Gli autori ringraziano il Dott. Pietro Gerrits per i disegni utilizzati nel video.

Nota: le tecniche di antisettico devono essere impiegati durante l&#39;intera procedura. Tutti gli strumenti ed i materiali (cotone con punta tamponi, garze, ecc) che verranno utilizzati durante l&#39;intervento chirurgico dovrebbe essere sterilizzati in autoclave. Una mascherina chirurgica, cofano capelli e guanti sterili devono essere indossati. L&#39;area di lavoro e l&#39;apparato stereotassico devono essere puliti accuratamente, e disinfettati con una soluzione di etanolo al 70%. 1. Pre-chirurgica procedure <ol><li> Sistemare il dispositivo stereotassico e tutti i materiali necessari. Preriscaldare il riscaldamento pad. </li><li> Posizionare la cannula in suo sostegno e controllare se è diritta. </li><li> Accendere il sistema gas - miscela di aria ambiente e ossigeno (30-35% del flusso totale dovrebbe essere di ossigeno). </li><li> Pesare il ratto e amministrare l&#39;anestetico. Stiamo usando una miscela di ketamina (37,5 mg / kg) e dexmedetomidina (0,25 mg / kg) iniettata per via sottocutanea. Per i protocolli di anestesia diverso, cfr Flecknell 4 e Hellebrekers et al. 7. </li><li> Dopo il ratto perso conoscenza, radere la zona della testa va dalle orecchie al proprio in mezzo agli occhi con un rasoio elettrico. </li><li> Posizionare il topo sul pad di riscaldamento, con il naso di fronte al tubo dell&#39;aria. Usare un ossimetro per garantire che il ratto ha un adeguato livello di ossigenazione del sangue (non deve cadere &lt;90%). Si prega di seguire le istruzioni del produttore per un uso corretto di attrezzature. </li><li> Applicare la crema occhi (Duratears Z, Alcon) su entrambe le cornee per evitare la disidratazione. </li><li> Verificare i riflessi del ratto (coda di riflesso o toe-pizzico riflesso, come dimostrato in Walantus et al. 8) per assicurare che sia adeguatamente anestetizzato. Se il topo continua a mostrare forti riflessi, la supplementazione di anestesia potrebbe essere necessario. </li><li> Se non toe-pinch riflesso viene mostrato, posto il topo dell&#39;apparato stereotassico, regolare le barre di orecchio in modo che si vede leggendo uguale su entrambi i lati, e posto di nuovo il tubo aria davanti l&#39;animalefissandolo con la barra di naso. Verificare di nuovo se il topo mostra un livello di ossigenazione del sangue del 90% o superiore. In caso contrario, regolare le tubazioni, avvicinandolo al naso, o aumentare il flusso di ossigeno. Monitorare il livello di ossigenazione del sangue e la frequenza cardiaca durante l&#39;intervento chirurgico. </li><li> Monitorare costantemente la temperatura del ratto con un termometro rettale (preferibilmente collegato ad una piastra elettrica) e registrare i valori all&#39;inizio e alla fine dell&#39;intervento. Regolare il termoforo o utilizzare una coperta per mantenere una temperatura corporea di 37,5-38,5 ° C. </li></ol> 2. Chirurgia <ol><li> Iniettare l&#39;analgesico. Stiamo utilizzando un unico peri-operatorio la somministrazione di carprofen (4,0-5,0 mg / kg per via sottocutanea). Per diversi protocolli di analgesici, vedere Hellebrekers et al. 7. </li><li> Pulire l&#39;area rasata di tha la pelle dal centro verso il perimetro dai capelli tre volte con un disinfettante (es. clorexidina 0,5%) e localmente iniettare una miscela di lidocaina (20 mg / ml) e adrenalina (5 mg / ml) per l&#39;anestesia locale e vasocostrizione (per evitare eccessivo sanguinamento). </li><li> Fate una antero-posteriore incisione di circa 2,5 cm sulla linea mediana del cuoio capelluto, che va dal mezzo agli occhi fino a quando la parte posteriore