Questo protocollo fornisce una descrizione dettagliata di come co-coltura delle cellule staminali della polpa dentale con i neuroni trigeminali. Con esso, possiamo indagare su più risposte guidate dal loro crosstalk. Il principale vantaggio di questa tecnica è la capacità di studiare e manipolare una o entrambe le popolazioni cellulari e misurare con precisione i risultati.
Questo metodo ha una rilevanza diretta per la ricerca neurale e potrebbe fornire informazioni sulla ricerca su come le cellule staminali della polpa dentale riparano il tessuto neurale danneggiato da eventi traumatici o malattie neurodegenerative. Ci sono diverse fasi di questa tecnica da imparare e può essere difficile mantenere il tratto di tutti. Questo protocollo descrive in dettaglio ogni fase per aiutare in questo.
La polpa dentale e i gangli sono difficili da disperdere e richiedono vari vortici e pipettaggio. Anche in questo caso non otterrai la piena dispersione, quindi sarà necessaria l'ottimizzazione e le repliche. Dopo l'eutanasia del mouse, posizionare la testa sul sottopad monouso in modo che la bocca sia verso il soffitto e la base del collo sia piatta sulla superficie di lavoro.
Utilizzare una lama di rasoio e un movimento di segatura per separare la mascella dalla mascella. Rimuovere la lingua con forbici o forcep per consentire un accesso più facile ai molari. Posizionare la testa aperta nel piatto in cima a un tampone di garza sterile e posizionare il campione sotto il microscopio di sezionazione.
Rimuovere il tessuto osseo alveolare che circonda i primi molari. Inserire le forcelle nell'apertura alveolare e stuzzicare il tessuto lontano dal dente verso il buccle o il lato linguale della bocca. Raccogliere tutti i primi molari mascellari e trasferire delicatamente i primi molari submandibolari e mascellari in un piatto separato di coltura cellulare con 1X PBS sul ghiaccio.
Rimuovere l'organo esterno in smalto che circonda l'esterno di ogni primo molare mascellare. Con un set di forcep ruotare il molare in modo che le cuspidi siano verso il basso e la radice aperta sia esposta. C'è un'apertura ovale sul fondo del dente e tessuto opaco della polpa dentale incapsulato da un sottile strato di dentina e smalto.
Usando la punta delle forcep, allentare delicatamente la polpa dentale facendo scorrere un braccio delle forcep attorno alla circonferenza interna del tessuto mineralizzato. Rimuovere il tessuto della polpa dentale dalla struttura mineralizzata e trasferirlo in un terzo piatto contenente 1X PBS. Rimuovere l'organo esterno in smalto se non era già separato.
Trasferire tutto il tessuto della polpa dentale allo 0,25% di EDTA di tripside in un tubo conico da 50 millilitri. Vortice la miscela e posizionare in un bagno d'acqua calda di 37 gradi Celsius per 10 minuti. Sotto un cappuccio sterile, aggiungere i supporti di co-coltura riscaldati a un rapporto finale di almeno uno a uno per la tripparina per inattivare l'enzima.
Pipettare il supporto su e giù più volte con una pipetta da 10 millilitri per disperdere ulteriormente la polpa dentale nel supporto, evitare grandi bolle. Trasferire un millilitro della polpa dentale dispersa in ogni pozzo della piastra di coltura tissutale a 24 pozzi. Posizionare la piastra in un'incubatrice a 37 gradi Celsius.
E permettere alle cellule di attaccarsi e migrare dal tessuto non disperso per 48 ore prima di cambiare il supporto. Dopo l'eutanasia e la rimozione della pelle, inserire la punta di un paio di micro forbici sezionanti nella base del cranio. Tagliare lungo la sutura sagittale del cranio.
Fai quattro piccoli tagli orizzontali lungo le suture coronali dalle orecchie fino a lungo le suture lambdoidi della base del cranio. Questo crea due lembi di osso. Usa le forcep per sbucciare i due lembi di osso per rivelare il cervello.
