Questo lavoro è stato finanziato dal Center for Neural Communication Technology (CNCT), un P41 Resource Center finanziato dal National Institute of Biomedical Imaging e Bioingegneria (NIBIB, P41 EB002030) e sostenuto dal National Institutes of Health (NIH).

1. Preparare Fixative (Vedi tabella Fissativo e tamponi.) 2. Preparare buffer perfusione (Vedi tabella Fissativo e tamponi.) 3. Preparare Apparecchiatura e Anestesia <ol><li> Utilizzando il bagno d&#39;acqua, calda tampone perfusione a 37 ° C. Luogo valvola di scarico in un bicchiere pieno di buffer. Riempire una siringa da 50 ml con il tampone e fissarlo al tubo fissativo. Lavare ripetutamente espellendo tubo e della revoca dello buffer. </li><li> Deselezionare la linea con buffer fino a quando tutte le bolle d&#39;aria nelle tubazioni vengono eliminati. È fondamentale per il successo di una perfusione non avere bolle d&#39;aria in qualsiasi delle linee. </li><li> Rimuovere la siringa e collegare il fissativo paraformaldeide al 4% (temperatura ambiente) del contenitore. Per evitare bolle d&#39;aria alla fine tubo, spremere il tubo mentre posizionare il tubo nel contenitore in modo che una goccia di tampone sporge dalla t fineO contattare la superficie del liquido all&#39;interno del contenitore. </li><li> Chiudere la porta di uscita (fine ago). Ruotare valvola tampone (blu) nella stessa posizione della valvola fissativo (bianco). Ciò consentirà il flusso dalla linea solo tampone. </li><li> Aprire la porta di uscita e ripetere il passo da A1 a A3 per il riempimento della linea di buffer. Dopo che tutte le bolle d&#39;aria vengono eliminati chiudere la porta di uscita, rimuovere la siringa e collegare il contenitore buffer, facendo attenzione a non introdurre bolle d&#39;aria nel tubo. </li><li> Sistema di test per la capacità di mantenere la pressione pompando il blub manometro in gomma. Non vi è normalmente una certa resistenza dovuta alla compressione di aria nel sistema. </li><li> File di installazione di chirurgia per consentire facile accesso. Riempire l&#39;ago perfusione con tampone per eliminare la possibilità di bolle d&#39;aria. </li><li> Prima dell&#39;intervento, uno ketamina / xilazina miscela (fino a 80 mg / kg di peso corporeo ketamina e 10 mg / kg di peso corporeo xilazina) viene somministrato mediante iniezione intraperitoneale (27 gauge e 1 siringa cc). Somministrazione supplementare di anestetico viene eseguita come necessario nel corso di ogni operazione di mantenere un piano chirurgica di anestesia. </li></ol> 4. Perfusione Chirurgia <ol><li> Una volta che l&#39;animale ha raggiunto un piano di anestesia chirurgica, posizionarlo sul vassoio poco profondo riempito con ghiaccio tritato. (Usare una convergenza pinch-risposta metodo per determinare la profondità dell&#39;anestesia. Animale deve essere non risponde prima di continuare). </li><li> Eseguire un&#39;incisione 5-6 cm lateralmente attraverso l&#39;involucro e la parete addominale appena sotto la gabbia toracica. Accuratamente separare il fegato dal diaframma. </li><li> Fai una piccola incisione nella membrana utilizzando le curve, le forbici. La posizione e la pressione del dito può aiutare nella capacità di tagliare il diaframma. </li><li> Continuare la membrana incisione lungo l&#39;intera lunghezza della gabbia toracica per esporre la cavità pleurica. </li><li> Posizionare le forbici curve, lungo un lato delle costole, con attenzione spostando i polmoni, e fare un cut attraverso la gabbia toracica fino alla clavicola. Fare un taglio simile sul lato controlaterale. </li><li> Sollevamento dello sterno via, tagliare con cura qualsiasi tessuto di collegarlo al cuore. Bloccare la punta dello sterno con la pinza emostatica e posizionare la pinza emostatica sopra la testa. Se fatto correttamente, il timo solleva lontano dal cuore insieme con lo sterno, fornendo una visione chiara dei vasi sanguigni principali. </li><li> Fai una piccola incisione alla estremità posteriore del ventricolo sinistro con le forbici iris. </li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3564/3564step7.jpg" /> <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3564/3564step7large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <ol start="8"><li> Passare a 15-gauge perfusione smussata o di olio di punta attraverso il ventricolo taglio in aorta ascendente. La punta deve essere visibile attraverso la parete dell&#39;aorta, e non dovrebbe raggiungere l&#39;arco aortico dove le arterie carotidee brachiale e divergono. </li><li> Utilizzare una pinza emostatica per bloccare il cuore, questo assicura l&#39;ago e impedisce la fuoriuscita. Se desiderato, all&#39;emostato modificato può essere utilizzato per bloccare l&#39;aorta intorno alla punta dell&#39;ago (questi hemostats mantenuto fino a quando inizia dissezione, ma sono omessi dalle illustrazioni futuri per chiarezza). </li><li> Infine, per effettuare un&#39;incisione all&#39;atrio destro dell&#39;animale usando forbici iris per creare una presa più grande possibile, senza danneggiare l&#39;aorta discendente. A questo punto l&#39;animale è pronto per essere perfuso. </li></ol> 5. Perfusione <ol><li> Aprire la porta di uscita e collegare all&#39;ago di base facendo attenzione a non introdurre eventuali bolle d&#39;aria. </li><li> Gonfiare il bulbo manometro ad una pressione di 80 mmHg rapidamente e uniformemente. Mantenere questa pressione per tutto il periodo di infusione buffer. Avviare il timer. </li><li> Regolare l&#39;angolo ago. L&#39;angolo dell&#39;ago è critica per il raggiungimento di una portata massima (notare la variazione di flusso con regolazione dell&#39;angolo). </li><li> Accendere il buffer valvola (blu), una volta tampone è quasi finito (200 ml). Il fluido deve essere in esecuzione chiaro. La compensazione del fegato è un indicatore di un buon perfusione. Il fegato dovrebbe essere chiaro a questo punto. Indicare il tempo per i vostri record. </li><li> Tremori di fissaggio devono essere osservate in pochi secondi, questo dovrebbe essere considerato il vero tempo di fissazione. Indicare il tempo per i vostri record. </li><li> La pressione può essere gradualmente aumentare fino ad un massimo di 130 mm Hg 2 per mantenere un tasso costante di flusso. </li><li> Chiudere la valvola di scarico una volta che il fissativo è quasi finito. Indicare ora di fine per i vostri record. </li><li> Il topo deve essere rigido in questa fase. </li><li> La paraformaldeide utilizzato deve essere raccolto e conservato per lo smaltimento secondo le norme della vostra istituzione. </li></ol> 6. Dissezione 4,11 <ol><li> Togliere la testa con un paio di forbici. </li><li> Fai una incisione lungo la linea mediana tegumento dal collo al naso ed esporre ilcranio. </li><li> Tagliare il muscolo restante collo in modo che la base del cranio è esposto; rimuovere ogni residuo di muscolo utilizzando forbici o Rongeurs. </li><li> Posizionare la punta di un paio di forbici iride in forame da un lato, le forbici accuratamente scorrere lungo la superficie interna del cranio. </li><li> Successivamente, un taglio che si estende al bordo distale della superficie posteriore cranio. Fare un taglio identico sul lato controlaterale. Utilizzare i Rongeurs di sgombrare il cranio intorno al cervelletto. </li><li> Scorrere delicatamente le forbici lungo la superficie interna del cranio come la punta viaggia dal dorsale angolo distale posteriore al bordo distale frontale del cranio, sollevando la lama, come si sta tagliando per evitare danni al cervello. Ripetere sul lato opposto. </li><li> Utilizzando Rongeurs sbucciare la superficie dorsale del cranio fuori dal cervello. Rifilare i lati del cranio utilizzando Rongeurs pure. </li><li> Utilizzando una spatola, tagliare i bulbi olfattivi e le connessioni nervosezioni lungo la