term visualization of tissue structure changes intracranially. Imaging at a single cell resolution in a real-time fashion provides supplementary dynamic information beyond that provided by standard end-point histological analysis, which looks solely at 'snap-shot' cross sections of tissue.
Establishing this intravital imaging technique in fluorescent chimeric mice, we are able to image four fluorescent channels simultaneously. By incorporating fluorescently labeled cells, such as GFP+ bone marrow, it is possible to track the fate of these cells studying their long-term migration, integration and differentiation within tissue. Further integration of a secondary reporter cell, such as an mCherry glioma tumor line, allows for characterization of cell:cell interactions. Structural changes in the tissue microenvironment can be highlighted through the addition of intra-vital dyes and antibodies, for example CD31 tagged antibodies and Dextran molecules.
Moreover, we describe the combination of our ICW imaging model with a small animal micro-irradiator that provides stereotactic irradiation, creating a platform through which the dynamic tissue changes that occur following the administration of ionizing irradiation can be assessed.
Current limitations of our model include penetrance of the microscope, which is limited to a depth of up to 900 &mu;m from the sub cortical surface, limiting imaging to the dorsal axis of the brain. The presence of the skull bone makes the ICW a more challenging technical procedure, compared to the more established and utilized chamber models currently used to study mammary tissue and fat pads 5-7. In addition, the ICW provides many challenges when optimizing the imaging.

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We describe a novel in vivo imaging technique that couples fluorescent chimeric mice with intracranial windows and high-resolution 2-photon microscopy. This imaging platform aids studies of dynamic changes in brain tissue and microvasculature, at a single-cell level, following pathological insults and is adaptable to assess intracranial drug delivery and distribution.

Un romanzo ad alta risoluzione<em&gt; In vivo</em&gt; Tecnica di imaging per studiare la risposta dinamica di strutture intracraniche alla crescita del tumore e Terapeutica

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a ...

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell (CTC) Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

The majority of cancer-related deaths occur subsequent to the development of metastatic disease. This highly lethal disease stage is associated with the presence of circulating tumor cells (CTCs). These rare cells have been demonstrated to be of clinical significance in metastatic breast, prostate, and colorectal cancers. The current gold standard in clinical CTC detection and enumeration is the FDA-cleared CellSearch system (CSS). This manuscript outlines the standard protocol utilized by this platform as well as two&#160;additional adapted protocols that describe the detailed process of user-defined marker optimization for protein characterization of patient CTCs and a comparable protocol for CTC capture in very low volumes of blood, using standard CSS reagents, for studying in vivo preclinical mouse models of metastasis. In addition, differences in CTC quality between healthy donor blood spiked with cells from tissue culture versus patient blood samples are highlighted. Finally, several commonly discrepant items that can lead to CTC misclassification errors are outlined. Taken together, these protocols will provide a useful resource for users of this platform interested in preclinical and clinical research pertaining to metastasis and CTCs.

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell CTC Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

Circulating tumor cells (CTCs) are prognostic in several metastatic cancers. This manuscript describes the gold standard CellSearch system (CSS) CTC enumeration platform and highlights common misclassification errors. In addition, two&#160;adapted protocols are described for user-defined marker characterization of CTCs and CTC enumeration in preclinical mouse models of metastasis using this technology.

Adattamento del semiautomatico circolanti (CTC) Saggi Tumor Cell per applicazioni cliniche e di ricerca preclinica

The majority of cancer-related deaths occur subsequent to the development of metastatic disease. This highly lethal disease stage is associated with the ...

Evaluation of Stem Cell Properties in Human Ovarian Carcinoma Cells Using Multi and Single Cell-based Spheres Assays

Years of research indicates that ovarian cancers harbor a heterogeneous mixture of cells including a subpopulation of so-called &#8220;cancer stem cells&#8221; (CSCs) responsible for tumor initiation, maintenance and relapse following conventional chemotherapies. Identification of ovarian CSCs is therefore an important goal. A commonly used method to assess CSC potential in vitro is the spheres assay in which cells are plated under non-adherent culture conditions in serum-free medium supplemented with growth factors and sphere formation is scored after a few days. Here, we review currently available protocols for human ovarian cancer spheres assays and perform a side-by-side analysis between commonly used multi cell-based assays and a more accurate system based on single cell plating. Our results indicate that both multi cell-based as well as single cell-based spheres assays can be used to investigate sphere formation in vitro. The more laborious and expensive single cell-based assays are more suitable for functional assessment of individual cells and lead to overall more accurate results while multi cell-based assays can be strongly influenced by the density of plated cells and require titration experiments upfront. Methylcellulose supplementation to multi cell-based assays can be effectively used to reduce mechanical artifacts.

In vitro spheres assays are commonly used to identify cancer stem cells. Here we compare single with multi cell-based spheres assays. The more laborious single cell-based assays or methylcellulose supplementation give more accurate results while multi cell-based assays performed in liquid medium can be highly influenced by cell density.