Individuare i gangli trigeminali ospitati nella dura madre tra il cervello e l'osso del processo mascellare. Taglia i tre rami che viaggiano verso gli occhi, mascellae e mattiglia. E usa le forcette sottili a bordo dritto per trasferire i gangli al freddo 1X PBS in un piatto sul ghiaccio.
Una volta raccolti tutti i fasci trigeminali, utilizzare i file forcep per trasferire i gangli in un tubo conico da 50 millilitri contenente cinque milligrammi per millilitro di collagenasi filtrata sterile di tipo II.Vortice la miscela e posizionare il tubo nel bagno d'acqua Celsius di 37 gradi per 25-30 minuti. Ogni cinque o dieci minuti, togliere il tubo dal bagno d'acqua, dal vortice e tornare al bagno. Centrifugare la soluzione di neurone trigeminale di collagenasi per due minuti a 643xg.
Sotto una cappa di coltura tissutale, aspirare delicatamente la collagenasi con un micropipetto e aggiungere cinque millilitri di tripina filtrata sterile all'1%di tipo II.Quindi posizionare il tubo in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius per 25-30 minuti e in questo vortice di tempo il tubo brevemente ogni cinque minuti. Aggiungere supporti con un rapporto uno-a-uno tra tripina e supporto per disattivare la tripina rimanente. Contare il numero di cellule e diluire la miscela a 200.000 cellule per millilitro nei mezzi.
Posizionare i filtri transwell rivestiti in pozzi con polpa dentale. Pipettare 250 microlitri sul filtro transwell e coltura delle cellule a 37 gradi Celsius durante la notte. Il giorno dopo, sostituire il supporto con un millilitro di mezzi di co-coltura integrati con un uridina micromolare e 15 micromolare 5-Fluoro-2'deossiuridina per fermare la sovra proliferazione delle cellule mesenchimali che può prevenire la crescita della neurite.
È necessario aggiungere inibitori mitotici il secondo giorno o la crescita della neurite non si verificherà. In questo studio, la crescita della neurite trigeminale è stata aumentata in presenza di cellule primarie della polpa dentale nel pozzo sottostante rispetto al controllo della monocoltura di neurite trigeminale. Le cellule primarie isolate dal topo del recettore TGF-beta 2 flox/flox erano equivalenti in numero dopo iniezioni di ade-Cre-GFP o ade-eGFP.
La PCR semi-quantitativa dimostra che l'adenovirus-Cre-GFP ha eliminato il gene affiancato trasformando il recettore beta del fattore di crescita 2 con adenovirus-eGFP che funge da vettore virale di controllo. Nelle colture con la trasformazione del recettore beta del fattore di crescita 2, la crescita della neurite è diminuita. L'imaging a campo brillante dei filtri transwell dopo la colorazione viola cristallina delle popolazioni cellulari mostra che i pori di grandi dimensioni sono prevalenti.
La grande freccia indica una cellula con morfologia mesenchimale mentre la piccola freccia punta a una cellula di morfologia neuronale. Il viola cristallo ha macchiato entrambe le cellule senza pregiudizi. Inoltre, la colorazione ad immunofluorescenza della tubulina beta-III con un anticorpo secondario alexa 488 mostra una colorazione non specifica di più cellule rendendo difficile l'imaging di strutture afferenti.
Poiché né le cellule della polpa dentale né i neuroni trigeminali si disperdono facilmente, ogni ricercatore dovrà ottimizzare le proprie procedure di placcatura. Se si colturano le cellule della polpa dentale da sole in pozzi separati è possibile utilizzare l'immunofluorescenza o è possibile quantificare i livelli di RNA o proteine per determinare come le cellule della polpa dentale stanno rispondendo ai neuroni. Ricorda di sbiancare tutti i contenitori o le punte che entrano in contatto con l'adenovirus.
Assicurati di scartare correttamente i rasoi in un bidone affilato.