superficie ventrale del cervello. </li><li> Delicatamente stuzzicare il cervello fuori dalla testa, ogni taglio dura che collega ancora il cervello al cranio con le forbici iris. </li><li> Rimuovere il cervello e collocarlo in una fiala di liquido fissativo contenente almeno 10 volte il volume del cervello. Agitare il flacone di tanto in tanto. </li></ol> 7. Post-fissazione &amp; Storage <ol><li> Tenere il cervello in fissativo per 24 ore a 4 ° C, agitando di tanto in tanto. </li><li> Dopo 24 ore, lavare il cervello tampone fosfato scambiando i mezzi 3 volte e agitando ogni volta. </li><li> I cervelli possono essere memorizzati in salina tamponata con fosfato o HBHS con sodio azide e mantenuto a 4 ° C. </li></ol> 8. Risultati rappresentativi Un indicatore iniziale del successo della perfusione è la compensazione delle estremità come il naso, le orecchie e le zampe e gli organi interni come il timo e il fegato (IHC World).Ispezione lordo del cervello rivela il vuoto vaso sanguigno di sangue (bianco a giallo pallido aspetto giallo). Questo sarà anche vero all&#39;interno di sezioni di tessuto destinare per la colorazione ed immunoistochimica. L&#39;indicatore finale del risultato della perfusione è la condizione della ultrastruttura nel tessuto. 1,6,7,8 <table border="1"><tbody><tr><td> Preparare Fissativo: </td></tr><tr><td> Preparare magazzino paraformaldeide all&#39;8% </td></tr><tr><td><ol><li> Aggiungere 40 g di paraformaldeide a 500 ml dH 2 O. Riscaldare la soluzione a 60 - 65 ° C sotto agitazione (non superare i 65 ° C, così facendo può influenzare negativamente il successo della procedura immunoistochimica). </li><li> Per cancellare la soluzione, abbassare la fiamma e aggiungere 2-3 ml di NaOH 1,0 M con un contagocce. </li><li> Filtrare e conservare a 4 ° C per un massimo di 1 mese. </li></ol></td></tr><tr><td> Preparare 0,2 M tampone fosfato di sodio, pH 7,4 </td></tr><tr><td><ol start="4"><li> Per il magazzino sodio fosfato monobasico, aggiungere 27,8 g di NaH 2 PO 4 * H 2 O a 1 L dH 2 O. </li><li> Per lo stock di fosfato di sodio bibasico, aggiungere 28,4 g Na 2 HPO 4 a 1 L dH 2 O. </li><li> Aggiungere 810 ml dello stock monobasico a 190 ml dello stock bibasico. </li></ol></td></tr><tr><td> Preparare Fixative paraformaldeide 4% </td></tr><tr><td><ol start="7"><li> Aggiungi parti uguali magazzino paraformaldeide 8% a 0,2 M tampone fosfato di sodio </li><li> Nota: questa correzione è meglio preparato fresco, non più di 72 ore di anticipo. </li></ol></td></tr><tr><td> Preparare perfusione e buffer di memoria: </td></tr><tr><td> Preparare Soluzione tampone fosfato, pH 7.4 </td></tr><tr><td><ol start="9"><li> 1 L dH 2 O </li><li> 9 g NaCl </li><li> 144 mg KH 2 PO &lt;sub&gt; 4 </li><li> 795 mg Na 2 HPO 4 </li><li> Controllare il pH </li></ol></td></tr><tr><td> HEPES tamponata Hanks Solution (HBHS) con pH 7,4 Sodio Azide </td></tr><tr><td><ol start="14"><li> 990 ml di dH 2 O </li><li> 7,5 g di NaCl, </li><li> 0,3 g di KCl </li><li> 0,06 g di KH 2 PO 4 </li><li> 0,13 g di Na 2 HPO 4 </li><li> 2 g Destrosio / glucosio </li><li> 2.4 g 10 mm Hepes </li><li> 0,1 g MgCl 2 6 parti dH 2 O </li><li> 0,05 g MgSO 4 7 parti dH 2 O </li><li> 0,165 g CaCl 2 2 parti dH 2 O </li><li> 90 mg NaN 3 </li><li> Controllare il pH </li></ol></td></tr></tbody></table> Tabella 1. Preparazione di fissativo e tamponi. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig1.jpg" /> Figura 1. </strong&gt; Apparecchiatura di perfusione con componenti etichettati. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig2.jpg" /> Figura 2. Preparazione della perfusione Apparatus I. Inizia con la linea di fissativo. Lavare il tubo di bolle d&#39;aria e riempire con il tampone, mediante una rapida espulsione e la revoca del buffer nella siringa e attraverso la linea. Chiudere la valvola sulla fine dell&#39;ago off. Posizionare la linea fissativo nella bottiglia fissativo senza introdurre bolle d&#39;aria. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig3.jpg" /> Figura 3. Preparazione della perfusione Apparecchiatura II. 1. Aprire la valvola sul lato dell&#39;ago. 2. Girare la valvola buffer (blu) in posizione per il flusso. 3. Lavare il tubo di bolle d&#39;aria e riempire con il tampone, mediante una rapida espulsione e la revoca del buffer con la siringa. 4. Chiudere la valvola alla fine dell&#39;ago. Posizionare tubo nella bottiglia buffer. Pressione di prova per assicurarsi che il sistema è sigillato correttaly pompando il bulbo manometro e guardare il manometro. L&#39;apparecchio è pronto per la procedura di perfusione. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig4.jpg" /> Figura 4. Apparecchiatura di perfusione in posizione per la consegna del buffer. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig5.jpg" /> Figura 5. Perfusione Chirurgia I. a) Fare una incisione laterale attraverso l&#39;involucro e la parete addominale. b) Praticare un&#39;incisione nel diaframma e tagli attraverso il diaframma esponendo il cuore. Effettuare tagli paralleli ai lati delle nervature fino alla clavicola. c) bloccare la punta dello sterno con all&#39;emostato e posizionare il emostato sopra la testa. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig6.jpg" /> Figura 6. Perfusione Chirurgia II. a) passare l&#39;ago perfusione attraverso il ventricolo taglio in aorta ascendente. b) Fissare ilperfusione ago uso una serie di hemostats per reprimere il cuore. Una seconda serie di una pinza emostatica modificato può anche essere utilizzato per bloccare l&#39;aorta intorno alla punta dell&#39;ago impedisce la fuoriuscita. Utilizzando forbici iride fare una piccola incisione a estremità posteriore del ventricolo sinistro. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig7.jpg" /> Figura 7. Perfusione con la pompa del tampone lampadina manometro per creare pressione nella linea. Aprire la valvola (1) e allegare al mozzo dell&#39;ago. E &#39;fondamentale per assicurarsi che non bolle d&#39;aria vengono introdotti. Gonfiare il bulbo manometro ad una pressione di 80 mm Hg e mantenere questa pressione durante il periodo di infusione di buffer. <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig8.jpg" /> Figura 8. Perfusione con fissante volta tampone è quasi finito (200 ml) commutare la valvola tampone (1) per consentire il fissativo di flusso. La pressione può essere aumentata gradualmente fino ad unmassimo di 130 mm Hg. <img alt="Figura 9" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig9.jpg" /> Dissection Figura 9. I. a) rimuovere la testa con un paio di forbici. b) fare un&#39;incisione nella pelle lungo la linea mediana dal collo al naso ed esporre il cranio. c) tagliare il muscolo restante collo in modo che la base del cranio è esposto. Tenere la testa in modo che la grande apertura nella superficie cranio (forame magno) è accessibile. Inserire con cautela la punta di un paio di forbici iris nel forame magno e fare un taglio. Ripetere la stessa manovra per il lato controlaterale. Utilizzare i Rongeurs di sgombrare il cranio intorno al cervelletto. <img alt="Figura 10" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig10.jpg" /> Figura 10. Dissection II. a) far scorrere le forbici lungo la superficie interna del cranio. Sollevare la punta come si sta tagliando per evitare danni al cervello. Ripetere la stessalato opposto. Utilizzare Rongeurs buccia del cranio fuori dal cervello. b) illustrazione con il cranio rimosso e il cervello esposto. c) utilizzare una spatola di spezzare i bulbi olfattivi e le connessioni nervose nella posizione più anteriore del cervello. Con attenzione guidare la punta di spatola lungo la parte inferiore del cervello di recidere le connessioni per la facilità di rimozione. Togliere il cervello e metterlo in un flaconcino di fissativo.

