Questo lavoro è stato finanziato da NEI e NIMH.

1. VideoSwitcher 1,1. Collegare VideoSwitcher a un computer Il VideoSwitcher (figura 1) riceve video analogica (VGA) ingressi e viene utilizzato per pilotare tubo catodico (CRT) monitor a colori. Prima di utilizzare il VideoSwitcher, assicurarsi che la scheda grafica del computer o ha una porta VGA (Figura 2A) o un Digital Visual Interface (DVI-I) porta (Figura 2B) che trasmette entrambi i segnali video analogici e digitali. A DVI-to-VGA (Figura 2C) è necessario per collegare la porta DVI-I al VideoSwitcher. Spegnere il computer e il monitor e scollegare il monitor dalla scheda grafica del computer. Collegare il VGA o DVI-I della scheda grafica del computer alla porta di ingresso del VideoSwitcher utilizzando il cavo VGA. Utilizzare un piccolo cacciavite per fissare i collegamenti. Collegare il cavo VGA del monitor alla porta di uscita di uno VideoSwitchernd fissare i collegamenti. Collegare il VideoSwitcher a una presa elettrica utilizzando l&#39;alimentatore in dotazione. Accendere il computer e il monitor. 1,2. Due modalità di visualizzazione del switcher video Il pulsante sulla VideoSwitcher consente all&#39;utente di passare avanti e indietro in due modalità di visualizzazione. Nella modalità a colori, il VideoSwitcher non altera il segnale video dalla scheda grafica del computer. Nella scala di grigi, il display diventa monocromatico, con la sua luminosità determinata principalmente dal segnale video dal canale blu della scheda grafica, leggermente influenzata dal segnale del canale rosso, e nessun contributo dal canale verde. Ciò è perché la rete oppositore all&#39;interno del VideoSwitcher attenua il segnale dal canale rosso di un fattore di circa 128, e il segnale dal canale verde non contribuisce affatto. Il rapporto dei contributi di uno blud canali rosso per l&#39;uscita del VideoSwitcher è chiamato blu-rosso rapporto (BRratio). Il BRratio è di proprietà di uno Switcher Video, indipendente dalla configurazione del display. Esso può essere determinato sperimentalmente per ogni VideoSwitcher (vedi 1.3). La modalità di visualizzazione può anche essere attivata inviando un segnale speciale attraverso il canale verde della scheda grafica utilizzando una chiamata di funzione in Matlab: PsychVideoSwitcher (&#39;switching&#39;, whichScreen, ToGrayMode); dove ToGrayMode di 1 o 0 mezzi per passare alla modalità a colori o in scala di grigi. La figura 3 mostra lo schema di un VideoSwitcher. 1,3. Misurare BRratio Il BRratio può essere misurato per ogni VideoSwitcher utilizzando una squadra reticolo compito onda di rilevamento. I due livelli di onda quadra vengono assegnati valori RGB come (0, 0, 40) e (x, 0, 39). Si può regolare il valore di x fino a quando il reticolo ad onda quadrascompare, a questo punto il valore x è il BRratio --- la grandezza del segnale in R-canale che porta l&#39;intensità prodotta da una unità di segnale in B-canale. Anche se si può misurare la BRratio elettronica, ad esempio per misurare il rapporto tra le uscite di tensione di un VideoSwitcher a valori RGB di (0, 0, 255) e (255, 0, 0), il metodo psicofisico qui descritto è molto semplice e accurate. 1,4. Calibrazione monitor Per la maggior parte dei monitor, la luminosità del display non aumenta linearmente con il livello di pixel grigio specificato dalla scheda grafica del computer. La relazione può essere descritto come: <img src="/files/ftp_upload/3312/3312eq1.jpg" alt="Equazione 1" /> dove L max, L min e γ sono determinate con una procedura di correzione gamma, utilizzando fotometri o da una combinazione di procedure psicofisiche e misurazioni fotometriche 7,8. Gamma di calibrazione è important per la produzione di contrasti precisi su un display, ma deve essere eseguita per ogni periferica di visualizzazione. Con un fotometro, si può semplicemente visualizzare una grande piazza uniforme a graylevels pixel differenti (ad esempio, da 0 a 255), misurare la luminanza del centro della piazza, e montare i risultati con l&#39;equazione 1 per ottenere γ. La procedura implica la creazione psicofisica, in una zona della superficie di visualizzazione, il più uniforme possibile una miscela (nello spazio e nel tempo) di quantità uguali di zero e piena intensità pixel e determina il valore livello di grigio del pixel in un&#39;area adiacente omogenea ( in cui tutti i pixel hanno la stessa intensità) che produce una corrispondenza psicofisico alla luminanza del pixel zona mista. La prima corrispondenza determina il valore di livello di grigio per 1/2 di luminanza massima. Una miscela di pixel con intensità di luminanza 1/2 e 1 viene utilizzato per determinare il 3/4 valore, e questa procedura viene ripetuta fino a sette valori from 1/8 a 7/8 sono state determinate. Questi risultati sono ripetuti, e molteplici controlli per verificare la coerenza sono fatte, come verificare che una miscela di 3/4 e 1/4 partite 1/2. In questa procedura, sia il livello B e R della zona omogenea vengono regolati, e U = B + R / BRratio. I risultati possono essere inseriti con l&#39;Equazione 1 per ottenere γ. Dopo si ottengono valori di L min, max e L γ, possiamo impostare la luminosità di fondo L 0 = (L max + L min) / 2, Il rapporto tra contrasto c pixel (U) e il livello di pixel grigio U è il seguente: <img src="/files/ftp_upload/3312/3312eq2.jpg" alt="Equazione 2" /> Possiamo riscrivere l&#39;equazione da risolvere per il livello richiesto grigio per un contrasto dato: <img src="/files/ftp_upload/3312/3312eq3.jpg" alt="Equazione 3" /> dove U è normalmente un numero non intero. Il valore RGB del pixel corrispondente è: R = BRratio * [U int-(U)], G = 0, B =int (U), dove int () prende il valore intero del suo apporto. 