delle orecchie. Usa 4-6 morsetti bulldog per pizzicare fuori la pelle e per mantenere l&#39;incisione aperta. Rimuovere eventuali tessuto connettivo con una / o spatola e tamponi di cotone e pulire l&#39;area per esporre la superficie del cranio. </li><li> Controllare se la testa è di livello: in primo luogo, trovare Lambda e posizionare la cannula guida esattamente su questa posizione, toccando il cranio. Registrare la dorso-ventrale coordinate. Quindi, posizionare la cannula guida esattamente nel bregma, toccando il cranio, e registrare il suo dorso-ventrale coordinate. Queste due coordinate dovrebbero essere identici. Se la differenza è&gt; 0,3 mm, regolare la barra naso per correggerlo. </li><li> Make due piccoli fori per il fissaggio delle viti cranio con un trapano a mano sterilizzato (uno di circa 5 mm anteriore alla posizione cannula in uno degli emisferi e gli altri 5 mm posteriormente alla posizione cannula nell&#39;emisfero controlaterale). Inserire due viti sterili in questi fori fino a quando non sono strettamente ancorate, senza essere inserito completamente nel cranio. </li><li> Con la cannula guida posizionato esattamente al bregma, registrare le coordinate antero-posteriore e laterale. La posizione corretta di guida posizionamento cannula per ogni regione del cervello può essere calcolato aggiungendo o sottraendo dal bregma, con l&#39;aiuto di un atlante stereotassico 9-11. </li><li> Posizionare la cannula guida nella sua posizione corretta, leggermente toccando il cranio. Registrare la dorso-ventrale coordinate. Per bilaterali posizionamento cannula, trovare accanto la posizione cannula nell&#39;altro emisfero, e ancora una volta registrare il dorso-ventrale coordinate. Entrambe le coordinate dovrebbero essere identici (o differiscono &lt;0,3 mm). </li><li>Contrassegnare le posizioni cannula sul cranio con una matita e sterile, con il trapano a mano, fare i buchi bava, controllando la dimensione e la posizione corretta con l&#39;aiuto della cannula guida. Una volta che i fori sono fatti, utilizzare un ago sterile a pugni con delicatezza le meningi per consentire l&#39;inserimento della cannula ostruita. </li><li> Posizionare la cannula nel foro prima e abbassarlo delicatamente fino a raggiungere la quota finale ventrale. Preparare il cemento dentale e generosamente si applica in tutto il cannula e una o due viti per fissare la cannula. Attendere che il cemento si è asciugato completamente. Successivamente, rimuovere con attenzione il supporto cannula girando il dorso-ventrale verso l&#39;alto bar. </li><li> Posizionare la cannula secondo nel supporto e andare alla posizione cannula nell&#39;altro emisfero. Posizionare la cannula nel foro e ripetere il passaggio precedente. Coprire le viti e una grande superficie di cannule con il cemento, e prima che il cemento è secco, rimuovere eventuali eccedenze dalla pelle. </li><li> Iniettare caldo (~ 37 ° C) soluzione salina sterile (~ 10 ml / kg, sc) per garantire la reidratazione. </li><li> Dopo che il cemento si è completamente asciugato, rimuovere il supporto cannula e posto un perno in ogni cannula sterile per prevenire l&#39;ostruzione. </li><li> Pulire la zona ferita con soluzione salina sterile e suturare la parte anteriore e la parte posteriore della ferita. </li><li> Rimuovere l&#39;animale dal apparato stereotassico, sostituendo il tubo del gas davanti al suo naso. Continuare a monitorare il livello di saturazione di ossigeno e la temperatura corporea. </li><li> Se un anestetico iniettabile con dexmedetomidina viene utilizzato, iniettare il suo antagonista atipamezolo (0,25 mg / kg, sc) e attendere che