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Note aggiuntive per un intervento chirurgico di successo: <ol><li> Una volta che il diaframma è violato, precedere rapidamente ipossia e ipercapnia avvierà irreversibili cambiamenti fisiologici che possono confondere la successiva analisi. </li><li> Quando l&#39;ago viene inserito e bloccato in posizione, la pressione residua spingerà sangue alla base dell&#39;ago (flashback). In realtà, gli animali più grandi possono vigorosamente espellere il sangue. È fondamentale che il sangue almeno raggiungere la base dell&#39;ago per evitare l&#39;introduzione di bolle d&#39;aria che presenterà un ostacolo per completare perfusione. Se il sangue non si osserva alla base dell&#39;ago, estrarre l&#39;ago e riempire con il tampone collegandolo alla porta di uscita della piattaforma perfusione. Una volta buffer è stato eseguito attraverso la punta, l&#39;ago può essere reinserito nel cuore. </li><li> Corretto posizionamento dell&#39;ago all&#39;interno della aorta è critica, non deve arrivare fino aortico. </li><li> Se perfusioni più avvengono non è necessario tinstallazione o dall&#39;inizio ogni volta. L&#39;utente deve avere il volume corretto sia per il buffer e fissativo in ogni bottiglia (200mls animali / soluzione). Le bottiglie possono essere ricaricate, se necessario. L&#39;aspetto più importante da considerare è stanare la linea di perfusione che va dal programma di installazione per l&#39;animale (valvola di uscita). Dopo il completamento di una perfusione, questa linea avrà 4% paraformaldeide in esso. Togliere il tubo dal flacone di soluzione tampone e utilizzare una siringa da 50 ml riempita con acqua per irrigare il fissativo. Assicurarsi che la valvola di scarico viene posto in un beaker di raccolta dei rifiuti per lo smaltimento della paraformaldeide. Ripetere questa operazione tre volte. Riempire con buffer utilizzando lo stesso metodo indicato in 2.3. </li><li> Questo metodo di fissaggio è altamente adattabile con la possibilità di modificare sia tampone e fissativo altri fissativi, ad esempio quelli utilizzati per EM) secondo le esigenze dell&#39;esperimento. </li><li> Il sistema viene spesso utilizzato anche per l&#39;estrazione di tessuto vivo. Per questoun processo utilizza semplicemente la consegna di solo tampone (buffer mentre il flacone ancora collegato al sistema viene posto in un contenitore e il flacone fissativo è impostato come vuoto ma sigillato). Ciò assicura una perfusione tampone freddo alla pressione ottimale. Da qui il sistema può essere adattato per l&#39;infusione di coloranti fissabili aggiungendo il colorante direttamente al buffer (se la quantità non è un problema) o utilizzare una siringa con una quantità minima di tampone / soluzione di colorante tra il tampone - passo fissativo. </li><li> Nel caso di colata vascolare, la fase di monitoraggio della pressione tampone è fondamentale tuttavia a causa della viscosità e solidificazione natura della soluzione di colata o una siringa da 50 ml deve essere utilizzato per la somministrazione diretta o un allegato monouso secondario all&#39;apparato (tubi, valvole e tenendo Contenitore) realizzato per interfacciarsi con il sistema essere utilizzato. Fusione vascolare I nostri laboratori »seguita la progettazione e la fabbricazione del dispositivo di perfusione. Pertanto non possiamo STmangiato che le misurazioni di pressione sarà una misurazione precisa al sito di consegna. I numeri possono essere regolata per ottenere la consegna di successo di fluidi viscosi. </li></ol>