1,5. Demo di un reticolo di un&#39;onda sinusoidale L&#39;effetto di un aumento della scala di grigi risoluzione può essere dimostrato dal confronto di due reticoli di onde sinusoidali. La griglia a sinistra utilizza l&#39;intera capacità del VideoSwitcher con ogni intensità dei pixel specificata dal R appropriato e valori B. La griglia a destra è la stessa di quella di sinistra eccetto che solo la U arrotondato viene usato come valore di ciascun pixel B, simulando l&#39;uscita di un 8-bit dispositivo di visualizzazione. 2. RTbox 2,1. Collegare il RTbox a un computer Collegare il RTbox (Figura 4) ad una porta USB di un computer con il cavo fornito. Se necessario, scaricare il driver del dispositivo da <a href="http://www.ftdichip.com/Drivers/VCP.htm">http://www.ftdichip.com/Drivers/VCP.htm</a> . Installare il driver seguendo le istruzioni sul sito. 2,2. Usare il RTbox per misurare il tempo di risposta Il RTbox può essere utilizzato in due modi diversi. Se il programma l&#39;utente può tornare affidabili tempi di inizio di stimolo, come ad esempio l&#39;orario restituito da Screen (&#39;Flip&#39;) e PsychPortAudio in Psychtoolbox [8], il RTbox può essere utilizzato come una tastiera. Poiché tempi di inizio e di stimolo volte il tasto RTbox si basano gli orologi del computer host e il RTbox, rispettivamente, dobbiamo sincronizzare i due orologi. Questo viene fatto con un RTBox chiamata di funzione (&#39;clear&#39;) prima di ogni inizio stimolo a cancellare gli eventi indesiderati nel buffer. Il tempo di risposta può essere semplicemente misurata come resp t = t - t esordio, dove tonset è lo stimolo restituito dal programma utente, e t è il tempo pulsante restituito dalla chiamata di funzione [t, tasto] = RTBox (timeout). Questo è perché il driver RTBox converte automaticamente il tempo di Button dal momento RTbox per ospitare tempo-macchina. Se il programma utente non puòtornare affidabili tempi di inizio di stimolo, i segnali di comando indicano insorgenze di stimolo deve essere fornita al RTbox. Una soluzione è quella di utilizzare un sensore di luce per rilevare l&#39;inizio dello stimolo o una macchia di luce che è sincronizzato allo stimolo. L&#39;uscita del sensore di luce è collegato alla porta luce del RTbox. Una seconda soluzione è quella di utilizzare l&#39;uscita trigger del VideoSwitcher. Il grilletto può essere direttamente collegato alla porta polso del RTbox. Una terza soluzione è quella di collegare il segnale audio del computer host alla porta del suono RTbox. Per generare un trigger insorgenza stimolo dalla VideoSwitcher, ci &quot;accendere&quot; il canale verde dei pixel nella porzione centrale del primo frame dello stimolo visivo. Poiché non contribuisce alla rete di resistenza, il segnale nel canale verde è invisibile al soggetto. Una chiamata di funzione [t, tasto] = RTBox (&#39;pulse&#39;, timeout) restituisce il tempo di risposta, dove &#39;pulse&#39; indica al RTbox per calcolare t<html> egli risposta relativa al tempo di attivazione. La chiamata di funzione viene utilizzato lo stesso per il trigger del suono. Per i trigger del sensore di luminosità, la chiamata di funzione è [t, tasto] = RTBox (&#39;luce&#39;, timeout). 3. Integrare VideoSwitcher e RTbox Abbiamo programmato un programma dimostrativo che utilizza la VideoSwitcher per controllare la visualizzazione, la RTbox per raccogliere l&#39;ora esatta di risposta, e la RTbox ad inviare il codice evento e le risposte ad un sistema ERP. Il programma può essere scaricato dal <a href="http://lobes.usc.edu/videoswitcher/VideoSwitcherRTBoxERP_demo.m">http://lobes.usc.edu/videoswitcher/VideoSwitcherRTBoxERP_demo.m</a> . 4. Risultati rappresentativi <img src="/files/ftp_upload/3312/3312fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Immagine di uno switcher video. Dispone di ingresso VGA e porte di uscita (sia femmina), un pulsante per commutare tra due modalità di visualizzazione, e una porta di uscita trigger. ONTENUTO &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/3312/3312fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Immagini Figura 2. Di VGA (A) e DVI-I (B) porti e uno DVI-I a VGA (C). <img src="/files/ftp_upload/3312/3312fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Lo schema di un commutatore video. Il multiplexer ha due modalità di input, controllati da un livello di tensione. Quando è nella modalità mostrato nello schema, i canali RGB di un monitor ricevono lo stesso segnale, quindi il display è in scala di grigi. La tensione di commutazione viene generata da un chip CPLD, controllato da segnali di G-canale e l&#39;interruttore. Il trigger è anche controllato dal ingresso nel G-canale. <img src="/files/ftp_upload/3312/3312fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Immagine di un RTbox. Ha un USB-B, una porta di ingresso della luce, un impulso / sound porta di ingresso, una porta di ingresso pulsante esterno, e una porta di uscita TTL.

