Questo lavoro è stato sostenuto dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 655) e l&#39;Unione europea (Zf-Sanità).

1. Preparazione della miscela Iniezione <ol><li> Utilizzare Morpholinos vivo come cellule li interiorizzano in modo più efficiente rispetto ai normali molecole morpholino. Vedere le informazioni del produttore per i dettagli (Tabella 1: Reagenti e materiali). </li><li> Utilizzare un colorante fluorescente tracciamento (es. CellTracker Rosso CMTPX, Invitrogen) per visualizzare la precisione dell&#39;iniezione. Questo colorante è metabolizzato nella cella e diventa fluorescente soltanto nella cella dopo l&#39;assorbimento. Pertanto, questo passaggio è essenziale per determinare le cellule che sono efficientemente mira dal microiniezione cerebroventricular. </li><li> Preparare tampone fosfato salino (PBS) (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM di Na 2 HPO 4, 2 mM KH 2 PO 4, pH: 7,4) per diluire la soluzione morfolino. Se è richiesta una diluizione della soluzione morfolino, utilizzare sempre PBS. </li><li> Preparare 10 microlitri della miscela di iniezione aggiungendo 9 microlitri della soluzione morfolino e 1 ml di secoloe cellule inseguitore colorante (diluito o non diluito la concentrazione il punto della soluzione morfolino è di 500 micron nostri risultati precedenti 22 indicano che diverse dosi diverse del morpholino -.. che vanno da 50 micron a 500 micron - Risultato in diversi livelli di atterramento da un efficiente atterramento di fenotipi hypomorphic). 1 ml di soluzione è sufficiente per l&#39;iniezione in un cervello zebrafish. </li><li> Mescolare bene e conservare a temperatura ambiente fino a quando l&#39;iniezione. </li></ol> 2. Preparazione del dispositivo di iniezione <ol><li> Preparare il vetro iniezione capillari con un estrattore ago. Utilizzare i seguenti parametri: valore del ciclo di riscaldamento: 463, tirando valore di ciclo: 230, velocità: 1,5 sec, tempo: 75 msec. </li><li> Accendere la fonte di pressione e regolare le impostazioni di pressione a 50 psi o 3,5 bar. </li><li> Regolare le impostazioni microinjector come segue: tenere la pressione di 20 psi, pressione di espulsione 10 psi, valore di periodo di 2,5 e 100 msec di gating. </li><li> Giraresull&#39;anello illuminatore e individuare l&#39;anello sopra il palco microscopio. </li><li> Posizionare il supporto capillare in una posizione appropriata accanto al microscopio. </li><li> Inserire il capillare di vetro nel supporto. Regolare l&#39;angolo di iniezione a 45 gradi. </li><li> Snap off la punta del capillare di vetro usando un fine-end pinza e calibrare la pressione di uscita dall&#39;orifizio. Questo deve essere testato immergendo la punta dell&#39;ago in acqua pesce e dando un impulso di pressione continua. Le bolle d&#39;aria risultanti devono essere solo una riga, che è un&#39;indicazione della pressione ottimale / dimensione dell&#39;orifizio. Si prega di vedere il video di dimostrazione di questa calibrazione. </li><li> Caricare il capillare di vetro con la soluzione di iniezione senza intrappolare bolle d&#39;aria. </li><li> Applicare pressione per rimuovere l&#39;aria tra la punta del capillare di vetro e la soluzione iniettabile caricato. </li></ol> 3. Anestesia <ol><li> Preparare la soluzione di riserva degli anestetici (0,1% MESAB - etil-m-aminobenzoate Metansolfonato). </li><li> Rimuovere il numero desiderato di pesci dai loro carri armati nelle gabbie del mouse di plastica o in altri contenitori di trasporto con sufficiente quantità di acqua. </li><li> Preparare la soluzione di anestesia in una piccola scatola di plastica mescolando 200 ml di acqua di pesce con 5 ml di soluzione madre di anestetici. Concentrazione finale del anestetici: 0,0025% (v / v). </li><li> Riempire a metà un piatto di plastica Petri con anestetici. Utilizzare questo piatto per preparazioni iniettabili. </li><li> Incubare il pesce negli anestetici fino agli soggioga pesce. </li></ol> 4. Incisione e microiniezione Cerebroventricular <ol><li> Togliere il pesce dalla scatola con una rete di pesce e metterlo nel piatto di Petri. </li><li> Premere delicatamente il pesce con il forcipe e orientare la testa in un modo che si inclina leggermente verso il basso. Ciò faciliterà l&#39;incisione. </li><li> Generare una piccola fessura sul cranio con un 30 gauge spinato-end. Usare solo la punta di un ago e non penetrano più disufficiente nel cervello ciò causerebbe danni al tessuto cerebrale e si manifesterà come sanguinamento. </li><li> Continua a tenere il pesce e inserire la punta di un capillare di vetro attraverso il sito di incisione. </li><li> Orientare la punta del capillare di vetro verso il telencefalo. Evitare di toccare il tessuto cerebrale come questo crea danno tissutale e impedisce anche la dispersione della soluzione iniettata. </li><li> Iniettare la soluzione. Il liquido disperde immediatamente dopo l&#39;iniezione. </li></ol> 5. Recupero e l&#39;analisi dei iniezione Precisione <ol><li> Togliere il pesce dalla configurazione di iniezione e posto in una scatola di plastica con acqua di pesce fresco. </li><li> Consentire il recupero. </li><li> Re-anestetizzare il pesce con 0,0025% MESAB brevemente e controllare il pesce sotto il microscopio a fluorescenza. Una dispersione approfondita di fluorescenza rossa è un&#39;indicazione di ampia diffusione del liquido iniettato. </li><li> Mettete il pesce alla scatola di plastica. </li><li> Collegare la scatola di plastica per tegli sistema di circolazione per ossigenare il pesce e mantenere per lunghi periodi di tempo. </li><li> Utilizzare i pesci per scopi desiderati come analisi comportamentali o sacrificare gli animali nei punti di tempo desiderato dopo l&#39;iniezione per preparare campioni di tessuto per ulteriori analisi (colorazioni istologiche, immunoistochimica, ecc.) I riferimenti seguenti forniscono esempi di come analizzare l&#39;adulto zebrafish cervello: 9,11,17-20,24-27. Il miglior tempo di osservare un atterramento efficiente (più del 50% atterramento) è stato 12 ore nei nostri studi 22. </li></ol> 6. Controlli scientifici consigliati <ol><li> Utilizzare un disallineamento morfolino molecola che non dovrebbe causare alcun fenotipo come controllo negativo. Utilizzare una molecola morpholino standard o specificamente di progettazione controlli morpholino per ogni gene di interesse. Inoltre, utilizzare il solvente (in questo caso PBS) come ulteriore controllo negativo per valutare gli effetti o tossicità non specifici del mismoatch / controllare iniezioni morpholino. </li><li> Utilizzare PCNA Morpholinos precedentemente descritto 22 come controlli positivi. Questo morpholino provoca atterramento efficace nel cervello zebrafish adulto (75-95% di efficienza atterramento entro 1 giorno di iniezione) 22. </li></ol>