<table border="1"><tbody><tr><td> Attrezzatura </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Anestetici: </td></tr><tr><td> La ketamina / xilazina miscela (anestetici può variare in base alla laboratorio / istituzione) </td><td> Ketaset </td><td> NDC 0856-2013-01 </td><td> Flaconcino da 10 ml </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Chirurgia: </td></tr><tr><td> Punta dell&#39;ago, 27 x 1,25 GA &quot; </td><td> Materiale Servizi </td><td> 25251 </td><td></td></tr><tr><td> Grandi forbici curve smussate / blunt (circa 14,5 cm) </td><td> Strumenti di Scienze Belle </td><td> 14519-14 </td><td></td></tr><tr><td> Etero iris forbici </td><td> Strumenti di Scienze Belle </td><td> 14058-11 </td><td></td></tr><tr><td&gt; Standard pinzette </td><td> Strumenti di Scienze Belle </td><td> 11027-12 </td><td></td></tr><tr><td> Coppia di fine (Graefe) pinzette </td><td> Strumenti di Scienze Belle </td><td> 11050-10 </td><td></td></tr><tr><td> 1 Pinza grandi hemostat - curvi o rettilinei (circa 19 cm) </td><td> surgicaltools.com </td><td> 17.21.51 </td><td></td></tr><tr><td> 2 pinze standard di hemostat - diritto seghettati (14 cm) </td><td> Strumenti di Scienze Belle </td><td> 13013-14 </td><td></td></tr><tr><td> 1 pinza emostatica modificato (con 15-gauge foro presentata tramite la punta) </td><td> Strumenti di Scienze Belle </td><td> 13013-14 </td><td></td></tr><tr><td> 15-gauge smussata o di olio di punta (ago perfusione) </td><td> Fisnar </td><td> 5601137 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Perfusione: </td></tr><tr><td> HyPerfusion o sistema equivalente &lt;/ Td&gt; <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tampone fosfato salino, pH 7.4 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldeide al 4% in tampone fosfato 0,1 M, pH 7,4 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Shallow vetro o il vassoio di plastica, circa 10 &quot;x 10&quot; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Ghiaccio tritato </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Bagnomaria (37 ° C) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Timer </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 50 ml siringa </td><td> Medline Industries </td><td> NPMJD50LZ </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Dissection: </td></tr><tr><td> Pair di standard di forbici affilate / blunt rette (~ 12 cm) </td><td> Strumenti di Scienze Belle </td><td> 14054-13 </td><td></td></tr><tr><td> Medio Rongeurs curvi o rettilinei (14-16 cm) o di rimozione delle ossa del cranio pinze </td><td> Strumenti di Scienze Belle </td><td> 16020-14 </td><td></td></tr><tr><td> Diritto forbici iris (circa 9 cm) </td><td> Strumenti di Scienze Belle </td><td> 14058-11 </td><td></td></tr><tr><td> Micro-spatola (2 doppi &quot;estremità piatte, uno arrotondato, uno conico a 1/8&quot;) </td><td> Strumenti di Scienze Belle </td><td> 10091-12 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Post-fissazione e conservazione: </td></tr><tr><td> 50 ml fiala di vetro </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 40 ml HEPES-Buffered Hanks Solution (HBHS) con azide di sodio (90 mg / l) </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody&gt; </table>