l&#39;animale si sveglia (circa 5 minuti). </li><li> Mettere il topo in una gabbia di recupero. Per evitare l&#39;ipotermia, posto la gabbia in un incubatore a 28 ° C o su una piastra elettrica in un luogo dove si può osservare l&#39;animale per almeno un&#39;ora, prima di tornare alla sala vivaio. </li></ol> 3. Cura post-chirurgica <ol><li> Durante<html> i primi 4 giorni dopo l&#39;intervento, monitorare il recupero del ratto con la tenuta della contabilità quotidiana di peso e di altre osservazioni relative alla condizione degli animali nei giornali di bordo di laboratorio o &quot;diari di benessere degli animali&quot;. </li><li> Gli animali che mostrano evidenti segni di malattia, l&#39;infezione della ferita della perdita, del peso corporeo o altri segni di ridotta benessere devono essere sottoposti a cure particolari: ad esempio, una dose supplementare di analgesici per ridurre al minimo dolore post-operatorio, una miscela di polvere di cibo e acqua in aggiunta al normale cibo per stimolare l&#39;appetito del ratto, e / o l&#39;iniezione sottocutanea di soluzione fisiologica a supporto reidratazione. </li><li> Se il ratto non mostra alcun miglioramento dopo questi interventi, o la perdita di peso è&gt; 15% (rispetto ai livelli pre-chirurgia peso), il sacrificio dell&#39;animale con una dose eccessiva di anestetico (umano end-point). </li><li> I ratti di solito bisogno di recuperare per almeno 7 giorni prima dell&#39;inizio degli esperimenti comportamentali. </li></ol> 4. Rappresentante Risultati jove_content &quot;&gt; Per determinare se le varie modifiche alla nostra procedura chirurgica, con particolare riguardo alla supplementazione di ossigeno e il monitoraggio continuo dei livelli di ossigenazione del sangue, battito cardiaco e temperatura corporea, migliorato la sopravvivenza dell&#39;animale e migliorato la sua condizione generale dopo l&#39;intervento, abbiamo confrontato l&#39; non tasso di sopravvivenza di 20 coorti di animali (composto da 20 ratti ciascuno) che sottoposti a chirurgia dopo aver implementato queste modifiche con la non-sopravvivenza velocità di 24 coorti (20 ratti ciascuno), gestito con il protocollo standard. Come è mostrato in Figura 1a , il tasso di sopravvivenza non è risultata significativamente ridotta nel campione di coorti che è stato operato con il protocollo modificato (P &lt;0,05; Mann-Whitney U test, a due code). Inoltre, come è mostrato nella figura 1b, post-chirurgica di perdita di peso di ratti operato con il protocollo è stato modificato anche significativamente ridotto rispetto a quello dei ratti operato con la procedura standard (giornata post-operatoria 1: p &lt;0,05; giornata post-operatoria 2: P &lt;0,01; giornata post-operatoria 3: P = 0.17; Student t-test). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3528/3528fig1.jpg" /> Figura 1. Effetto delle modifiche in materia di non-chirurgici tasso di sopravvivenza e post-chirurgica perdita di peso. (A.) Non tasso di sopravvivenza dei ratti operati con il protocollo modificato rispetto a quella dei ratti operato con il protocollo standard. Il non-tasso di sopravvivenza (mediana ± interquartile range) è stato calcolato come la percentuale di ratti, per coorte di 20 ratti, che non è sopravvissuto un intervento chirurgico. * P &lt;0,05, Mann-Whitney U test a due code (n = 20 coorti per il protocollo modificato e 24 coorti per il protocollo standard). (B.) La perdita di peso (media ± SEM come percentuale del peso pre-intervento) durante i primi (POD1), secondo (POD2) e terzo (POD3) giornata post-operatoria. * P &lt;0.05, ** P &lt;0,01, test t di Student (n = 60 per gruppo).