<ol>
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N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function.">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).</li><li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+mRNA+and+morpholino+antisense+oligonucleotides+in+zebrafish+embryos.">Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos.</a> J. Vis. Exp. (27), e1113 (2009).</li><li>Rikin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reverse+genetic+approach+to+test+functional+redundancy+during+embryogenesis.">A reverse genetic approach to test functional redundancy during embryogenesis.</a> J. Vis. Exp. (42), e2020 (2010).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il metodo che descriviamo qui permette l&#39;amministrazione facile e rapida Morpholinos nel cervello zebrafish adulto. Abbiamo dimostrato che il nostro metodo di iniezione blocca efficacemente l&#39;espressione genica nelle cellule ventricolari e comporta conseguenze funzionali nella risposta neurogenesi. Ci sono punti importanti da essere cauti durante l&#39;esecuzione della microiniezione cerebroventricular. Per esempio, l&#39;effetto delle molecole morpholino dipende dalla concentrazione usata. Questa concentrazione deve essere determinata dal finale. Si consiglia di iniziare con la soluzione di riserva (500 micron) e l&#39;esecuzione di diluizioni seriali, e idealmente a pre-test per iniezione in embrioni utilizzando standard di embrione iniezione protocolli 28-30. In precedenza, abbiamo ottenuto diversi livelli di efficienza knockdown con concentrazioni di Morpholinos vanno da 50 micron a 500 micron 22. Secondo, l&#39;orifizio del vetro capillare non deve essere large come questo porterà ad ampio afflusso di liquido nel cervello dopo l&#39;iniezione. Analogamente, l&#39;apertura non deve essere troppo stretto in modo da evitare l&#39;iniezione adeguato. Si può determinare la combinazione ottimale orifizio-pressione di pompaggio di aria in una piastra di Petri con acqua. Le bolle derivanti dovrebbero essere in una singola riga ma non in più righe. Dimostriamo questo nel video. Terzo, incubando i pesci nelle anestetici è critica. Il pesce non deve essere tenuto più di 2 min negli anestetici. Ciò ostacolerà il tasso di recupero dopo l&#39;iniezione. In quarto luogo, la posizione dell&#39;incisione è critica per disperdere completamente il liquido iniettato. La regione ventricolare sopra il tetto ottico è maggiore al di sopra della linea mediana e si restringe lateralmente. Pertanto, lo sperimentatore dovrebbe generare la fenditura nel cranio vicino alla linea mediana e appena caudalmente alla piastra cranio copre la regione telencefalico. Uno dei vantaggi del injectio cerebroventricularn metodo (CVMI) è il suo rapidness. CVMI è un metodo rapido per saggiare la funzione del gene. Questa caratteristica è importante e utile quando rispetto alla generazione di linee transgeniche per studi funzionali, che generalmente necessari diversi mesi. Ulteriormente, CVMI porta ad una distribuzione uniforme del liquido iniettato e quindi fornisce una manipolazione relativamente approfondita di attività genica, rispetto alle iniezioni focali o elettroporazione. Con CVMI, più geni possono essere abbattuti contemporaneamente preparando iniezione miscele contenenti più Morpholinos oligonucleotide. CVMI può essere utilizzato per iniettare concentrazioni diverse di una data oligonucleotidi morfolino, e quindi può essere utilizzato per analizzare fenotipi hypomorphic. Infine, questo paradigma iniezione non provoca tossicità o comprometta la sopravvivenza degli animali. La tecnica CVMI potrebbe essere esteso per altri tipi di studi come l&#39;iniezione di peptidi modulatori, droghe, DNA plasmidico o modulatorio RNA molecules o altre sostanze che potrebbero influenzare la fisiologia delle cellule. Saggio combinazione di molecole e di effettuare analisi dose-risposta sono possibili utilizzando il nostro metodo, che consente lo studio fenotipi hypomorphic. Con queste proprietà, CVMI dimostra di essere un saggio rapido e facile per studi di espressione nel cervello adulto zebrafish, e apre screening rapido e analisi funzionali. Il cervello zebrafish adulto può costitutivamente produrre nuovi neuroni lungo l&#39;intero asse rostrocaudale e può anche rigenerarsi dopo lesioni traumatiche. Questo è in netto contrasto con il cervello dei mammiferi con neurogenesi limitato e se non del tutto, piuttosto scarsa capacità rigenerativa. Tale diffusa attività di cellule staminali e la capacità di recupero rende zebrafish un organismo modello utile per comprendere i programmi molecolari necessari per la rigenerazione del sistema nervoso centrale, che sono attualmente in gran parte sconosciute. Pertanto, indagare le basi molecolari della attitudine rigenerativa di zebrafish cervello è un interessante ambito di ricerca che potrebbe spiegare la differenza fondamentale come pesci e mammiferi cervello reagiscono dopo un infortunio, e di dotare anche strade per terapie mediche rigenerative in esseri umani. Per comprendere l&#39;infrastruttura molecolari della plasticità del cervello dei vertebrati e la rigenerazione, le cellule gliali servono come un&#39;area di ricerca importante come sono i progenitori neurogena 3,8,20. Così, usando la tecnica CVMI di alterare la funzione del gene nelle cellule gliali radiali del cervello zebrafish è strumentale a spiegare come il cervello dei pesci può paio attività progenitore di efficiente neurogenesi adulta e risposta rigenerativa. Recentemente abbiamo dimostrato il coinvolgimento e la necessità di diversi fattori e le vie di segnalazione nella risposta rigenerativa neurogenesi dell&#39;adulto zebrafish cervello 24,26,27, e questi studi sono stati resi possibili con l&#39;uso di metodo CVMI. Nel complesso, la conoscenza che acquisiamo da zebrafish cervello potrebbe essere sfruttata per imporre la rigenerazionecapacità figurativo alle cellule gliali mammiferi che reagiscono a lesioni e sarà quindi aiutare la progettazione di terapie cliniche per le malattie neurologiche umane e lesioni acute.