whole animal perfusion fixation for rodents

L&#39;obiettivo di fissaggio è di preservare rapidamente ed uniformemente tessuto in uno stato simile vita. Durante il posizionamento dei tessuti direttamente nelle opere di fissativo bene per piccoli pezzi di tessuto, grandi campioni come il cervello intatto pongono un problema per il fissaggio a immersione, perché il fissativo non raggiunge tutte le regioni del tessuto alla stessa velocità 5,7. Spesso, cambiamenti nella risposta all&#39;ipossia iniziare prima che il tessuto può essere conservato 12. Il vantaggio di perfusione fissativo direttamente attraverso il sistema circolatorio è che la sostanza chimica in grado di raggiungere rapidamente ogni angolo dell&#39;organismo naturale, utilizzando la rete vascolare. Al fine di utilizzare il sistema circolatorio più efficace, occorre prestare attenzione a corrispondere pressioni fisiologiche 3. È importante notare che pressioni fisiologiche dipendono dalle specie utilizzate. Tecniche per il fissaggio perfusione variano a seconda del tessuto da fissare e come il tessuto saranno elaborati fissazione seguente. In questo video, Noi descriviamo un basso costo, rapido, procedura di sintesi uniforme e controllata impiegando 4% paraformaldeide perfusi attraverso il sistema vascolare: attraverso il cuore di ratto per ottenere la migliore conservazione del cervello per immunoistochimica. Il vantaggio principale di questa tecnica (vs alimentata per gravità sistemi) è che il sistema circolatorio viene utilizzato più efficacemente.

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Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents

Qui noi descriviamo un basso costo, rapido, procedura di sintesi uniforme e controllata impiegando 4% paraformaldeide perfusi attraverso il sistema vascolare: attraverso il cuore di ratto per ottenere la migliore conservazione del cervello.

Tutta la perfusione di fissaggio degli animali per i roditori

The goal of fixation is to rapidly and uniformly preserve tissue in a life-like state. While placing tissue directly in fixative works well for small ...

whole-animal-perfusion-fixation-for-rodents

Research

JoVE Journal

Neuroscience

379.3K Views.  University of Michigan. Qui noi descriviamo un basso costo, rapido, procedura di sintesi uniforme e controllata impiegando 4% paraformaldeide perfusi attraverso il sistema vascolare: attraverso il cuore di ratto per ottenere la migliore conservazione del cervello.

Video: Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents

Automated Interactive Video Playback for Studies of Animal Communication

Video playback is a widely-used technique for the controlled manipulation and presentation of visual signals in animal communication. In particular, parameter-based computer animation offers the opportunity to independently manipulate any number of behavioral, morphological, or spectral characteristics in the context of realistic, moving images of animals on screen. A major limitation of conventional playback, however, is that the visual stimulus lacks the ability to interact with the live animal. Borrowing from video-game technology, we have created an automated, interactive system for video playback that controls animations in response to real-time signals from a video tracking system. We demonstrated this method by conducting mate-choice trials on female swordtail fish, Xiphophorus birchmanni. Females were given a simultaneous choice between a courting male conspecific and a courting male heterospecific (X. malinche) on opposite sides of an aquarium. The virtual male stimulus was programmed to track the horizontal position of the female, as courting males do in the wild. Mate-choice trials on wild-caught X. birchmanni females were used to validate the prototype's ability to effectively generate a realistic visual stimulus.