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	<li>Russell, W. M. S., Burch, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Principles of Humane Experimental Technique. , (1959).</li><li>Richardson, C. A., Flecknell, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anaesthesia+and+post-operative+analgesia+following+experimental+surgery+in+laboratory+rodents:+are+we+making+progress?.">Anaesthesia and post-operative analgesia following experimental surgery in laboratory rodents: are we making progress?.</a> Altern. Lab Anim. 33, 119-127 (2005).</li><li>Stokes, E. L., Flecknell, P. A., Richardson, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reported+analgesic+and+anaesthetic+administration+to+rodents+undergoing+experimental+surgical+procedures.">Reported analgesic and anaesthetic administration to rodents undergoing experimental surgical procedures.</a> Lab Anim. 43, 149-154 (2009).</li><li>Flecknell, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Laboratory Animal Anaesthesia - A Practical Introduction for Research Workers and Technicians. , (2009).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DIRECTIVE+2010/63/EU+OF+THE+EUROPEAN+PARLIAMENT+AND+OF+THE+COUNCIL+of+22+September+2010+on+the+protection+of+animals+used+for+scientific+purposes.">DIRECTIVE 2010/63/EU OF THE EUROPEAN PARLIAMENT AND OF THE COUNCIL of 22 September 2010 on the protection of animals used for scientific purposes.</a> Official Journal of the European Union. , (2010).</li><li>Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survivable+Stereotaxic+Surgery+in+Rodents.">Survivable Stereotaxic Surgery in Rodents.</a> J. Vis. Exp. (20), e880-e880 (2008).</li><li>Hellebrekers, L. J., Booij, L. H. D. J., Flecknell, P. A., Van Zutphen, L. F. M., Baumans, V., Beynen, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anaesthesia,+analgesia+and+euthanasia.">Anaesthesia, analgesia and euthanasia.</a> Principles of Laboratory Animal Science. , 277-311 (2001).</li><li>Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+utero+intraventricular+injection+and+electroporation+of+E16+rat+embryos.">In utero intraventricular injection and electroporation of E16 rat embryos.</a> J. Vis. Exp. (6), e236-e236 (2007).</li><li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , (1986).</li><li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2007).</li><li>Swanson, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Brain Maps: Structure of the Rat Brain. , (1992).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Lo scopo principale di questo video di presentazione è quello di familiarizzare i neuroscienziati comportamentali con i principi fondamentali della chirurgia stereotassica. I ricercatori che stanno già eseguendo la chirurgia stereotassica potrebbe anche beneficiare di questo video e prendere in considerazione alcuni dei perfezionamenti procedurali per l&#39;uso in proprio laboratorio. Una sempre maggiore conoscenza su come ottimizzare le tecniche chirurgiche 1-3, lo sviluppo di nuovi anestetici e analgesici...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td></tr><tr><td> Alcool al 70% </td><td> VWR </td></tr><tr><td> Antisedan (atipamezolo) </td><td> Orion </td></tr><tr><td> Atropina solfato 0,5 </td><td> Pharmachemie BV </td></tr><tr><td> Bulldog pinza emostatica </td><td> Aesculap </td></tr><tr><td> Cannule </td><td> Componente Supply Co. </td></tr><tr><td> Clorexidina 0,5% </td><td> AppepPharma </td></tr><tr><td> Pulizia polvere </td><td> Alconox </td></tr><tr><td> Bastoncini di cotone </td><td> Hartmann BV </td></tr><tr><td> Dexdomitor (dexmedetomidina) </td><td> Orion </td></tr><tr><td> Trapano </td><td> Dremel 8000 </td></tr><tr><td> Duratears Z </td><td> Alcon </td></tr><tr><td> Durogrip Naaldvoerder conversare 130 millimetri </td><td> Aesculap </td></tr><tr><td> Durotip Fijne schaar ret.sp / st 110 millimetri </td><td> Aesculap </td></tr><tr><td> Garza </td><td> Medicomp (5x5) </td></tr><tr><td> Riscaldamento pad </td><td> Harvard Apparatus </td></tr><tr><td> Perni di insetti (stiletti) </td><td> Entosphinx (Repubblica Ceca) </td></tr><tr><td> Ketamina 10% (ketamina) </td><td> Alfasan </td></tr><tr><td> Micro-Halsted punta diritta </td><td> Aesculap-vet </td></tr><tr><td> Molinea </td><td> Hartmann BV </td></tr><tr><td> NaCl 0,9% </td><td> Baxter </td></tr><tr><td> Aghi (25G) </td><td> Terumo </td></tr><tr><td> Ossimetro </td><td> Edan Instruments, Inc. </td></tr><tr><td> Pentobarbital </td><td> Farmacia del all&#39;UMCG </td></tr><tr><td> Rimadyl </td><td> Pfizer </td></tr><tr><td> Bisturi lama n. 23 </td><td> Swann Morton </td></tr><tr><td> Scalpelholder NR. 4 133 millimetri </td><td> Aesculap </td></tr><tr><td> Cacciavite </td><td> Hardware negozio convenzionale </td></tr><tr><td> Simplex Rapid (cemento dentale) </td><td> Kemdent </td></tr><tr><td> Cranio viti </td><td> Componente Supply Co. </td></tr><tr><td> Spatola </td><td> VWR </td></tr><tr><td> Spongestan speciale </td><td> Johnson &amp; Johnson </td></tr><tr><td> Stereotacts </td><td> Kopf Instruments </td></tr><tr><td> Pinze chirurgiche 100 millimetri </td><td> Aesculap </td></tr><tr><td> Materiale di sutura Safil 5 / 0 </td><td> Aesculap </td></tr><tr><td> Siringa da 10 ml </td><td> Omnifix </td></tr><tr><td> Siringa da 1 ml </td><td> Terumo </td></tr><tr><td> Siringa da 5 ml </td><td> Omnifix </td></tr><tr><td> Xylocaine (lidocaina / adrenalina) </td><td> Astra Zeneca </td></tr></tbody></table>