Neurogenesi adulta è un tratto comune a vertebrati, tuttavia il suo grado di diffusione e di efficienza varia con la filogenesi 1,2,3,4,5,6. Per esempio, il cervello dei mammiferi adulti sono presenti regioni di cellule staminali in gran parte limitato al prosencefalo 7,8, mentre il pesce zebra teleosteo contiene sedici diversi domini di cellule staminali e zone neurogena associati in tutto il suo cervello 4,5,9,10. Questa variazione tra mammiferi e zebrafish potrebbe riflettere una disparità nei meccanismi di mantenimento delle cellule staminali e la capacità neurogena delle cellule progenitrici. La competenza per tutta la vita di zebrafish per produrre neuroni nel cervello potrebbe anche comportare conseguenze cliniche, come i meccanismi molecolari impiegati da zebrafish cervello potrebbero essere sfruttate per applicazioni terapeutiche per affrontare le malattie neurodegenerative nell&#39;uomo. Diverse cellule staminali zone del cervello zebrafish adulto sono stati analizzati ed è stato dimostrato che ilcellule che rivestono la superficie ventricolare di quelle regioni fungono da cellule progenitrici 9,11-20. Analisi dettagliate nel telencefalo zebrafish, per esempio, hanno identificato le cellule gliali radiali, che delineano la superficie ventricolare di questa regione del cervello per essere progenitori neurogena 19, 20. Questo vale per le altre regioni, come il cervelletto e il tetto ottico, dove ventricularly-trova cellule neuroepiteliale forniscono l&#39;input neurogena 16,21. A tal fine, la comprensione dei meccanismi molecolari che regolano la diffusa competenza neurogena nel cervello adulto zebrafish richiede la manipolazione dell&#39;espressione genica nelle cellule progenitrici. Vari metodi sono stati descritti in precedenza per la funzione del gene modulante in zebrafish. Questi includono la generazione di linee transgeniche esprimenti varianti condizionali desiderati di una singola proteina, iniezioni focali plasmide basati accoppiati ad elettroporazione o trattamenti chimici. Abbiamo già progettato unmetodo per la somministrazione di varie sostanze tra cui morpholino oligonucleotidi o proteine ​​nel cervello zebrafish adulti usando microiniezione cerebroventricular come un modo rapido ed efficiente della funzione genica modulando nelle cellule ventricolari dell&#39;adulto zebrafish prosencefalo 22. Nei nostri studi, sono stati utilizzati in vivo Morpholinos causa della loro chimica coinvolge la molecola morfolino legato covalentemente ad arginina peptidi consegna ricche, che consentono consegna efficiente alle cellule di interesse, senza necessità di permeabilizzazione extra come elettroporazione 23. Ciò consentirebbe una Targeting approfondita del tessuto desiderato dopo l&#39;iniezione, proprio come quello che abbiamo osservato in zebrafish adulto telencefalo 22. L&#39;uso di Morpholinos vivo sono quindi superiore ai metodi già esistenti di tessuto di targeting come elettroporazione o iniezione focale di molecole di DNA. Qui, dimostriamo visivamente come eseguire questa operazione e di fornire unprotocollo step-by-step. Iniziamo con spiegare la preparazione della miscela di iniezione e il pesce da iniettare, e procedere dimostrando come l&#39;apparato di iniezione è impostato. Forniamo una descrizione del metodo di iniezione cerebroventricular, che comporta la generazione di una incisione nel cranio e l&#39;iniezione dei Morpholinos utilizzando microinjector. Noi elaboriamo anche sui punti critici si ha la necessità di essere prudenti durante l&#39;intera procedura da loro affermando come l&#39;ottimizzazione o guide risoluzione dei problemi.