Video playback is a widely used technique in animal behavior. We created and evaluated a program that applies rules-based, interactive playback of 3-D computer animations in response to real-time, automated data on subject behavior.

Riproduzione automatica Interactive Video per gli Studi di comunicazione animale

Video playback is a widely-used technique for the controlled manipulation and presentation of visual signals in animal communication. In particular, ...

Ricerca

Neuroscienze

Isolating Nasal Olfactory Stem Cells from Rodents or Humans

The olfactory mucosa, located in the nasal cavity, is in charge of detecting odours. It is also the only nervous tissue that is exposed to the external environment and easily accessible in every living individual. As a result, this tissue is unique for anyone aiming to identify molecular anomalies in the pathological brain or isolate adult stem cells for cell therapy. 
Molecular abnormalities in brain diseases are often studied using nervous tissue samples collected post-mortem. However, this material has numerous limitations. In contrast, the olfactory mucosa is readily accessible and can be biopsied safely without any loss of sense of smell1. Accordingly, the olfactory mucosa provides an "open window" in the adult human through which one can study developmental (e.g. autism, schizophrenia)2-4 or neurodegenerative (e.g. Parkinson, Alzheimer) diseases4,5. Olfactory mucosa can be used for either comparative molecular studies4,6 or in vitro experiments on neurogenesis3,7.
The olfactory epithelium is also a nervous tissue that produces new neurons every day to replace those that are damaged by pollution, bacterial of viral infections. This permanent neurogenesis is sustained by progenitors but also stem cells residing within both compartments of the mucosa, namely the neuroepithelium and the underlying lamina propria8-10. We recently developed a method to purify the adult stem cells located in the lamina propria and, after having demonstrated that they are closely related to bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC), we named them olfactory ecto-mesenchymal stem cells (OE-MSC)11.
Interestingly, when compared to BM-MSCs, OE-MSCs display a high proliferation rate, an elevated clonogenicity and an inclination to differentiate into neural cells. We took advantage of these characteristics to perform studies dedicated to unveil new candidate genes in schizophrenia and Parkinson's disease4. We and others have also shown that OE-MSCs are promising candidates for cell therapy, after a spinal cord trauma12,13, a cochlear damage14 or in an animal models of Parkinson's disease15 or amnesia16.
In this study, we present methods to biopsy olfactory mucosa in rats and humans. After collection, the lamina propria is enzymatically separated from the epithelium and stem cells are purified using an enzymatic or a non-enzymatic method. Purified olfactory stem cells can then be either grown in large numbers and banked in liquid nitrogen or induced to form spheres or differentiated into neural cells. These stem cells can also be used for comparative omics (genomic, transcriptomic, epigenomic, proteomic) studies.

We describe here a method for biopsying olfactory mucosa from rat and human nasal cavities. These biopsies can be used for either identifying molecular anomalies in brain diseases or isolating multipotent adult stem cells that can be utilized for cell transplantation in animal models of brain trauma/disease.

Isolare cellule staminali olfattivo nasale da roditori o Umani

The olfactory mucosa, located in the nasal cavity, is in charge of detecting odours. It is also the only nervous tissue that is exposed to the external ...

Large-scale Recording of Neurons by Movable Silicon Probes in Behaving Rodents

A major challenge in neuroscience is linking behavior to the collective activity of neural assemblies. Understanding of input-output relationships of neurons and circuits requires methods with the spatial selectivity and temporal resolution appropriate for mechanistic analysis of neural ensembles in the behaving animal, i.e. recording of representatively large samples of isolated single neurons. Ensemble monitoring of neuronal activity has progressed remarkably in the past decade in both small and large-brained animals, including human subjects1-11. Multiple-site recording with silicon-based devices are particularly effective because of their scalability, small volume and geometric design.
Here, we describe methods for recording multiple single neurons and local field potential in behaving rodents, using commercially available micro-machined silicon probes with custom-made accessory components. There are two basic options for interfacing silicon probes to preamplifiers: printed circuit boards and flexible cables. Probe supplying companies (<a href="http://www.neuronexustech.com/" >http://www.neuronexustech.com/</a>; <a href="http://www.sbmicrosystems.com/">http://www.sbmicrosystems.com/</a>; <a href="http://www.acreo.se/">http://www.acreo.se/</a>) usually provide the bonding service and deliver probes bonded to printed circuit boards or flexible cables. Here, we describe the implantation of a 4-shank, 32-site probe attached to flexible polyimide cable, and mounted on a movable microdrive. Each step of the probe preparation, microdrive construction and surgery is illustrated so that the end user can easily replicate the process.

We describe methods for large-scale recording of multiple single units and local field potential in behaving rodents with silicon probes. Drive fabrication, probe attachment to the drive and probe implantation processes are illustrated in sufficient details for easy replication.

Su larga scala di registrazione dei neuroni da sonde mobili in silicio Comportarsi Roditori

A major challenge in neuroscience is linking behavior to the collective activity of neural assemblies. Understanding of input-output relationships of ...