rodent stereotaxic surgery and animal welfare outcome improvements for behavioral neuroscience

Chirurgia stereotassica per l&#39;impianto di cannule in regioni specifiche del cervello è stata per molti decenni una tecnica di grande successo sperimentale per studiare gli effetti del neurotrasmettitore a livello locale manipolati e vie di segnalazione in sveglio, gli animali si comportano. Inoltre, l&#39;impianto stereotassico di elettrodi per la stimolazione elettrofisiologica e studi di registrazione è stato determinante per la nostra comprensione attuale della neuroplasticità del cervello e delle reti nel comportarsi animali. Conoscenza sempre più su come ottimizzare le tecniche chirurgiche nei roditori 1-4, sensibilizzazione sulle questioni del benessere degli animali e legislazione (ad esempio, per il 2010 la direttiva dell&#39;Unione Europea sull&#39;uso degli animali da laboratorio 5) ci hanno spinto ad affinare queste procedure chirurgiche, con particolare riguardo ad attuare nuove procedure per la supplementazione di ossigeno e il monitoraggio continuo di ossigenazione del sangue e dei livelli di frequenza cardiaca durante l&#39;intervento così comel&#39;introduzione di un protocollo standardizzato per la cura post-chirurgica. Le nostre osservazioni indicano che queste modifiche ha comportato un tasso di aumento della sopravvivenza e un miglioramento delle condizioni generali degli animali dopo l&#39;intervento chirurgico (ad esempio la perdita di peso in meno e un animale più attivo). Questa presentazione video mostrerà le procedure generali coinvolti in questo tipo di chirurgia stereotassica con particolare attenzione alle nostre diverse modifiche. Si illustreranno queste procedure chirurgiche nei ratti, ma è anche possibile eseguire questo tipo di intervento chirurgico nei topi o altri piccoli animali da laboratorio, utilizzando adattatori speciali per l&#39;apparato stereotassico 6.

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Rodent Stereotaxic Surgery and Animal Welfare Outcome Improvements for Behavioral Neuroscience

Chirurgia stereotassica sui roditori permette per la somministrazione mirata di farmaci o di stimolazione elettrica e le registrazioni in sveglio, comportandosi animali. In questo video di presentazione mostreremo recenti perfezionamenti procedurali a questa lunga procedura che il tasso di sopravvivenza con successo migliorato e ridotto post-chirurgica perdita di peso.

Chirurgia Stereotassica roditori e animali Miglioramenti Esito di assistenza sociale per Behavioral Neuroscience

Stereotaxic surgery for the implantation of cannulae into specific brain regions has for many decades been a very successful experimental technique to ...

rodent-stereotaxic-surgery-animal-welfare-outcome-improvements-for

Research

JoVE Journal

Neuroscience

38.9K Views.  University of Groningen. Chirurgia stereotassica sui roditori permette per la somministrazione mirata di farmaci o di stimolazione elettrica e le registrazioni in sveglio, comportandosi animali. In questo video di presentazione mostreremo recenti perfezionamenti procedurali a questa lunga procedura che il tasso di sopravvivenza con successo migliorato e ridotto post-chirurgica perdita di peso.

Video: Rodent Stereotaxic Surgery and Animal Welfare Outcome Improvements for Behavioral Neuroscience

Systemic and Local Drug Delivery for Treating Diseases of the Central Nervous System in Rodent Models

Thorough preclinical testing of central nervous system (CNS) therapeutics includes a consideration of routes of administration and agent biodistribution in assessing therapeutic efficacy. Between the two major classifications of administration, local vs. systemic, systemic delivery approaches are often preferred due to ease of administration. However, systemic delivery may result in suboptimal drug concentration being achieved in the CNS, and lead to erroneous conclusions regarding agent efficacy. Local drug delivery methods are more invasive, but may be necessary to achieve therapeutic CNS drug levels. Here, we demonstrate proper technique for three routes of systemic drug delivery: intravenous injection, intraperitoneal injection, and oral gavage. In addition, we show a method for local delivery to the brain: convection-enhanced delivery (CED). The use of fluorescently-labeled compounds is included for in vivo imaging and verification of proper drug administration. The methods are presented using murine models, but can easily be adapted for use in rats.

Thorough preclinical testing of drugs that act in the central nervous system often involves assessing and comparing drug biodistribution in association with specific routes of administration. Here, three commonly used methods of systemic delivery (intravenous, intraperitoneal, and oral) as well as a method for local delivery (convection-enhanced delivery) are demonstrated in mice.

Drug Delivery sistemica e locale per la cura delle malattie del Sistema Nervoso Centrale in modelli di roditori

Thorough preclinical testing of central nervous system (CNS) therapeutics includes a consideration of routes of administration and agent biodistribution ...

Ricerca

Neuroscienze

Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents

The goal of fixation is to rapidly and uniformly preserve tissue in a life-like state. While placing tissue directly in fixative works well for small pieces of tissue, larger specimens like the intact brain pose a problem for immersion fixation because the fixative does not reach all regions of the tissue at the same rate 5,7. Often, changes in response to hypoxia begin before the tissue can be preserved 12. The advantage of directly perfusing fixative through the circulatory system is that the chemical can quickly reach every corner of the organism using the natural vascular network. In order to utilize the circulatory system most effectively, care must be taken to match physiological pressures 3. It is important to note that physiological pressures are dependent on the species used. Techniques for perfusion fixation vary depending on the tissue to be fixed and how the tissue will be processed following fixation. In this video, we describe a low-cost, rapid, controlled and uniform fixation procedure using 4% paraformaldehyde perfused via the vascular system: through the heart of the rat to obtain the best possible preservation of the brain for immunohistochemistry. The main advantage of this technique (vs. gravity-fed systems) is that the circulatory system is utilized most effectively.