<ol>
	<li>Li, X., Lu, Z. -. L., Xu, P., Jin, J., Zhou, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+high+gray-level+resolution+monochrome+displays+with+conventional+computer+graphics+cards+and+color+monitors.">Generating high gray-level resolution monochrome displays with conventional computer graphics cards and color monitors.</a> Journal of Neuroscience Methods. 130 (1), 9-18 (2003).</li><li>Pelli, D. G., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+control+of+contrast+on+microcomputer+displays.">Accurate control of contrast on microcomputer displays.</a> Vision Research. 31, 1337-1350 (1991).</li><li>Li, X., Liang, Z., Kleiner, M., Lu, Z. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RTbox:+A+device+for+highly+accurate+response+time+measurements.">RTbox: A device for highly accurate response time measurements.</a> Behavior Research Methods. 42 (1), 212-225 (2010).</li><li>Lu, Z. L., Sperling, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Second-order+reversed+phi.">Second-order reversed phi.</a> Perception Psychophysics. 61, 1075-1088 (1999).</li><li>Colombo, E., Derrington, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+calibration+of+CRT+monitors.">Visual calibration of CRT monitors.</a> Displays. 22, 87-95 (2001).</li></ol>

Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

Il switcher video fornisce un metodo compatto, economico e facile da usare per generare risoluzione display ad elevata luminosità con i convenzionali computer grafica carte e monitor a colori analogica. E &#39;collegato tra le uscite analogiche della scheda grafica e monitor. Si può anche passare da una modalità di visualizzazione monocromatiche e cromatica, fornendo ulteriore comodità. Il suo canale di trigger permette ai ricercatori di sincronizzare altre apparecchiature per schermi visivi. <p class="jove_cont...