A Low Cost Setup for Behavioral Audiometry in Rodents

In auditory animal research it is crucial to have precise information about basic hearing parameters of the animal subjects that are involved in the experiments. Such parameters may be physiological response characteristics of the auditory pathway, e.g. via brainstem audiometry (BERA). But these methods allow only indirect and uncertain extrapolations about the auditory percept that corresponds to these physiological parameters. To assess the perceptual level of hearing, behavioral methods have to be used. A potential problem with the use of behavioral methods for the description of perception in animal models is the fact that most of these methods involve some kind of learning paradigm before the subjects can be behaviorally tested, e.g. animals may have to learn to press a lever in response to a sound. As these learning paradigms change perception itself 1,2 they consequently will influence any result about perception obtained with these methods and therefore have to be interpreted with caution. Exceptions are paradigms that make use of reflex responses, because here no learning paradigms have to be carried out prior to perceptual testing. One such reflex response is the acoustic startle response (ASR) that can highly reproducibly be elicited with unexpected loud sounds in na&iuml;ve animals. This ASR in turn can be influenced by preceding sounds depending on the perceptibility of this preceding stimulus: Sounds well above hearing threshold will completely inhibit the amplitude of the ASR; sounds close to threshold will only slightly inhibit the ASR. This phenomenon is called pre-pulse inhibition (PPI) 3,4, and the amount of PPI on the ASR gradually depends on the perceptibility of the pre-pulse. PPI of the ASR is therefore well suited to determine behavioral audiograms in na&iuml;ve, non-trained animals, to determine hearing impairments or even to detect possible subjective tinnitus percepts in these animals. In this paper we demonstrate the use of this method in a rodent model (cf. also ref. 5), the Mongolian gerbil (Meriones unguiculatus), which is a well know model species for startle response research within the normal human hearing range (e.g. 6).

A fast and inexpensive method for the behavioral determination of hearing parameters like hearing thresholds, hearing impairments or phantom perceptions (subjective tinnitus) is described. It uses pre-pulse inhibition of the acoustic startle response and can be easily implemented in a personal computer using a programmable AD/DA-converter and a piezo sensor.

Un programma di installazione a basso costo per audiometria comportamentale nei roditori

In auditory animal research it is crucial to have precise information about basic hearing parameters of the animal subjects that are involved in the ...

Deep Brain Stimulation with Simultaneous fMRI in Rodents

In order to visualize the global and downstream neuronal responses to deep brain stimulation (DBS) at various targets, we have developed a protocol for using blood oxygen level dependent (BOLD) functional magnetic resonance imaging (fMRI) to image rodents with simultaneous DBS. DBS fMRI presents a number of technical challenges, including accuracy of electrode implantation, MR artifacts created by the electrode, choice of anesthesia and paralytic to minimize any neuronal effects while simultaneously eliminating animal motion, and maintenance of physiological parameters, deviation from which can confound the BOLD signal.&#160;Our laboratory has developed a set of procedures that are capable of overcoming most of these possible issues. For electrical stimulation, a homemade tungsten bipolar microelectrode is used, inserted stereotactically at the stimulation site in the anesthetized subject. In preparation for imaging, rodents are fixed on a plastic headpiece and transferred to the magnet bore. For sedation and paralysis during scanning, a cocktail of dexmedetomidine and pancuronium is continuously infused, along with a minimal dose of isoflurane; this preparation minimizes the BOLD ceiling effect of volatile anesthetics. In this example experiment, stimulation of the subthalamic nucleus (STN) produces BOLD responses which are observed primarily in ipsilateral cortical regions, centered in motor cortex. Simultaneous DBS and fMRI allows the unambiguous modulation of neural circuits dependent on stimulation location and stimulation parameters, and permits observation of neuronal modulations free of regional bias. This technique may be used to explore the downstream effects of modulating neural circuitry at nearly any brain region, with implications for both experimental and clinical DBS.

This protocol describes a standard method for simultaneous functional magnetic resonance imaging and deep brain stimulation in the rodent. The combined use of these experimental tools allows for the exploration of global downstream activity in response to electrical stimulation at virtually any brain target.

La stimolazione cerebrale profonda con simultanea fMRI in Roditori

In order to visualize the global and downstream neuronal responses to deep brain stimulation (DBS) at various targets, we have developed a protocol for ...

Acrylic Resin Molding Based Head Fixation Technique in Rodents

Head fixation is a technique of immobilizing animal's head by attaching a head-post on the skull for rigid clamping. Traditional head fixation requires surgical attachment of metallic frames on the skull. The attached frames are then clamped to a stationary platform resulting in immobilization of the head. However, metallic frames for head fixation have been technically difficult to design and implement in general laboratory environment. In this study, we provide a novel head fixation method. Using a custom-made head fixation bar, head mounter is constructed during implantation surgery. After the application of acrylic resin for affixing implants such as electrodes and cannula on the skull, additional resins applied on top of that to build a mold matching to the port of the fixation bar. The molded head mounter serves as a guide rails, investigators conveniently fixate the animal&#8217;s head by inserting the head mounter into the port of the fixation bar. This method could be easily applicable if implantation surgery using dental acrylics is necessary and might be useful for laboratories that cannot easily fabricate CNC machined metal head-posts.

Traditional head fixation techniques have used metallic frames attached on the skull as an interface for head fixation apparatus. This protocol demonstrates a frameless, acrylic resin molding based head fixation technique for behavioral tasks in rodents.