La valutazione delle proprietà sulle cellule staminali in cellule di carcinoma ovarico umano Utilizzo multi e single cell-based Spheres Assays

Years of research indicates that ovarian cancers harbor a heterogeneous mixture of cells including a subpopulation of so-called &#8220;cancer stem ...

Primary Tumor and MEF Cell Isolation to Study Lung Metastasis

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered genotypes now possess the ability to invade and survive in other tissues. In this protocol, mouse mammary tumors are removed and primary cells are prepared from tumors. The cells isolated from this procedure are then available for gene profiling experiments. For successful metastasis, these cells must be able to intravasate, survive in circulation, extravasate to distant organs, and survive in that new organ system. The lungs are the typical target of breast cancer metastasis. A set of genes have been discovered that mediates the selectivity of metastasis to the lung. Here we describe a method of studying lung metastasis from a genetically engineered mouse model.. Furthermore, another protocol for analyzing mouse embryonic fibroblasts (MEFs) from the mouse embryo is included. MEF cells from the same animal type provide a clue of non-cancer cell gene expression. Together, these techniques are useful in studying mouse mammary tumorigenesis, its associated signaling mechanisms and pathways of the abnormalities in embryos.

The goal of this protocol is to study breast tumorigenesis. With this technique, mouse mammary tumors are removed and primary cells are prepared from tumors. A lung extraction protocol is included for studying lung metastasis. Furthermore, another protocol for analyzing mouse embryonic fibroblasts from the mouse embryo is included.

Tumore primario e isolamento delle cellule MEF per studiare Lung Metastasi

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered ...

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

Blood-brain barrier (BBB) coverage plays a central role in the homeostasis of the central nervous system (CNS). The BBB is dynamically maintained by astrocytes, pericytes and brain endothelial cells (BECs). Here, we detail methods to assess BBB coverage using single cultures of immortalized human BECs, single cultures of primary mouse BECs, and a humanized triple culture model (BECs, astrocytes and pericytes) of the BBB. To highlight the applicability of the assays to disease states, we describe the effect of oligomeric amyloid-&#946; (oA&#946;), which is an important contributor to Alzheimer&#39;s disease (AD) progression, on BBB coverage. Further, we utilize the epidermal growth factor (EGF) to illuminate the drug screening potential of the techniques. Our results show that single and triple cultured BECs form meshwork-like structures under basal conditions, and that oA&#946; disrupts this cell meshwork formation and degenerates the preformed mesh structures, but EGF blocks this disruption. Thus, the techniques described are important for dissecting fundamental and disease-relevant processes that modulate BBB coverage.

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

Maintaining blood-brain barrier coverage is key for the homeostasis of the central nervous system. This protocol describes in vitro techniques to delineate the fundamental and pathological processes that modulate blood-brain barrier coverage.

In vitro dosaggi per valutare la formazione e la rottura del vaso come la barriera emato-cerebrale

Blood-brain barrier (BBB) coverage plays a central role in the homeostasis of the central nervous system (CNS). The BBB is dynamically maintained by ...

Sampling Strategies and Processing of Biobank Tissue Samples from Porcine Biomedical Models

In translational medical research, porcine models have steadily become more popular. Considering the high value of individual animals, particularly of genetically modified pig models, and the often-limited number of available animals of these models, establishment of (biobank) collections of adequately processed tissue samples suited for a broad spectrum of subsequent analyses methods, including analyses not specified at the time point of sampling, represent meaningful approaches to take full advantage of the translational value of the model. With respect to the peculiarities of porcine anatomy, comprehensive guidelines have recently been established for standardized generation of representative, high-quality samples from different porcine organs and tissues. These guidelines are essential prerequisites for the reproducibility of results and their comparability between different studies and investigators. The recording of basic data, such as organ weights and volumes, the determination of the sampling locations and of the numbers of tissue samples to be generated, as well as their orientation, size, processing and trimming directions, are relevant factors determining the generalizability and usability of the specimen for molecular, qualitative, and quantitative morphological analyses. Here, an illustrative, practical, step-by-step demonstration of the most important techniques for generation of representative, multi-purpose biobank specimen from porcine tissues is presented. The methods described here include determination of organ/tissue volumes and densities, the application of a volume-weighted systematic random sampling procedure for parenchymal organs by point-counting, determination of the extent of tissue shrinkage related to histological embedding of samples, and generation of randomly oriented samples for quantitative stereological analyses, such as isotropic uniform random (IUR) sections generated by the &#34;Orientator&#34; and &#34;Isector&#34; methods, and vertical uniform random (VUR) sections.

The practical application and performance of methods for generation of representative tissue samples of porcine animal models for a broad spectrum of downstream analyses in biobank projects are demonstrated, including volumetry, systematic random sampling, and differential processing of tissue samples for qualitative and quantitative morphologic and molecular analyses types.

Strategie di campionamento e trattamento dei campioni di tessuto Biobank Porcine modelli biomedicale

In translational medical research, porcine models have steadily become more popular. Considering the high value of individual animals, particularly of ...