enabling high grayscale resolution displays and accurate response time measurements on conventional computers

Mostra i sistemi basati su schede grafiche convenzionali computer sono in grado di generare immagini con risoluzione 8-bit livello di grigio. Tuttavia, la maggior parte degli esperimenti di ricerca sulla visione richiedono display con più di 12 bit di risoluzione di luminanza. Diverse soluzioni sono disponibili. Bit + + 1 e 2 DataPixx utilizzare il Digital Visual Interface (DVI) Uscita dalle schede grafiche e ad alta risoluzione (14 o 16-bit) digital-to-convertitori analogico per pilotare dispositivi di visualizzazione analogici. Il 3 VideoSwitcher qui descritto combina i segnali video analogici dai canali rosso e blu di schede grafiche con pesi diversi utilizzando una rete passiva oppositore 4 e un circuito attivo per fornire segnali video identici ai tre canali di monitor a colori. Il metodo fornisce un modo economico per consentire display ad alta risoluzione monocromatiche utilizzando convenzionali schede grafiche e monitor analogici. Essa può anche fornire i segnali di comando che possono essere usati per contrassegnareinsorgenze di stimolo, rendendo semplice la sincronizzazione visual con le registrazioni fisiologiche o misure di tempo di risposta. Sebbene tastiere dei computer e mouse sono frequentemente utilizzati per misurare tempi di risposta (RT), l&#39;accuratezza di tali misurazioni è piuttosto basso. Il RTbox è un hardware specializzato e la soluzione software per misure accurate RT. Collegato al computer host tramite una connessione USB, il conducente del RTbox è compatibile con tutti i sistemi operativi convenzionali. Esso utilizza un clock del microprocessore e ad alta risoluzione per registrare le identità e le tempistiche di eventi dei pulsanti, che sono tamponati fino a quando il computer host li recupera. Gli eventi registrati pulsanti non sono influenzati da incertezze temporali o potenziali pregiudizi associati alla trasmissione ed elaborazione dei dati nel computer host. Lo stoccaggio asincrono semplifica notevolmente la progettazione di programmi utente. Sono disponibili diversi metodi per sincronizzare gli orologi del RTbox e banca dati informatizzata di accoglienzaer. Il RTbox può anche ricevere impulsi esterni e possono essere usate per misurare la RT in relazione ad eventi esterni. Sia VideoSwitcher RTbox e sono disponibili per gli utenti ad acquistare. Le informazioni pertinenti e molti programmi dimostrativi sono disponibili all&#39;indirizzo <a href="http://lobes.usc.edu/">http://lobes.usc.edu/</a> .

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Enabling High Grayscale Resolution Displays and Accurate Response Time Measurements on Conventional Computers

Hardware del computer convenzionale non può generare gli stimoli visivi con sufficientemente alta risoluzione in scala di grigi tempi di risposta e misurare con sufficiente accuratezza. Ci descrivono come utilizzare il VideoSwitcher per la produzione di display ad alta risoluzione monocromatiche, e la RTbox per misurare i tempi di risposta con elevata precisione su hardware convenzionale.

Abilitazione ad alta risoluzione display in scala di grigi e misurazioni accurate Tempo di risposta su computer convenzionali

Display systems based on conventional computer graphics cards are capable of generating images with 8-bit gray level resolution. However, most experiments ...

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Transient and Steady-state Response Analysis

SCIENTISTS IN ACTION

9.3K Views.  The Ohio State University. Hardware del computer convenzionale non può generare gli stimoli visivi con sufficientemente alta risoluzione in scala di grigi tempi di risposta e misurare con sufficiente accuratezza. Ci descrivono come utilizzare il VideoSwitcher per la produzione di display ad alta risoluzione monocromatiche, e la RTbox per misurare i tempi di risposta con elevata precisione su hardware convenzionale.

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An Organotypic Slice Assay for High-Resolution Time-Lapse Imaging of Neuronal Migration in the Postnatal Brain

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as well as differentiation and integration of new neurons into existing neural circuits. For postnatal neurogenesis in the olfactory bulbs, these events are segregated within three anatomically distinct domains: proliferation largely occurs in the subependymal zone (SEZ) of the lateral ventricles, migrating neuroblasts traverse through the rostral migratory stream (RMS), and new neurons differentiate and integrate within the olfactory bulbs (OB). The three domains serve as ideal platforms to study the cellular, molecular, and physiological mechanisms that regulate each of the biological events distinctly. This paper describes an organotypic slice assay optimized for postnatal brain tissue, in which the extracellular conditions closely mimic the in vivo environment for migrating neuroblasts. We show that our assay provides for uniform, oriented, and speedy movement of neuroblasts within the RMS. This assay will be highly suitable for the study of cell autonomous and non-autonomous regulation of neuronal migration by utilizing cross-transplantation approaches from mice on different genetic backgrounds.