<table border="1">
	<tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Reagent/Material</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CellTracker Red CMTPX</td>
 <td>Life Technologies, Invitrogen</td>
 <td>C34552</td>
 <td>Use at 1:100 dilution for measuring the injection accuracy</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MESAB (ethyl-m-aminobenzoate methanesulphonate)</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A5040</td>
 <td>For anesthetizing the fish</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Petri dishes</td>
 <td>Sarstedt</td>
 <td>821,472</td>
 <td>For handling the fish during injection and imaging</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Phosphate-buffered saline</td>
 <td>Life Technologies, GIBCO</td>
 <td>10010-056</td>
 <td>As sterile dilution medium</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vivo morpholinos</td>
 <td>Gene Tools Inc.</td>
 <td>Customized</td>
 <td>More info on vivo morpholinos: <a href="http://www.gene-tools.com" target="_blank">www.gene-tools.com</a></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Equipment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Barbed-end needle</td>
 <td>Becton-Dickinson</td>
 <td>305178</td>
 <td>To generate the incision in the skull</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dissecting microscope</td>
 <td>Olympus, Leica, Zeiss </td>
 <td>Varies with the manufacturer</td>
 <td>Part of the whole injection setup</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dumont Tweezers</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>501985</td>
 <td>To snap off the tip of the glass capillary</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fluorescence camera</td>
 <td>Zeiss, Nikon, Leica</td>
 <td>Varies with the manufacturer</td>
 <td>To visualize the fluorescence after injection</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gillies Dissecting Forceps</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>501265</td>
 <td>To hold the fish in position</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass injection capillaries</td>
 <td>World Precision Instruments </td>
 <td>TWF10 </td>
 <td>For microinjection</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PicoNozzle kit (microinjector holder)</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>5430-12</td>
 <td>For microinjection</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pneumatic PicoPump (microinjector)</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>SYS-PV820 </td>
 <td>For microinjection</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ring illuminator; Ring Light Guide</td>
 <td>Parkland Scientific</td>
 <td>ILL-RLG </td>
 <td>For illuminating the specimen</td>
 </tr>
	</tbody>
 </table>

micromanipulation of gene expression in the adult zebrafish brain using cerebroventricular microinjection of morpholino oligonucleotides

La manipolazione dell&#39;espressione genica nei tessuti è necessaria per eseguire studi funzionali. In questo lavoro, abbiamo dimostrato la tecnica cerebroventricular microiniezione (CVMI) come mezzo per modulare l&#39;espressione genica nel cervello zebrafish adulto. Utilizzando CVMI, le sostanze possono essere somministrate nel liquido cerebroventricular ed essere accuratamente distribuite lungo l&#39;asse rostrocaudale del cervello. In particolare, ci concentriamo su l&#39;uso di oligonucleotidi antisenso morpholino, che sono potenti strumenti per abbattere l&#39;espressione genica in vivo. Nel nostro metodo, quando applicato, molecole morpholino vengono assorbiti dalle cellule che rivestono la superficie ventricolare. Queste cellule sono le cellule gliali radiali, che fungono da progenitori neurogena. Pertanto, abbattendo l&#39;espressione genica nelle cellule gliali radiali è della massima importanza per analizzare la risposta di neurogenesi diffusa in zebrafish, e inoltre avrebbe fornito indizi su come i vertebrati potrebbero sostenere Neurogen adultorisposta ESIS. Tale comprensione aiuterebbe anche gli sforzi per le applicazioni cliniche in patologie neurodegenerative umane e la rigenerazione del sistema nervoso centrale. Così, vi presentiamo il metodo di microiniezione cerebroventricular come un modo rapido ed efficace per alterare l&#39;espressione genica e la risposta neurogenesi nel cervello anteriore zebrafish adulto. Forniamo anche la risoluzione dei problemi e altre informazioni utili su come effettuare la procedura CVMI.

