Questo protocollo è particolarmente adatto per lo screening genetico di mutanti Drosophila visivamente difettosi. Questo perché consentono il rilevamento anche di piccole anomalie nella fototrasduzione della Drosophila, in particolare nei livelli di fotopigmento e nelle funzioni correlate ai peer. Questa tecnica è profonda in vivo, è facile da eseguire e altamente robusta, consentendo la rilevazione di piccoli cambiamenti nell'attività delle proteine di fototrasduzione.
A mio parere, riparare le mosche mantenendo la vitalità è probabilmente la parte critica di questo metodo. Accendi il computer e apri il software Clampex. Accendere l'amplificatore e il generatore di impulsi Master-8, quindi accendere la lampada allo xeno e il controller dell'otturatore.
Accendere l'estrattore e posizionare un capillare di vetro nell'estrattore e tirarlo. Rimuovere il capillare di vetro dall'estrattore. Riempire il capillare di vetro con una soluzione di suoneria filtrata utilizzando una siringa a punta allungata.
Inserire l'elettrodo del filo nel capillare di vetro. Assicurarsi che la soluzione all'interno del capillare sia in contatto con il filo d'argento. Inserire i supporti degli elettrodi nei due micromanipolatori dell'elettrodo.
Accendere l'alimentazione del saldatore. Impostare la corrente su circa 2,25 ampere. Questa corrente dovrebbe riscaldare il filamento di platino-iridio da 0,25 millimetri a circa 55-56 gradi Celsius.
Posizionare una goccia di cera con una bassa temperatura di fusione sul saldatore. Anestetizzare le mosche all'interno della bottiglia. Versare le mosche anestetizzate, nel contenitore dormiente, scegliere una mosca e coprire il resto delle mosche con una capsula di Petri.
Tenere con cura la mosca per le ali usando una pinzetta affilata e posizionarla sul supporto della mosca. Sul supporto della mosca, posiziona la mosca sdraiata su un fianco con la schiena verso la mano. Usando una pinzetta, sollevare la mosca dalle sue ali e fissare le ali al supporto della mosca usando il saldatore.
Collegare la schiena della mosca alla superficie del supporto con la cera usando il saldatore. Abbassare la punta del saldatore fino al punto di giunzione delle gambe, quindi sciogliere la cera per coprire tutte le gambe insieme. Metti una piccola goccia di cera tra la testa e il collo nella zona del collo.
Posizionare il supporto per mosche in una gabbia buia di Faraday su un blocco magnetico e assicurarsi che la mosca si trovi a circa cinque millimetri dall'estremità della guida luminosa. Posizionare l'elettrodo di registrazione sopra l'occhio della mosca e l'elettrodo di terra sopra la parte superiore della schiena della mosca usando i micromanipolatori. Quindi inserire l'elettrodo di terra nella parte posteriore della mosca usando i micromanipolatori.
Inserire l'elettrodo di registrazione nella periferia esterna dell'occhio della mosca, preferibilmente utilizzando i micromanipolatori. Chiudi la gabbia di Faraday e spegni le luci nella stanza per consentire l'adattamento al buio per cinque minuti. Immettere i parametri a partire da una durata dell'impulso di 500 metri al secondo, un intervallo di impulsi di 60 secondi e il numero di impulsi impostato su sei.
Per misurare il PDA, impostare il generatore di impulsi Master-8 in modalità TRAIN, quindi fornire un impulso luminoso di cinque secondi di intensità massima utilizzando un filtro arancione. Controllare la risposta alla tensione. Sostituire il filtro arancione con un filtro blu a banda larga e dare tre impulsi luminosi di 5 secondi alla massima intensità.
Controllare la risposta alla tensione. Attendere almeno 60 secondi al buio. Sostituire il filtro blu con il filtro arancione precedente.
Quindi dare due impulsi di luce di 5 secondi con intervalli di 60 secondi. Controllare la risposta alla tensione. Per misurare il potenziale M dell'ERP, fornire un impulso continuo di luce blu fino a raggiungere una risposta di tensione allo stato stazionario.
Dare un breve lampo di luce intensa di una lunghezza d'onda compresa tra 350 e 700 nanometri utilizzando un filtro passa banda a 20 nanometri. Quindi misurare l'ampiezza di picco della fase M1 della risposta del potenziale M, che riflette l'assorbimento della metarodopsina a questa specifica lunghezza d'onda al fotoequilibrio. Le risposte PDA sono state valutate per diverse mosche mutanti.
Le mosche selvatiche hanno mostrato una depolarizzazione satura al buio che è apparsa come ERG corneale negativo prolungato, a seguito di un'intensa stimolazione della luce blu. Le seguenti luci blu hanno prodotto piccole risposte sovrapposte al PDA, prive dei transitori on e off. Nei moscerini mutanti con biogenesi anormale dei fotopigmenti come ninaE, la risposta alla tensione è tornata al basale dopo un'intensa stimolazione della luce blu e la risposta a una luce blu aggiuntiva non è stata soppressa e ha mostrato normali transitori on e off.
L'ERP wild-type della mosca è ottenuto con lo stesso protocollo, ma durante il PDA viene applicato un intenso flash verde. Questo lampo verde provoca l'ERP e sopprime il PDA. Il potenziale M è stato ottenuto dal lampo verde dopo l'illuminazione blu, ma non da un lampo blu dopo l'illuminazione blu nella mosca wild-type.
Questo protocollo è stato ripetuto in wild type, in fotopigmento ipomorfo mutante ninaE, e in mutante carente di fototrasduzione con livelli normali di fotopigmento norpA. Gli spettri di assorbimento relativo della rodopsina e della metarodopsina sono stati calcolati da misurazioni fotometriche del diverso spettro e dello spettro di fotoequilibrio. È importante per la sopravvivenza delle mosche prestare attenzione alla viscosità della cera astenendosi dal surriscaldamento.
Questa procedura è adatta per lo screening genetico e tramite mutanti visivi difettosi. I metodi che isolano e identificano casualmente le mutazioni visive possono facilitare la scoperta di nuove proteine e meccanismi coinvolti nella fototrasduzione della Drosophila. Il protocollo PDA ha permesso l'isolamento di importanti e nuovi meccanismi visivi.
La partecipazione probabilmente non sarebbe stata scoperta o addirittura anticipata altrimenti.