This protocol describes an organotypic slice assay optimized for the postnatal brain and high-resolution time-lapse imaging of neuroblast migration in the rostral migratory stream.

Un saggio Slice organotipica per High-Resolution Time-Lapse Imaging della migrazione neuronale nel cervello postnatale

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as ...

Ricerca

Neuroscienze

A Rapid Approach to High-Resolution Fluorescence Imaging in Semi-Thick Brain Slices

A fundamental goal to both basic and clinical neuroscience is to better understand the identities, molecular makeup, and patterns of connectivity that are characteristic to neurons in both normal and diseased brain. Towards this, a great deal of effort has been placed on building high-resolution neuroanatomical maps1-3. With the expansion of molecular genetics and advances in light microscopy has come the ability to query not only neuronal morphologies, but also the molecular and cellular makeup of individual neurons and their associated networks4. Major advances in the ability to mark and manipulate neurons through transgenic and gene targeting technologies in the rodent now allow investigators to 'program' neuronal subsets at will5-6. Arguably, one of the most influential contributions to contemporary neuroscience has been the discovery and cloning of genes encoding fluorescent proteins (FPs) in marine invertebrates7-8, alongside their subsequent engineering to yield an ever-expanding toolbox of vital reporters9. Exploiting cell type-specific promoter activity to drive targeted FP expression in discrete neuronal populations now affords neuroanatomical investigation with genetic precision.
Engineering FP expression in neurons has vastly improved our understanding of brain structure and function. However, imaging individual neurons and their associated networks in deep brain tissues, or in three dimensions, has remained a challenge. Due to high lipid content, nervous tissue is rather opaque and exhibits auto fluorescence. These inherent biophysical properties make it difficult to visualize and image fluorescently labelled neurons at high resolution using standard epifluorescent or confocal microscopy beyond depths of tens of microns. To circumvent this challenge investigators often employ serial thin-section imaging and reconstruction methods10, or 2-photon laser scanning microscopy11. Current drawbacks to these approaches are the associated labor-intensive tissue preparation, or cost-prohibitive instrumentation respectively.
Here, we present a relatively rapid and simple method to visualize fluorescently labelled cells in fixed semi-thick mouse brain slices by optical clearing and imaging. In the attached protocol we describe the methods of: 1) fixing brain tissue in situ via intracardial perfusion, 2) dissection and removal of whole brain, 3) stationary brain embedding in agarose, 4) precision semi-thick slice preparation using new vibratome instrumentation, 5) clearing brain tissue through a glycerol gradient, and 6) mounting on glass slides for light microscopy and z-stack reconstruction (Figure 1).
For preparing brain slices we implemented a relatively new piece of instrumentation called the 'Compresstome' VF-200 (http://www.precisionary.com/products_vf200.html). This instrument is a semi-automated microtome equipped with a motorized advance and blade vibration system with features similar in function to other vibratomes. Unlike other vibratomes, the tissue to be sliced is mounted in an agarose plug within a stainless steel cylinder. The tissue is extruded at desired thicknesses from the cylinder, and cut by the forward advancing vibrating blade. The agarose plug/cylinder system allows for reproducible tissue mounting, alignment, and precision cutting. In our hands, the 'Compresstome' yields high quality tissue slices for electrophysiology, immunohistochemistry, and direct fixed-tissue mounting and imaging. Combined with optical clearing, here we demonstrate the preparation of semi-thick fixed brain slices for high-resolution fluorescent imaging.

Here we describe a rapid and simple method to image fluorescently labeled cells in semi-thick brain slices. By fixing, slicing, and optically clearing brain tissue we describe how standard epifluorescent or confocal imaging can be used to visualize individual cells and neuronal networks within intact nervous tissue.

Un metodo rapido per High-Resolution Imaging di fluorescenza in semi-spessa fettine di cervello

A fundamental goal to both basic and clinical neuroscience is to better understand the identities, molecular makeup, and patterns of connectivity that are ...