Microiniezione Cerebroventricular porta ad un&#39;ampia distribuzione della soluzione iniettata Utilizzando lo schema di flusso di lavoro e tecnica della microiniezione cerebroventricular illustrato nella figura 1, abbiamo somministrato morfolino oligonucleotidi nel cervello zebrafish adulto. Un protocollo di iniezione accurato fa disperdere il liquido iniettato in tutto il cervello ed efficiente il targeting delle cellule vicine alla superficie ventricolare (Figura 2A). Iniezioni dove il vetro capillare infilza il tessuto cerebrale avrà un segnale fluorescente denso nel punto di iniezione (Figura 2B). Se la quantità iniettata non è sufficiente, si osserverà segnale fluorescente debole (Figura 2C). Microiniezione Cerebroventricular può essere utilizzato per abbattere l&#39;espressione genica a regione ventricolare del cervello adulto zebrafish Abbiamo dimostrato thin vivo Morpholinos può penetrare alcuni diametri delle celle all&#39;interno della superficie ventricolare e quindi può efficientemente bersaglio le cellule ventricolari (Figure 3A, 3B). Iniezione morfolino can espressione genica smontabile come allevierà la produzione della proteina corrispondente (un esempio è PCNA come mostrato nelle figure 3C, 3D). Abbiamo precedentemente dimostrato che abbattendo i geni che utilizzano questa tecnica porta a conseguenze funzionali durante la neurogenesi adulta (figure 3E, 3F) o di risposta rigenerazione (Figure 3G, 3H). Abbiamo dimostrato che la gamma knockdown efficiente (più del 50% atterramento) viene raggiunto approssimativamente 12 ore dopo l&#39;iniezione del Morpholinos 22. Abbiamo anche osservato che il periodo atterramento efficiente è fino a circa 5 giorni dopo l&#39;iniezione per la proteina PCNA 22. Più del 70% knockdown era visto entro 3 giorni dopo l&#39;iniezione 22. Le curve knockdown sono dipendenti on il livello di espressione delle proteine ​​endogene e l&#39;efficienza delle molecole morfolino, e deve essere determinato per ogni gene dallo sperimentatore. Nei nostri studi, non abbiamo visto che la procedura CVMI compromette la sopravvivenza dell&#39;animale, probabilmente perché l&#39;amministrazione delle molecole morpholino è locale e non provoca una tossicità sistemica. <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50415/50415fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50415/50415fig1.jpg" /> Figura 1. Rappresentazione schematica della tecnica di iniezione cerebroventricular. (A) L&#39;iniezione è eseguita dalla dorsale del zebrafish adulti (1) a livello del tetto ottico (ot, 2). L&#39;incisione viene fatta sulla piastra cranio tectal ottica con un ago da 30 gauge (3). Usando vetro capillari, le molecole morpholino sono iniettati nel liquido ventricolare (4). Una dispersione è una approfonditachieved istantaneamente (5). (B) La cannula ed il suo spinato-end è mostrato in alto ingrandimento. (C) La posizione del l&#39;ago prima dell&#39;incisione. (D) L&#39;incisione viene cerchiato e delineato da linee tratteggiate. (E) L&#39;iniezione capillare si trova come mostrato e viene eseguita l&#39;iniezione. Tutti i pannelli sono stati adattati dal rif. 22. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50415/50415fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/50415/50415fig2.jpg" /> Figura 2. Confronto di efficienza dell&#39;iniezione e precisione. (A) Una buona iniezione conduce il targeting delle cellule vicine alla superficie ventricolare. (B) Se il vetro capillare viene inserito nel tessuto cerebrale, questo genererà un segnale di fluorescenza in posizione centrale. (C </strong&gt;) Se la quantità di iniezione è basso, questo porterà a segnale di fluorescenza debole. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50415/50415fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50415/50415fig3.jpg" /> Figura 3. . Morpholino penetrazione, l&#39;efficienza di atterramenti geniche e le conseguenze funzionali (A) GFP immunoistochimica sulle sezioni trasversali telencefalici di controllo morpholino-iniettati Tg (H2A: GFP) linea transgenica che mostra nuclei GFP-positive. (B) GFP immunoistochimica sulle sezioni trasversali telencefalici di GFP antisenso morpholino-iniettato Tg (H2A: GFP) linea transgenica che mostra nuclei GFP-positive. Notare la differenza nel segnale-GFP in corrispondenza della zona ventricolare. v: ventricolo. (C) PCNA immunoistochimica sul controllo morpholino-iniettato cervello mostrano capillare distribuzione delle cellule PCNA-positivi. ( <strong&gt; D) PCNA immunoistochimica su PCNA antisenso cervelli morpholino-iniettati mostrano significativamente ridotte quantità di cellule PCNA-positivi, dimostrando che CVMI can geni endogeni atterramento. (E) BrdU e Huc / D immunoistochimica sul controllo morpholino-iniettati cervello per determinare nuovi neuroni dopo un esperimento di BrdU pulse-chase descritto prima del 22. (F) BrdU e Huc / D immunoistochimica su PCNA antisenso cervelli morpholino-iniettati per determinare nuovi neuroni dopo un esperimento di BrdU pulse-chase descritto prima del 22. (G) abbattitura giù PCNA porta alla riduzione significativa generazione di neuroni neonati, indicando che CVMI può essere utilizzato per geni endogeni knockdown, che danno luogo a conseguenze funzionali. Tutti i pannelli sono stati adattati dal rif. 22 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50415/50415fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> .

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Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides

In questo articolo, abbiamo dimostrato un metodo per la manipolazione dell&#39;espressione genica nelle cellule ventricolari del telencefalo zebrafish adulto utilizzando oligonucleotidi antisenso morpholino. Presentiamo questo metodo come protocollo efficiente e rapido che può essere utilizzato per studi funzionali nel cervello dei vertebrati adulto.