Here we describe a low-cost, rapid, controlled and uniform fixation procedure using 4% paraformaldehyde perfused via the vascular system: through the heart of the rat to obtain the best possible preservation of the brain.

Tutta la perfusione di fissaggio degli animali per i roditori

The goal of fixation is to rapidly and uniformly preserve tissue in a life-like state. While placing tissue directly in fixative works well for small ...

Stereotaxic Surgery for Excitotoxic Lesion of Specific Brain Areas in the Adult Rat

Many behavioral functions in mammals, including rodents and humans, are mediated principally by discrete brain regions. A common method for discerning the function of various brain regions for behavior or other experimental outcomes is to implement a localized ablation of function. In humans, patient populations with localized brain lesions are often studied for deficits, in hopes of revealing the underlying function of the damaged area. In rodents, one can experimentally induce lesions of specific brain regions.
Lesion can be accomplished in several ways. Electrolytic lesions can cause localized damage but will damage a variety of cell types as well as traversing fibers from other brain regions that happen to be near the lesion site. Inducible genetic techniques using cell-type specific promoters may also enable site-specific targeting. These techniques are complex and not always practical depending on the target brain area. Excitotoxic lesion using stereotaxic surgery, by contrast, is one of the most reliable and practical methods of lesioning excitatory neurons without damaging local glial cells or traversing fibers.
Here, we present a protocol for stereotaxic infusion of the excitotoxin, N-methyl-D-aspartate (NMDA), into the basolateral amygdala complex. Using anatomical indications, we apply stereotaxic coordinates to determine the location of our target brain region and lower an injection needle in place just above the target. We then infuse our excitotoxin into the brain, resulting in excitotoxic death of nearby neurons. While our experimental subject of choice is a rat, the same methods can be applied to other mammals, with the appropriate adjustments in equipment and coordinates.
This method can be used on a variety of brain regions, including the basolateral amygdala1-6, other amygdala nuclei6, 7, hippocampus8, entorhinal cortex9 and prefrontal cortex10. It can also be used to infuse biological compounds such as viral vectors1, 11. The basic stereotaxic technique could also be adapted for implantation of more permanent osmotic pumps, allowing more prolonged exposure to a compound of interest.

Targeted ablation of specific brain region(s) by infusion of an excitotoxin using stereotaxic coordinates is described. This technique could also be adapted for infusion of other chemicals into the rat brain.

La chirurgia stereotassica della lesione eccitotossico di specifiche aree cerebrali nel ratto adulto

Many behavioral functions in mammals, including rodents and humans, are mediated principally by discrete brain regions. A common method for discerning the ...

A Lightweight, Headphones-based System for Manipulating Auditory Feedback in Songbirds

Experimental manipulations of sensory feedback during complex behavior have provided valuable insights into the computations underlying motor control and sensorimotor plasticity1. Consistent sensory perturbations result in compensatory changes in motor output, reflecting changes in feedforward motor control that reduce the experienced feedback error. By quantifying how different sensory feedback errors affect human behavior, prior studies have explored how visual signals are used to recalibrate arm movements2,3 and auditory feedback is used to modify speech production4-7. The strength of this approach rests on the ability to mimic naturalistic errors in behavior, allowing the experimenter to observe how experienced errors in production are used to recalibrate motor output.
Songbirds provide an excellent animal model for investigating the neural basis of sensorimotor control and plasticity8,9. The songbird brain provides a well-defined circuit in which the areas necessary for song learning are spatially separated from those required for song production, and neural recording and lesion studies have made significant advances in understanding how different brain areas contribute to vocal behavior9-12. However, the lack of a naturalistic error-correction paradigm - in which a known acoustic parameter is perturbed by the experimenter and then corrected by the songbird - has made it difficult to understand the computations underlying vocal learning or how different elements of the neural circuit contribute to the correction of vocal errors13.
The technique described here gives the experimenter precise control over auditory feedback errors in singing birds, allowing the introduction of arbitrary sensory errors that can be used to drive vocal learning. Online sound-processing equipment is used to introduce a known perturbation to the acoustics of song, and a miniaturized headphones apparatus is used to replace a songbird's natural auditory feedback with the perturbed signal in real time. We have used this paradigm to perturb the fundamental frequency (pitch) of auditory feedback in adult songbirds, providing the first demonstration that adult birds maintain vocal performance using error correction14. The present protocol can be used to implement a wide range of sensory feedback perturbations (including but not limited to pitch shifts) to investigate the computational and neurophysiological basis of vocal learning.