High-resolution Functional Magnetic Resonance Imaging Methods for Human Midbrain

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon measuring activity on the surface of cerebral cortex rather than in subcortical regions such as midbrain and brainstem. Subcortical fMRI must overcome two challenges: spatial resolution and physiological noise. Here we describe an optimized set of techniques developed to perform high-resolution fMRI in human SC, a structure on the dorsal surface of the midbrain; the methods can also be used to image other brainstem and subcortical structures.
High-resolution (1.2 mm voxels) fMRI of the SC requires a non-conventional approach. The desired spatial sampling is obtained using a multi-shot (interleaved) spiral acquisition1. Since, T2* of SC tissue is longer than in cortex, a correspondingly longer echo time (TE ~ 40 msec) is used to maximize functional contrast. To cover the full extent of the SC, 8-10 slices are obtained. For each session a structural anatomy with the same slice prescription as the fMRI is also obtained, which is used to align the functional data to a high-resolution reference volume.
In a separate session, for each subject, we create a high-resolution (0.7 mm sampling) reference volume using a T1-weighted sequence that gives good tissue contrast. In the reference volume, the midbrain region is segmented using the ITK-SNAP software application2. This segmentation is used to create a 3D surface representation of the midbrain that is both smooth and accurate3. The surface vertices and normals are used to create a map of depth from the midbrain surface within the tissue4.
Functional data is transformed into the coordinate system of the segmented reference volume. Depth associations of the voxels enable the averaging of fMRI time series data within specified depth ranges to improve signal quality. Data is rendered on the 3D surface for visualization.
In our lab we use this technique for measuring topographic maps of visual stimulation and covert and overt visual attention within the SC1. As an example, we demonstrate the topographic representation of polar angle to visual stimulation in SC.

This article describes techniques to perform high-resolution functional magnetic resonance imaging with 1.2 mm sampling in human midbrain and subcortical structures using a 3T scanner. Use of these techniques to resolve topographic maps of visual stimulation in the human superior colliculus (SC) is given as an example.

Ad alta risoluzione magnetica funzionale per immagini Metodi risonanza per mesencefalo umano

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon ...

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central nervous system (CNS). Although much is known about the molecular mechanisms that pattern the spinal cord and elicit neuronal differentiation1, 2, we lack a deep understanding of these early events at the level of cell behavior. It is thus critical to study the behavior of neural progenitors in real time as they undergo neurogenesis.
In the past, real-time imaging of early embryonic tissue has been limited by cell/tissue viability in culture as well as the phototoxic effects of fluorescent imaging. Here we present a novel assay for imaging such tissue for long periods of time, utilizing a novel ex vivo slice culture protocol and wide-field fluorescence microscopy (Fig. 1). This approach achieves long-term time-lapse monitoring of chick embryonic spinal cord progenitor cells with high spatial and temporal resolution.
This assay may be modified to image a range of embryonic tissues3, 4 In addition to the observation of cellular and sub-cellular behaviors, the development of novel and highly sensitive reporters for gene activity (for example, Notch signaling5) makes this assay a powerful tool with which to understand how signaling regulates cell behavior during embryonic development.

Imaging embryonic tissue in real-time is challenging over long periods of time. Here we present an assay for monitoring cellular and sub-cellular changes in chick spinal cord for long periods with high spatial and temporal resolution. This technique can be adapted for other regions of the nervous system and developing embryo.

Imaging ad alta risoluzione dal vivo del comportamento delle cellule in via di sviluppo neuroepitelio