Micromanipolazione di espressione genica in Zebrafish adulti cervello con microiniezione Cerebroventricular di Morpholino oligonucleotidi

Manipulation of gene expression in tissues is  required to perform functional studies. In this paper, we demonstrate the  cerebroventricular ...

micromanipulation-gene-expression-adult-zebrafish-brain-using

Research

JoVE Journal

Neuroscience

19.1K Views.  Cluster of Excellence (CRTD) and Biotechnology Center (BIOTEC) of the Technische Universität Dresden. In questo articolo, abbiamo dimostrato un metodo per la manipolazione dell'espressione genica nelle cellule ventricolari del telencefalo zebrafish adulto utilizzando oligonucleotidi antisenso morpholino. Presentiamo questo metodo come protocollo efficiente e rapido che può essere utilizzato per studi funzionali nel cervello dei vertebrati adulto.

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Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate a method to fabricate suction electrodes that are used to examine CPG activity, or fictive locomotion, in dissected rodent spinal cords. The rodent spinal cords are placed in artificial cerebrospinal fluid and the ventral roots are drawn into the suction electrode. The electrode is constructed by modifying a commercially available suction electrode. A heavier silver wire is used instead of the standard wire given by the commercially available electrode. The glass tip on the commercial electrode is replaced with a plastic tip for increased durability. We prepare hand drawn electrodes and electrodes made from specific sizes of tubing, allowing consistency and reproducibility. Data is collected using an amplifier and neurogram acquisition software. Recordings are performed on an air table within a Faraday cage to prevent mechanical and electrical interference, respectively.

A demonstration of the fabrication and use of an extracellular suction electrode used to measure electrophysiological recordings of neonatal rodent spinal cords in vitro

Spinal Cord Elettrofisiologia II: extracellulare fabbricazione di elettrodi di aspirazione

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

Ricerca

Neuroscienze

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central nervous system (CNS). Although much is known about the molecular mechanisms that pattern the spinal cord and elicit neuronal differentiation1, 2, we lack a deep understanding of these early events at the level of cell behavior. It is thus critical to study the behavior of neural progenitors in real time as they undergo neurogenesis.
In the past, real-time imaging of early embryonic tissue has been limited by cell/tissue viability in culture as well as the phototoxic effects of fluorescent imaging. Here we present a novel assay for imaging such tissue for long periods of time, utilizing a novel ex vivo slice culture protocol and wide-field fluorescence microscopy (Fig. 1). This approach achieves long-term time-lapse monitoring of chick embryonic spinal cord progenitor cells with high spatial and temporal resolution.
This assay may be modified to image a range of embryonic tissues3, 4 In addition to the observation of cellular and sub-cellular behaviors, the development of novel and highly sensitive reporters for gene activity (for example, Notch signaling5) makes this assay a powerful tool with which to understand how signaling regulates cell behavior during embryonic development.

Imaging embryonic tissue in real-time is challenging over long periods of time. Here we present an assay for monitoring cellular and sub-cellular changes in chick spinal cord for long periods with high spatial and temporal resolution. This technique can be adapted for other regions of the nervous system and developing embryo.

Imaging ad alta risoluzione dal vivo del comportamento delle cellule in via di sviluppo neuroepitelio

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

Optimized Analysis of DNA Methylation and Gene Expression from Small, Anatomically-defined Areas of the Brain

Exposure to diet, drugs and early life adversity during sensitive windows of life 1,2 can lead to lasting changes in gene expression that contribute to the display of physiological and behavioural phenotypes. Such environmental programming is likely to increase the susceptibility to metabolic, cardiovascular and mental diseases 3,4.
DNA methylation and histone modifications are considered key processes in the mediation of the gene-environment dialogue and appear also to underlay environmental programming 5. In mammals, DNA methylation typically comprises the covalent addition of a methyl group at the 5-position of cytosine within the context of CpG dinucleotides.
CpG methylation occurs in a highly tissue- and cell-specific manner making it a challenge to study discrete, small regions of the brain where cellular heterogeneity is high and tissue quantity limited. Moreover, because gene expression and methylation are closely linked events, increased value can be gained by comparing both parameters in the same sample.
Here, a step-by-step protocol (Figure 1) for the investigation of epigenetic programming in the brain is presented using the 'maternal separation' paradigm of early life adversity for illustrative purposes. The protocol describes the preparation of micropunches from differentially-aged mouse brains from which DNA and RNA can be simultaneously isolated, thus allowing DNA methylation and gene expression analyses in the same sample.

A streamlined workflow to study DNA methylation and gene expression changes upon early-life stress is shown. Starting from maternal separation of newborn mice and isolation of discrete brain tissues, we represent a protocol to simultaneously isolate DNA and RNA from brain tissue punches for subsequent bisulfite sequencing and RT-PCR analysis.

Ottimizzato Analisi della metilazione del DNA e l&#39;espressione genica da piccole aree anatomicamente definiti del cervello

Exposure to diet, drugs and early life adversity during sensitive windows of life 1,2 can lead to lasting changes in gene expression that contribute to ...

Electrophysiological Recording in the Brain of Intact Adult Zebrafish

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram recordings. This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments, allowing recording of neural activity. Immobilization of the adult requires a mechanism to deliver dissolved oxygen to the gills in lieu of buccal and opercular movement. With our technique, animals are immobilized and perfused with habitat water to fulfill this requirement. A craniotomy is performed under tricaine methanesulfonate (MS-222; tricaine) anesthesia to provide access to the brain. The primary electrode is then positioned within the craniotomy window to record extracellular brain activity. Through the use of a multitube perfusion system, a variety of pharmacological compounds can be administered to the adult fish and any alterations in the neural activity can be observed. The methodology not only allows for observations to be made regarding changes in neurological activity, but it also allows for comparisons to be made between larval and adult zebrafish. This gives researchers the ability to identify the alterations in neurological activity due to the introduction of various compounds at different life stages.

