Finanziamento al Dott. Thornton dalla Pfizer Limited è riconosciuto con gratitudine.

1. Raccolta, conservazione e preparazione dei liquidi di lavaggio broncoalveolare di siero e <ol><li> Raccogliere siero da campioni di sangue non trattati consentendo coagulazione a 4 ° C, e siero negozio come aliquote a -20 ° C prima dell&#39;uso. Liquidi di lavaggio broncoalveolare (BAL) dovrebbero essere memorizzati come aliquote a -20 ° C. Nota: Stoccaggio di siero e BAL come aliquote limita il potenziale di degradazione della antigene bersaglio da ripetuti di congelamento-scongelamento dei campioni durante la ripetizione del test. </li><li> Scongelare i campioni e mescolare i campioni di siero e BAL accuratamente su vortex e centrifugare per 1 min a 14.000 rpm. </li><li> Per le prove di routine di campioni di siero umano, diluire il siero 1:01 (v / v) con mezzo di coltura tissutale (TCM). TCM consiste di mezzo RPMI-1640, 10% (v / v) di siero fetale bovino, 1% (v / v) di 200 mM L-glutammina soluzione, e sodio azide (0,02% w / v) come conservante. Il terreno è preparato in anticipo e può essere conservato a 4 ° C per diversi mesi. Applicare 100 microlitri della diluted il siero LFD. </li><li> Per fluidi umani BAL, e per i fluidi di BAL modelli animali, si applicano 100 microlitri di campione puro al LFD, senza alcun pre-trattamento. </li><li> Per il siero da modelli animali, diluire siero 1:2 (v / v) con soluzione salina tamponata con fosfato contenente il 4% (w / v) EDTA, calore per 3 minuti in un bagno di acqua bollente, centrifugare per 5 min a 14.000 rpm, e applicare 100 ul di surnatante pulito al dispositivo LFD. </li></ol> 2. Applicazione di siero e BAL al dispositivo a flusso laterale <ol><li> Conservare il flusso laterale dispositivi a temperatura ambiente (23 ° C). A questa temperatura, dispositivi sono stabili per 12 mesi. Rimuovere i dispositivi dalle loro tasche e posto su una superficie piana. </li><li> Utilizzando una punta di pipetta sterile, applicare 100 pl di pretrattato campione di siero o pulito BAL alla porta di uscita del dispositivo. </li><li> Lasciare il saggio a funzionare per 15 min a temperatura ambiente, momento in cui i risultati delle prove devono essere registrati. Nota: In pochi secondi il liquido sarà seen migrare per capillarità lungo la membrana di nitrocellulosa nella finestra di osservazione. </li></ol> 3. Registrazione ed interpretare i risultati LFD <ol><li> La LFD consiste di una linea di controllo interno (indicato con la lettera C sul contenitore in plastica) e una linea di test (indicata con la lettera T). La linea di controllo deve sempre apparire a prescindere di antigene Aspergillus nel campione di siero o BAL. Questo dimostra che il test è stato eseguito correttamente. </li><li> Se l&#39;antigene Aspergillus è presente nel campione di siero o BAL, la linea di test appariranno anche entro 15 minuti di applicazione del campione. Poiché l&#39;intensità della linea di test è proporzionale alla quantità di antigene presente nel campione Aspergillus, la linea di test può apparire come una debole positivo (+), un moderato positivo (+ +) o come un forte positivo (+ + +) . Tuttavia, qualsiasi linea test positivo, indipendentemente intensità, che indicano la presenza di Aspergillus antigene nel campione. In the l&#39;assenza di antigene Aspergillus, nessuna linea di test apparirà, e il risultato è registrato come negativo (-). </li></ol> 4. Risultati rappresentativi Esempi rappresentativi di negativo, debolmente positivi, moderatamente positivi risultati positivi, e forte LFD con campioni di