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

In Vivo Electrophysiological Measurements on Mouse Sciatic Nerves

Electrophysiological studies allow a rational classification of various neuromuscular diseases and are of help, together with neuropathological techniques, in the understanding of the underlying pathophysiology1. Here we describe a method to perform electrophysiological studies on mouse sciatic nerves in vivo.
The animals are anesthetized with isoflurane in order to ensure analgesia for the tested mice and undisturbed working environment during the measurements that take about 30 min/animal. A constant body temperature of 37 &#176;C is maintained by a heating plate and continuously measured by a rectal thermo probe2. Additionally, an electrocardiogram (ECG) is routinely recorded during the measurements in order to continuously monitor the physiological state of the investigated animals.
Electrophysiological recordings are performed on the sciatic nerve, the largest nerve of the peripheral nervous system (PNS), supplying the mouse hind limb with both motoric and sensory fiber tracts. In our protocol, sciatic nerves remain in situ and therefore do not have to be extracted or exposed, allowing measurements without any adverse nerve irritations along with actual recordings. Using appropriate needle electrodes3 we perform both proximal and distal nerve stimulations, registering the transmitted potentials with sensing electrodes at gastrocnemius muscles. After data processing, reliable and highly consistent values for the nerve conduction velocity (NCV) and the compound motor action potential (CMAP), the key parameters for quantification of gross peripheral nerve functioning, can be achieved.

In Vivo Electrophysiological Measurements on Mouse Sciatic Nerves

Measurements of nerve conduction properties in vivo exemplify a powerful tool to characterize various animal models of neuromuscular diseases. Here, we present an easy and reliable protocol by which electrophysiological analysis on sciatic nerves of anesthetized mice can be performed.

In Misure Vivo elettrofisiologici sui nervi mouse sciatico

Electrophysiological studies allow a rational classification of various neuromuscular diseases and are of help, together with neuropathological ...

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for maintenance, repair or neurodegeneration in postdevelopmental periods. High throughput analyses have recently revealed that axons have a more dynamic and complex transcriptome than previously expected. These analysis, however have been mostly done in cultured neurons where axons can be isolated from the somato-dendritic compartments. It is virtually impossible to achieve such isolation in whole tissues in vivo. Thus, in order to verify the recruitment of mRNAs and their functional relevance in a whole animal, transcriptome analyses should ideally be combined with techniques that allow the visualization of mRNAs in situ. Recently, novel ISH technologies that detect RNAs at a single-molecule level have been developed. This is especially important when analyzing the subcellular localization of mRNA, since localized RNAs are typically found at low levels. Here we describe two protocols for the detection of axonally-localized mRNAs using a novel ultrasensitive RNA ISH technology. We have combined RNAscope ISH with axonal counterstain using fluorescence immunohistochemistry or histological dyes to verify the recruitment of Atf4 mRNA to axons in vivo in the mature mouse and human brains.

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

RNA in situ hybridization (ISH) enables the visualization of RNAs in cells and tissues. Here we show how combination of RNAscope ISH with immunohistochemistry or histological dyes can be successfully used to detect mRNAs localized to axons in sections of mouse and human brains.

Rilevazione di assoni localizzato mRNA nelle sezioni del cervello Utilizzando ad alta risoluzione<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for ...

High-resolution Structural Magnetic Resonance Imaging of the Human Subcortex In Vivo and Postmortem

The focus of this study was to test the resolution limits of structural MRI of a postmortem brain compared to living human brains. The resolution of structural MRI in vivo is ultimately limited by physiological noise, including pulsation, respiration and head movement. Although imaging hardware continues to improve, it is still difficult to resolve structures on the millimeter scale. For example, the primary visual sensory pathways synapse at the lateral geniculate nucleus (LGN), a visual relay and control nucleus in the thalamus that normally is organized into six interleaved monocular layers. Neuroimaging studies have not been able to reliably distinguish these layers due their small size that are less than 1 mm thick.
The resolving limit of structural MRI, in a postmortem brain was tested using multiple images averaged over a long duration (~24 h). The purpose was to test whether it was possible to resolve the individual layers of the LGN in the absence of physiological noise. A proton density (PD)1 weighted pulse sequence was used with varying resolution and other parameters to determine the minimum number of images necessary to be registered and averaged to reliably distinguish the LGN and other subcortical regions. The results were also compared to images acquired in living human brains. In vivo subjects were scanned in order to determine the additional effects of physiological noise on the minimum number of PD scans needed to differentiate subcortical structures, useful in clinical applications.

High-resolution Structural Magnetic Resonance Imaging of the Human Subcortex In Vivo and Postmortem

Here we present a protocol to determine the minimum number images that needed to be registered and averaged to resolve subcortical structures and test whether the individual layers of the LGN could be resolved in the absence of physiological noise.

Ad alta risoluzione strutturale Risonanza Magnetica del subcortex Umana<I&gt; In Vivo</I&gt; E Postmortem

The focus of this study was to test the resolution limits of structural MRI of a postmortem brain compared to living human brains. The resolution of ...