We describe the design and assembly of miniaturized headphones suitable for replacing a songbird&#x2019;s natural auditory feedback with a manipulated acoustic signal. Online sound processing hardware is used to manipulate song output, introduce real-time errors in auditory feedback via the headphones, and drive vocal motor learning.

Un leggero, Cuffie-based per la gestione di sistema feedback uditivo in Songbirds

Experimental manipulations of sensory feedback during complex behavior have provided valuable insights into the computations underlying motor control and ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

In vivo optogenetic stimolazione del sistema nervoso centrale Roditore

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Stereotaxic Infusion of Oligomeric Amyloid-beta into the Mouse Hippocampus

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the over-production of amyloid-beta and the deposition of amyloid-beta plaques in brain regions of the afflicted individuals. Throughout the years scientists have generated numerous Alzheimer&#8217;s disease mouse models that attempt to replicate the amyloid-beta pathology. Unfortunately, the mouse models only selectively mimic the disease features. Neuronal death, a prominent effect in the brains of Alzheimer&#8217;s disease patients, is noticeably lacking in these mice. Hence, we and others have employed a method of directly infusing soluble oligomeric species of amyloid-beta - forms of amyloid-beta that have been proven to be most toxic to neurons - stereotaxically into the brain. In this report we utilize male C57BL/6J mice to document this surgical technique of increasing amyloid-beta levels in a select brain region. The infusion target is the dentate gyrus of the hippocampus because this brain structure, along with the basal forebrain that is connected by the cholinergic circuit, represents one of the areas of degeneration in the disease. The results of elevating amyloid-beta in the dentate gyrus via stereotaxic infusion reveal increases in neuron loss in the dentate gyrus within 1 week, while there is a concomitant increase in cell death and cholinergic neuron loss in the vertical limb of the diagonal band of Broca of the basal forebrain. These effects are observed up to 2 weeks. Our data suggests that the current amyloid-beta infusion model provides an alternative mouse model to address region specific neuron death in a short-term basis. The advantage of this model is that amyloid-beta can be elevated in a spatial and temporal manner.

Here, we present a protocol for direct stereotaxic brain infusion of amyloid-beta. This methodology provides an alternative in vivo mouse model to address the short-term effects of amyloid-beta on brain neurons.

Infuso stereotassico di Oligomeric amiloide-beta nelle Hippocampus mouse

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the ...

Non-restraining EEG Radiotelemetry: Epidural and Deep Intracerebral Stereotaxic EEG Electrode Placement

Implantable EEG radiotelemetry is of central relevance in the neurological characterization of transgenic mouse models of neuropsychiatric and neurodegenerative diseases as well as epilepsies. This powerful technique does not only provide valuable insights into the underlying pathophysiological mechanisms, i.e., the etiopathogenesis of CNS related diseases, it also facilitates the development of new translational, i.e., therapeutic approaches. Whereas competing techniques that make use of recorder systems used in jackets or tethered systems suffer from their unphysiological restraining to semi-restraining character, radiotelemetric EEG recordings overcome these disadvantages. Technically, implantable EEG radiotelemetry allows for precise and highly sensitive measurement of epidural and deep, intracerebral EEGs under various physiological and pathophysiological conditions. First, we present a detailed protocol of a straight forward, successful, quick and efficient technique for epidural (surface) EEG recordings resulting in high-quality electrocorticograms. Second, we demonstrate how to implant deep, intracerebral EEG electrodes, e.g., in the hippocampus (electrohippocampogram). For both approaches, a computerized 3D stereotaxic electrode implantation system is used. The radiofrequency transmitter itself is implanted into a subcutaneous pouch in both mice and rats. Special attention also has to be paid to pre-, peri- and postoperative treatment of the experimental animals. Preoperative preparation of mice and rats, suitable anesthesia as well as postoperative treatment and pain management are described in detail.

Non-restraining EEG radiotelemetry is a valuable methodological approach to record in vivo long-term electroencephalograms from freely moving rodents. This detailed protocol describes stereotaxic epidural and deep intracerebral electrode placement in different brain regions in order to obtain reliable recordings of CNS rhythmicity and CNS related behavioral stages.

Non restrittivo EEG Radiotelemetry: epidurale e Deep intracerebrale Stereotassica EEG Posizionamento degli elettrodi

Implantable EEG radiotelemetry is of central relevance in the neurological characterization of transgenic mouse models of neuropsychiatric and ...