Acrilico Resina Molding Based Testa tecnica di fissazione in Roditore

Head fixation is a technique of immobilizing animal's head by attaching a head-post on the skull for rigid clamping. Traditional head fixation requires ...

A Novel Strategy Combining Array-CGH, Whole-exome Sequencing and In Utero Electroporation in Rodents to Identify Causative Genes for Brain Malformations

Birth defects that involve the cerebral cortex &#8212; also known as malformations of cortical development (MCD) &#8212; are important causes of intellectual disability and account for 20-40% of drug-resistant epilepsy in childhood. High-resolution brain imaging has facilitated in vivo identification of a large group of MCD phenotypes. Despite the advances in brain imaging, genomic analysis and generation of animal models, a straightforward workflow to systematically prioritize candidate genes and to test functional effects of putative mutations is missing. To overcome this problem, an experimental strategy enabling the identification of novel causative genes for MCD was developed and validated. This strategy is based on identifying candidate genomic regions or genes via array-CGH or whole-exome sequencing and characterizing the effects of their inactivation or of overexpression of specific mutations in developing rodent brains via in utero electroporation. This approach led to the identification of the C6orf70 gene, encoding for a putative vesicular protein, to the pathogenesis of periventricular nodular heterotopia, a MCD caused by defective neuronal migration.

A Novel Strategy Combining Array-CGH, Whole-exome Sequencing and In Utero Electroporation in Rodents to Identify Causative Genes for Brain Malformations

Periventricular nodular heterotopia (PNH) is the most common form of malformation of cortical development (MCD) in adulthood but its genetic basis remains unknown in most sporadic cases. We have recently developed a strategy to identify novel candidate genes for MCDs and to directly confirm their causative role in vivo.

Una nuova strategia che unisce Array-CGH, sequenziamento dell'intero-esoma e nell'Utero elettroporazione in roditori per identificare geni causativi per le malformazioni del cervello

Birth defects that involve the cerebral cortex &#8212; also known as malformations of cortical development (MCD) &#8212; are important causes of ...

Cannula Implantation into the Cisterna Magna of Rodents

Cisterna magna cannulation (CMc) is a straightforward procedure that enables direct access to the cerebrospinal fluid (CSF) without operative damage to the skull or the brain parenchyma. In anesthetized rodents, the exposure of the dura mater by blunt dissection of the neck muscles allows the insertion of a cannula into the cisterna magna (CM). The cannula, composed either by a fine beveled needle or borosilicate capillary, is attached via a polyethylene (PE) tube to a syringe. Using a syringe pump, molecules can then be injected at controlled rates directly into the CM, which is continuous with the subarachnoid space. From the subarachnoid space, we can trace CSF fluxes by convective flow into the perivascular space around penetrating arterioles, where solute exchange with the interstitial fluid (ISF) occurs. CMc can be performed for acute injections immediately following the surgery, or for chronic implantation, with later injection in anesthetized or awake, freely moving rodents. Quantitation of tracer distribution in the brain parenchyma can be performed by epifluorescence, 2-photon microscopy, and magnetic resonance imaging (MRI), depending on the physico-chemical properties of the injected molecules. Thus, CMc in conjunction with various imaging techniques offers a powerful tool for assessment of the glymphatic system and CSF dynamics and function. Furthermore, CMc can be utilized as a conduit for fast, brain-wide delivery of signaling molecules and metabolic substrates that could not otherwise cross the blood brain barrier (BBB).

Here we describe a protocol to perform cisterna magna cannulation (CMc), a minimally invasive way to deliver tracers, substrates and signaling molecules into the cerebrospinal fluid (CSF). Combined with different imaging modalities, CMc enables glymphatic system and CSF dynamics assessment, as well as brain-wide delivery of various compounds.

Impianto di cannula in Cisterna Magna di roditori

Cisterna magna cannulation (CMc) is a straightforward procedure that enables direct access to the cerebrospinal fluid (CSF) without operative damage to ...

Air-Inflation of Murine Lungs with Vascular Perfusion-Fixation

Lung histology is often used to investigate the contributions provided by airspace cells during lung homeostasis and disease pathogenesis. However, commonly used instillation-based fixation methods can displace airspace cells and mucus into terminal airways and can alter tissue morphology. In comparison, vascular perfusion-fixation techniques are superior at preserving the location and morphology of cells within airspaces and the mucosal lining. However, if positive airway pressure is not simultaneously applied, regions of the lungs may collapse and capillaries may bulge into the alveolar spaces, leading to distortion of the lung anatomy. Herein, we describe an inexpensive method for air-inflation during vascular perfusion-fixation to preserve the morphology and location of airway and alveolar cells and interstitium in murine lungs for downstream histologic studies. Constant air pressure is delivered to the lungs via the trachea from a sealed, air-filled chamber that maintains pressure via an adjustable liquid column while fixative is perfused through the right ventricle.

Presented is a method for air-inflation with vascular perfusion-fixation of the lungs that preserves the location of cells within airways, alveoli and interstitium for structure-function analyses. Constant airway pressure is maintained with an air-inflation chamber while fixative is perfused via the right ventricle. Lungs are processed for histologic studies.

Gonfiaggio dell'aria dei polmoni murini con perfusione-fissazione vascolare

Lung histology is often used to investigate the contributions provided by airspace cells during lung homeostasis and disease pathogenesis. However, ...