L'imaging batteriovoro Bdellovibrio a cellule vive è stato impegnativo a causa del complesso ciclo di vita di questi batteri predatori. Il nostro protocollo consente il monitoraggio delle fasi del ciclo di vita completo in tempo reale. Sebbene il nostro protocollo si basi su uno specifico ceppi di equalizzazione, può essere facilmente adattato a una varietà di ceppi batterici tra cui ceppi patogeni.
Per impostare una coltura di B.bacteriovorus, combinare un millilitro di batteri freschi coltivati 24 ore su 24 con tre millilitri di coltura di prede durante la notte in un matraccio da 250 millilitri contenente 50 millilitri di tampone di hippy di calcio integrati con antibiotici se necessario. Dopo un'incubazione di 24 ore a 30 gradi Celsius e 200 giri al minuto, verificare che le cellule preda siano state completamente lisci dalla microscopia a contrasto facciale montata sul liquido. Devono essere presenti numerose cellule B.bacteriovorus in fase multi-attacco e nessuna cellula E.coli o bdelloplast dovrebbe essere visibile.
Filtrare la coltura di B.bacteriovorus attraverso un filtro di dimensioni dei pori di 0,45 micrometri in un tubo conico da 50 millilitri e sospendere il filtrato in una centrifuga. Quindi sospendere di nuovo il pellet di B.bacteriovorus in tre millilitri di hippy di calcio tamponare a una densità ottica finale a 600 nanometri di circa 0,2 e incubare i batteri a 30 gradi celsius e 200 giri al minuto per 30 minuti. Per preparare le cellule ospiti, selezionare una singola colonia dal ceppo ospite di interesse e nodulare i batteri in 10 millilitri di mezzo YT integrati con antibiotici se necessario per un'incubazione notturna a 37 gradi Celsius e 180 giri al minuto.
La mattina seguente trasferire due millilitri della coltura notturna in una provetta da due millilitri e pelletare le cellule per centrifugazione. Quindi sospendere di nuovo il pellet in 200 microlitri di tamponamento hippy di calcio. È molto importante sospendere completamente l'intero pellet cellulare dopo la centrifugazione per assicurarsi che la cellula preda sia separata a livello di singola cella.
Per preparare le cellule alla microscopia a fluorescenza time-lapse, in primo luogo, mescolare 200 milligrammi di agarosio a basso grado molecolare fluorescente con 20 millilitri di tamponamento hippy di calcio e sciogliere l'agarosio in un forno a microonde. Versare tre millilitri dell'agarosio fuso in un piatto inferiore di vetro da 35 millimetri e lasciare che l'agarosio si solidifichi. Utilizzando una micro spatola da laboratorio, rimuovere con cura il tampone di agarosio dal piatto senza disturbare il palo centrale del pad e posizionare il lato inferiore del pad verso l'alto su una copertura della piastra di Petri.
Posizionare cinque microlitri della sospensione della cella ospite concentrata sul pad capovolto e utilizzare un ciclo di inoculazione per diffondere le cellule nel polo centrale. Aggiungere quindi cinque microlitri della sospensione B.bacteriovorus concentrata sulla superficie rivestita della cellula ospite senza diffondersi e riportare rapidamente il gel al piatto inferiore inferiore in vetro da 35 millilitri dall'alto verso il basso. Quindi coprire il piatto con un coperchio.
Per la microscopia Time-Lapse Florescence della co-coltura, mettere la piastra in un portapiatti di Petri in modo che la piastra non si muova nel corso dell'esperimento e posizionare una goccia di olio ad immersione sull'obiettivo del microscopio invertito e una goccia sul fondo del piatto. Montare il supporto sullo stadio del microscopio all'interno della camera del microscopio invertito e nel software del microscopio impostare l'ingrandimento su 100X e la lente policroma su GFP e Mcherry. Utilizzando un iPS in Brightfield, individuate il piano focale e aprite l'inutile manager.