High-Resolution Quantitative Immunogold Analysis of Membrane Receptors at Retinal Ribbon Synapses

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA receptors (NMDARs) and AMPA receptors (AMPARs). Physiological data have indicated that glutamate receptors at RGCs are expressed not only in postsynaptic but also in perisynaptic or extrasynaptic membrane compartments. However, precise anatomical locations for glutamate receptors at RGC synapses have not been determined. Although a high-resolution quantitative analysis of glutamate receptors at central synapses is widely employed, this approach has had only limited success in the retina. We developed a postembedding immunogold method for analysis of membrane receptors, making it possible to estimate the number, density and variability of these receptors at retinal ribbon synapses. Here we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of retinal fixation, 2) freeze-substitution, 3) postembedding immunogold electron microscope (EM) immunocytochemistry and, 4) quantitative visualization of glutamate receptors at ribbon synapses.

The postembedding immunogold method is one of the most effective ways to provide high-resolution analyses of the subcellular localization of specific molecules. Here we describe a protocol to quantitatively analyze glutamate receptors at retinal ribbon synapses.

Risoluzione alta analisi quantitativa Immunogold di Recettori di membrana a retina nastro Sinapsi

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA ...

Triggering Cell Stress and Death Using Conventional UV Laser Confocal Microscopy

Using a standard confocal setup, a UV ablation method can be utilized to selectively induce cellular injury and to visualize single-cell responses and cell-cell interactions in the CNS in real-time. Previously, studying these cell-specific responses after injury often required complicated setups or the transfer of cells or animals into different, non-physiological environments, confounding immediate and short-term analysis. For example, drug-mediated ablation approaches often lack the specificity that is required to study single-cell responses and immediate cell-cell interactions. Similarly, while high-power pulsed laser ablation approaches provide very good control and tissue penetration, they require specialized equipment that can complicate real-time visualization of cellular responses. The refined UV laser ablation approach described here allows researchers to stress or kill an individual cell in a dose- and time-dependent manner using a conventional confocal microscope equipped with a 405-nm laser. The method was applied to selectively ablate a single neuron within a dense network of surrounding cells in the zebrafish spinal cord. This approach revealed a dose-dependent response of the ablated neurons, causing the fragmentation of cellular bodies and anterograde degeneration along the axon within minutes to hours. This method allows researchers to study the fate of an individual dying cell and, importantly, the instant response of cells-such as microglia and astrocytes-surrounding the ablation site.

Targeted manipulations to cause directed stress or death in individual cells have been relatively difficult to accomplish. Here, a single-cell-resolution ablation approach to selectively stress and kill individual cells in cell culture and living animals is described based on a standard confocal UV laser.

Attivazione delle cellule Lo stress e la morte con i convenzionali UV laser Microscopia confocale

Using a standard confocal setup, a UV ablation method can be utilized to selectively induce cellular injury and to visualize single-cell responses and ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network dynamics in neuronal cultures. In contrast with more traditional methods, such as patch-clamping, which can only record activity from a single cell, MEAs can record simultaneously from multiple sites in a network, without requiring the arduous task of placing each electrode individually. Moreover, numerous control and stimulation configurations can be easily applied within the same experimental setup, allowing for a broad range of dynamics to be explored. One of the key dynamics of interest in these in vitro studies has been the extent to which cultured networks display properties indicative of learning. Mouse neuronal cells cultured on MEAs display an increase in response following training induced by electrical stimulation. This protocol demonstrates how to culture neuronal cells on MEAs; successfully record from over 95% of the plated dishes; establish a protocol to train the networks to respond to patterns of stimulation; and sort, plot, and interpret the results from such experiments. The use of a proprietary system for stimulating and recording neuronal cultures is demonstrated. Software packages are also used to sort neuronal units. A custom-designed graphical user interface is used to visualize post-stimulus time histograms, inter-burst intervals, and burst duration, as well as to compare the cellular response to stimulation before and after a training protocol. Finally, representative results and future directions of this research effort are discussed.

Mouse neuronal cells cultured on multi-electrode arrays display an increase in response following electrical stimulation. This protocol demonstrates how to culture neurons, how to record activity, and how to establish a protocol to train the networks to respond to patterns of stimulation.

Aumento del tempo della risposta alla rete alla stimolazione delle colture cellulari neuronali sulle matrici di microelettrodi

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...