This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments to allow recordings and manipulation of neural activity in an intact animal.

Registrazione elettrofisiologica nel cervello di intatto Zebrafish adulti

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram ...

Analysis of Gene Expression Changes in the Rat Hippocampus After Deep Brain Stimulation of the Anterior Thalamic Nucleus

Deep brain stimulation (DBS) surgery, targeting various regions of the brain such as the basal ganglia, thalamus, and subthalamic regions, is an effective treatment for several movement disorders that have failed to respond to medication. Recent progress in the field of DBS surgery has begun to extend the application of this surgical technique to other conditions as diverse as morbid obesity, depression and obsessive compulsive disorder. Despite these expanding indications, little is known about the underlying physiological mechanisms that facilitate the beneficial effects of DBS surgery. One approach to this question is to perform gene expression analysis in neurons that receive the electrical stimulation. Previous studies have shown that neurogenesis in the rat dentate gyrus is elicited in DBS targeting of the anterior nucleus of the thalamus1. DBS surgery targeting the ATN is used widely for treatment refractory epilepsy. It is thus of much interest for us to explore the transcriptional changes induced by electrically stimulating the ATN. In this manuscript, we describe our methodologies for stereotactically-guided DBS surgery targeting the ATN in adult male Wistar rats. We also discuss the subsequent steps for tissue dissection, RNA isolation, cDNA preparation and quantitative RT-PCR for measuring gene expression changes. This method could be applied and modified for stimulating the basal ganglia and other regions of the brain commonly clinically targeted. The gene expression study described here assumes a candidate target gene approach for discovering molecular players that could be directing the mechanism for DBS.

The mechanism underlying the therapeutic effects of Deep Brain Stimulation (DBS) surgery needs investigation. The methods presented in this manuscript describe an experimental approach to examine the cellular events triggered by DBS by analyzing the gene expression profile of candidate genes that can facilitate neurogenesis post DBS surgery.

Analisi delle variazioni di espressione genica nel Rat Hippocampus Dopo stimolazione cerebrale profonda del nucleo anteriore talamiche

Deep brain stimulation (DBS) surgery, targeting various regions of the brain such as the basal ganglia, thalamus, and subthalamic regions, is an effective ...

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant cell type in the brain, neurons are the most widely studied of these cell types given their direct role in impacting behaviors. Other cell types in the brain also impact neuronal function and behavior via the signaling molecules they produce. Neuroscientists must understand the interactions between the cell types in the brain to better understand how these interactions impact neural function and disease. To date, the most common method of analyzing protein or gene expression utilizes the homogenization of whole tissue samples, usually with blood, and without regard for cell type. This approach is an informative approach for examining general changes in gene or protein expression that may influence neural function and behavior; however, this method of analysis does not lend itself to a greater understanding of cell-type-specific gene expression and the effect of cell-to-cell communication on neural function. Analysis of behavioral epigenetics has been an area of growing focus which examines how modifications of the deoxyribonucleic acid (DNA) structure impact long-term gene expression and behavior; however, this information may only be relevant if analyzed in a cell-type-specific manner given the differential lineage and thus epigenetic markers that may be present on certain genes of individual neural cell types. The Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) technique described below provides a simple and effective way to isolate individual neural cells for the subsequent analysis of gene expression, protein expression, or epigenetic modifications of DNA. This technique can also be modified to isolate more specific neural cell types in the brain for subsequent cell-type-specific analysis.

The goal of this protocol is to use the fluorescence activated cell sorting (FACS) technique to sort specific types of neural cells for subsequent analysis of cell-type-specific gene expression, epigenetic markers, and or protein expression.

Usando fluorescenza cellulare attivo Ordinamento per esaminare Cell-Type-specifica espressione genica nel cervello di ratto tessuto

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

Modeling Amyloid-&#946;42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain

Alzheimer's disease (AD) is a debilitating neurodegenerative disease in which accumulation of toxic amyloid-&#946;42 (A&#946;42) peptides leads to synaptic degeneration, inflammation, neuronal death, and learning deficits. Humans cannot regenerate lost neurons in the case of AD in part due to impaired proliferative capacity of the neural stem/progenitor cells (NSPCs) and reduced neurogenesis. Therefore, efficient regenerative therapies should also enhance the proliferation and neurogenic capacity of NSPCs. Zebrafish (Danio rerio) is a regenerative organism, and we can learn the basic molecular programs with which we could design therapeutic approaches to tackle AD. For this reason, the generation of an AD-like model in zebrafish was necessary. Using our methodology, we can introduce synthetic derivatives of A&#946;42 peptide with tissue penetrating capability into the adult zebrafish brain, and analyze the disease pathology and the regenerative response. The advantage over the existing methods or animal models is that zebrafish can teach us how a vertebrate brain can naturally regenerate, and thus help us to treat human neurodegenerative diseases better by targeting endogenous NSPCs. Therefore, the amyloid-toxicity model established in the adult zebrafish brain may open new avenues for research in the field of neuroscience and clinical medicine. Additionally, the simple execution of this method allows for cost-effective and efficient experimental assessment. This manuscript describes the synthesis and injection of A&#946;42 peptides into zebrafish brain.