Spostare la fase e utilizzare il pulsante contrassegni per memorizzare le coordinate di almeno 10 posizioni di interesse. Passare dall'iPS al monitor. Impostare il piano focale e fare clic sul pulsante sostituisci punto inutile da gestore per calibrare ogni punto.
Aprire il progettista dell'esperimento e deselezionare la casella di impilamento delle malattie. Selezionare i canali fluorescenti appropriati e le impostazioni di eliminazione ottimali e impostare gli intervalli tra l'acquisizione dell'immagine e il tempo totale dell'esperimento. Abilitare la manutenzione dello stato attivo per le posizioni scelte e selezionare la cartella dati in cui i file di immagine devono essere salvati automaticamente.
Ricontrollare tutte le impostazioni nel controllo software del microscopio e avviare l'esperimento time-lapse. Dopo la prima ora dell'esperimento, verificare che tutte le posizioni dello stadio siano ancora a fuoco. Al termine dell'esperimento time-lapse, rimuovere la piastra di Petri e scartare la piastra da 35 millimetri con un tampone di agarosio secondo gli opportuni protocolli di biosicurezza.
Per l'elaborazione dei dati delle immagini time-lapse, trasferire i dati sperimentali su un computer caricato con il software Fiji e aprire un'immagine nelle Figi. Nelle opzioni di importazione dei biosi formati selezionare stack di visualizzazione con hyperstack. In modalità colore composito, selezionare scala automatica.
Scorrendo gli stack di immagini si valuta se le cellule e i bdelloplasti sono rimasti a fuoco nel corso dell'esperimento. Se le macchie fluorescenti verdi del DNA e del verde mNeon sono presenti all'interno delle cellule B.bacteriovorus all'interno dei bdelloplasti durante tutta la fase di crescita e se tutte le fasi del ciclo di vita predatorio possono essere visualizzate. Per analizzare un particolare bdelloplasto cellulare B.bacteriovorus, utilizzare uno strumento di selezione per contrassegnare la cellula di interesse.
Quindi duplicare l'area scelta. Nell'immagine duplicata, fai clic su processo e smussa e per ogni canale fluorescente fai clic su immagine, colore, strumenti canali e seleziona il canale di interesse. Quindi fare clic su immagine, regolazione e contrasto della luminosità per regolare la luminosità e il contrasto dell'immagine in ogni canale.
Per aggiungere una barra di scala, selezionare analizza, strumenti e barra di scala. Per aggiungere un timestamp alle immagini, fare clic su immagini, stack e timestamp. Per salvare le immagini modificate, selezionare TIF.
Per salvare i dati come sequenza di immagini, AVI per produrre un filmato o PNG per salvare una singola immagine del fotogramma corrente. Questo sistema basato sulla microscopia a fluorescenza time-lapse consente il tracciamento in tempo reale delle singole cellule B.bacteriovorus e fornisce preziose informazioni su ogni fase del complesso ciclo di vita predatorio. La fusione gogna mCherry consente di etichettare l'intera cellula predatoria nella fase di attacco e nella fase iniziale della fase di crescita.
Il passaggio dall'attacco alla fase replicativa può essere visualizzato non solo dalla formazione ospite di bdelloplast ma anche dalla comparsa del replisome. Il replisome viene assemblato al polo cellulare invasore e più di un replisome può essere osservato all'interno di un filamento B.bacteriovorus in crescita man mano che la fase di riproduzione progredisce. Dopo che diverse copie del cromosoma sono state sintetizzati, la replicazione viene terminata.
Infine, il filamento multinucleato subisce settazione e le cellule di progenie vengono rilasciate dal bdelloplasto. Le cellule B.bacteriovorus dovrebbero essere abbastanza materiali da cercare attivamente la loro preda e l'intera densità cellulare dovrebbe essere abbastanza alta da consentire l'attacco cellulare predatorio. Questa piattaforma può essere utile in esperimenti che coinvolgono agenti patogeni resistenti a più farmaci e per facilitare il miglioramento dell'ingegneria genetica del batteriovoro B come antibiotico vivo nella medicina umana e veterinaria.