Stereotaxic Surgery for Genetic Manipulation in Striatal Cells of Neonatal Mouse Brains

Many genes are expressed in embryonic brains, and some of them are continuously expressed in the brain after birth. For such persistently expressed genes, they may function to regulate the developmental process and/or physiological function in neonatal brains. To investigate neurobiological functions of specific genes in the brain, it is essential to inactivate genes in the brain. Here, we describe a simple stereotaxic method to inactivate gene expression in the striatum of transgenic mice at neonatal time windows. AAV-eGFP-Cre viruses were microinjected into the striatum of Ai14 reporter gene mice at postnatal day (P) 2 by stereotaxic brain surgery. The tdTomato reporter gene expression was detected in P14 striatum, suggesting a successful Cre-loxP mediated DNA recombination in AAV-transduced striatal cells. We further validated this technique by microinjecting AAV-eGFP-Cre viruses into P2Foxp2fl/fl mice. Double labeling of GFP and Foxp2 showed that GFP-positive cells lacked Foxp2 immunoreactivity in P9 striatum, suggesting the loss of Foxp2 protein in AAV-eGFP-Cre transduced striatal cells. Taken together, these results demonstrate an effective genetic deletion by stereotaxically microinjected AAV-eGFP-Cre viruses in specific neuronal populations in the neonatal brains of floxed transgenic mice. In conclusion, our stereotaxic technique provides an easy and simple platform for genetic manipulation in neonatal mouse brains. The technique can not only be used to delete genes in specific regions of neonatal brains, but it also can be used to inject pharmacological drugs, neuronal tracers, genetically modified optogenetics and chemogenetics proteins, neuronal activity indicators and other reagents into the striatum of neonatal mouse brains.

We describe a protocol of stereotaxic surgery with a homemade head-fixed device for microinjecting reagents into the striatum of neonatal mouse brains. This technique allows genetic manipulation in neuronal cells of specific regions of neonatal mouse brains.

Chirurgia stereotassica per la manipolazione genetica in cellule striatali di cervelli di topo neonatale

Many genes are expressed in embryonic brains, and some of them are continuously expressed in the brain after birth. For such persistently expressed genes, ...

Identification of Dopamine D1-Alpha Receptor Within Rodent Nucleus Accumbens by an Innovative RNA In Situ Detection Technology

In the central nervous system, the D1-alpha subtype receptor (Drd1&#945;) is the most abundant dopamine (DA) receptor, which plays a vital role in regulating neuronal growth and development. However, the mechanisms underlying Drd1&#945; receptor abnormalities mediating behavioral responses and modulating working memory function are still unclear. Using a novel RNA in situ hybridization assay, the current study identified dopamine Drd1&#945; receptor and tyrosine hydroxylase (TH) RNA expression from DA-related circuitry in the nucleus accumbens (NAc) area and substantia nigra region (SNR), respectively. Drd1&#945; expression in the NAc shows a &#34;discrete dot&#34; staining pattern. Clear sex differences in Drd1&#945; expression were observed. In contrast, TH shows a &#34;clustered&#34; staining pattern. Regarding TH expression, female rats displayed a higher signal expression per cell relative to male animals. The methods presented here provide a novel in situ hybridization technique for investigating changes in dopamine system dysfunction during the progression of central nervous system diseases.

Identification of Dopamine D1-Alpha Receptor Within Rodent Nucleus Accumbens by an Innovative RNA In Situ Detection Technology

Identification of dopamine D1-alpha receptor in the nucleus accumbens is critical for clarifying D1 receptor dysfunction during a central nervous system disease. We performed a novel RNA in situ hybridization assay to visualize single RNA molecules in a specific brain area.

Identificazione della dopamina D1-alfa del ricevitore all'interno del roditore Nucleus Accumbens da un innovativo RNA In Situ Detection Technology

In the central nervous system, the D1-alpha subtype receptor (Drd1&#945;) is the most abundant dopamine (DA) receptor, which plays a vital role in ...

Noninvasive EEG Recordings from Freely Moving Piglets

The method allows the recording of high-quality electroencephalograms (EEGs) from freely moving piglets directly in the pigpen. We use a one-channel telemetric electroencephalography system in combination with standard self-adhesive hydrogel electrodes. The piglets are calmed down without the use of sedatives. After their release into the pigpen, the piglets behave normally&#8212;they drink and sleep in the same cycle as their siblings. Their sleep phases are used for the EEG recordings.

Here, we present a protocol to record telemetric electroencephalograms (EEGs) from freely moving piglets directly in the pigpen without the use of a sedative, making it possible to record typical EEG patterns during non-REM sleep, like spindle bursts.

Registrazioni di EEG non invadente da muoversi liberamente suinetti

The method allows the recording of high-quality electroencephalograms (EEGs) from freely moving piglets directly in the pigpen. We use a one-channel ...