Modeling Amyloid-&amp;#946;42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain

This protocol describes the synthesis, characterization, and injection of monomeric amyloid-&#946;42 peptides for generating amyloid toxicity in adult zebrafish to establish an Alzheimer&#39;s disease model, followed by histological analyses and detection of aggregations.

Modellazione dell'amiloide-β42 tossicità e neurodegenerazione nel cervello adulto di Zebrafish

Alzheimer's disease (AD) is a debilitating neurodegenerative disease in which accumulation of toxic amyloid-&#946;42 (A&#946;42) peptides leads to ...

In Vivo Monitoring of Circadian Clock Gene Expression in the Mouse Suprachiasmatic Nucleus Using Fluorescence Reporters

This technique combines optical fiber mediated fluorescence recordings with the precise delivery of recombinant adeno-associated virus based gene reporters. This new and easy to use in vivo fluorescence monitoring system was developed to record the transcriptional rhythm of the clock gene, Cry1, in the suprachiasmatic nucleus (SCN) of freely moving mice. To do so, a Cry1 transcription fluorescence reporter was designed and packaged into Adeno-associated virus. Purified, concentrated virus was injected into the mouse SCN followed by the insertion of an optic fiber, which was then fixed onto the surface of the brain. The animals were returned to their home cages and allowed a 1-month post-operative recovery period to ensure sufficient reporter expression. Fluorescence was then recorded in freely moving mice via an in vivo monitoring system that was constructed at our institution. For the in vivo recording system, a 488 nm laser was coupled with a 1 &#215; 4 beam-splitter that divided the light into four laser excitation outputs of equal power. This setup enabled us to record from four animals simultaneously. Each of the emitted fluorescence signals was collected via a photomultiplier tube and a data acquisition card. In contrast to the previous bioluminescence in vivo circadian clock recording technique, this fluorescence in vivo recording system allowed the recording of circadian clock gene expression during the light cycle.

In Vivo Monitoring of Circadian Clock Gene Expression in the Mouse Suprachiasmatic Nucleus Using Fluorescence Reporters

This newly developed fluorescence-based technology enables long-term monitoring of the transcription of circadian clock genes in the suprachiasmatic nucleus (SCN) of freely moving mice in real-time and at a high temporal resolution.

In Vivo Monitoraggio dell'espressione genica orologio circadiano nel nucleo soprachiasmatico Mouse mediante fluorescenza reporter

This technique combines optical fiber mediated fluorescence recordings with the precise delivery of recombinant adeno-associated virus based gene ...

Using Near-infrared Fluorescence and High-resolution Scanning to Measure Protein Expression in the Rodent Brain

Neuroscience is the study of how cells in the brain mediate various functions. Measuring protein expression in neurons and glia is critical for the study of neuroscience as cellular function is determined by the composition and activity of cellular proteins. In this article, we describe how immunocytochemistry can be combined with near-infrared high-resolution scanning to provide a semi-quantitative measure of protein expression in distinct brain regions. This technique can be used for single or double protein expression in the same brain region. Measuring proteins in this fashion can be used to obtain a relative change in protein expression with an experimental manipulation, molecular signature of learning and memory, activity in molecular pathways, and neural activity in multiple brain regions. Using the correct proteins and statistical analysis, functional connectivity among brain regions can be determined as well. Given the ease of implementing immunocytochemistry in a laboratory, using immunocytochemistry with near-infrared high-resolution scanning can expand the ability of the neuroscientist to examine neurobiological processes at a systems level.

Here, we present a protocol that uses near-infrared dyes in conjunction with immunohistochemistry and high-resolution scanning to assay proteins in brain regions.

Utilizzo della fluorescenza Near-Infrared e scansione ad alta risoluzione per misurare l'espressione proteica nel cervello del roditore

Neuroscience is the study of how cells in the brain mediate various functions. Measuring protein expression in neurons and glia is critical for the study ...

Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from parallel fibers (PF) to Purkinje cells (PC) is considered the basis for motor learning, and deficiencies of both LTD and motor learning are observed in various gene-manipulated animals. Common motor learning sets, such as adaptation of the optokinetic reflex (OKR), the vestibular-ocular reflex (VOR), and rotarod test were used for evaluation of motor learning ability. However, results obtained from the GluA2-carboxy terminus modified knock-in mice demonstrated normal adaptation of the VOR and the OKR, despite lacking PF-LTD. In that report, induction of LTD was only attempted using one type of stimulation protocol at room temperature. Thus, conditions to induce cerebellar LTD were explored in the same knock-in mutants using various protocols at near physiological temperature. Finally, we found stimulation protocols, by which LTD could be induced in these gene-manipulated mice. In this study, a set of protocols are proposed to evaluate LTD-induction, which will more accurately allow examination of the causal relationship between LTD and motor learning. In conclusion, experimental conditions are crucial when evaluating LTD in gene-manipulated mice.

In some gene-manipulated animals, using a single protocol may fail to induce LTD in cerebellar Purkinje cells, and there may be a discrepancy between LTD and motor learning. Multiple protocols are necessary to assess LTD-induction in gene-manipulated animals. Standard protocols are shown.

Valutazione dell'induzione della depressione a lungo termine nelle fette di cerebellar adulto

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from ...