BAL e siero sono mostrati nella Figura 1. I risultati di antigene prove positive di LFD (debole e forte) o negativi test LFD che utilizza fluidi BAL da leucemia mieloide acuta (AML) pazienti diagnosticati secondo EORTC / MSG criteri diagnostici sono riportati nella Tabella 1. Incluso in questa tabella sono i corrispondenti clinici e micologica (galattomannano e cultura) i dati ei risultati di un test specifico Aspergillus-PCR sviluppato presso Ospedale S. Bartolomeo 8, per ogni paziente. La diagnosi della malattia è basata su fattori dell&#39;ospite (neutropenia, l&#39;uso prolungato di corticosteroidi, il trattamento con altri riconosciuti cellule T immunosuppressants), i criteri clinici e positività GM per il BAL (qui definito come un valore di indice GM&gt; 0,8). Sotto i 2002 EORTC / MSG linee 10, 12 pazienti, 13 e 16 sono stati diagnosticati con IA &#39;possibile&#39; sulla base di fattori dell&#39;ospite e dei criteri clinici o positività GM. Secondo le riviste (2008) EORTC / MSG linee 2, i fattori di accoglienza e positività GM da soli o host fattori e dei criteri clinici da soli non indicherebbe l&#39;infezione &#39;possibile&#39; fungina invasiva se non accompagnati da documenti giustificativi da dati clinici e micologia, rispettivamente. Paziente 6 è stato diagnosticato un IA &#39;probabile&#39; in entrambi i 2002 e il 2008 le linee guida a causa di fattori dell&#39;ospite, le caratteristiche cliniche principali e secondarie e positività GM. Si noti che, mentre né il LFD né saggi di PCR sono attualmente inclusi nelle linee guida EORTC / MSG, esiste un accordo forte tra i due test e il test commerciale galattomannano che indicano la presenza di antigeni di Aspergillus e di acido nucleico nel campione BAL<html> s di pazienti 6 e 12. Ulteriori risultati delle prove dimostrano l&#39;efficacia dei saggi PCR LFD e nella diagnosi di IPA si possono trovare in Johnson et al 8. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3721/3721fig1.jpg" /> Figura 1. Negativo (linea di controllo solo) e positivo (linea di controllo e di prova) i risultati delle prove LFD utilizzando siero e nel BAL. Le intensità di reazioni di linea dei test sono proporzionali alle concentrazioni dell&#39;antigene bersaglio nei campioni di siero e BAL. Le reazioni in genere varia da debole (+) attraverso moderata (+ +) a forte (+ + +). Indipendentemente intensità prova linea, tutte tre le reazioni di siero positivi indicherebbe invasiva aspergillosi malattia polmonare dovuta alla presenza di antigene Aspergillus circolante nel sangue. Positive le reazioni BAL (debole, moderata o forte) sta ad indicare la germinazione delle spore e lo sviluppo di ife potenzialmente patogeni nei polmoni. pdflinebreak &quot;&gt; <table border="1"><tbody><tr><td> Paziente no. </td><td> Patient informazioni </td><td> Criteri clinici 1 </td><td> BAL cultura 2 </td><td> GM VIA indice 3 </td><td> EORTC / MSG (2002) 4 </td><td> EORTC / MSG (2008) 5 </td><td> Aspergillus PCR risultato </td><td> Risultato LFD </td></tr><tr><td> 6 </td><td> - </td><td> Principali segni CT (nodulo e halo) e una minore </td><td> Negativo </td><td> 0,9 (positivo) </td><td> Probabile </td><td> Probabile </td><td> Positivo </td><td> Debolmente positivo (+) </td></tr><tr><td> 12 </td><td> Presunto precedente infezione fungina </td><td> No major, minor uno </td><td> Candida glabrata </td><td> 6,43 (molto positive) </td><td> Possibile </td><td> Nessuno </td><td> Positivo </td><td> Strong positivo (+ + +) </td></tr><tr><td> 13 </td><td> Stafilococco coagulasi-negativiylococcus e E. coli nel sangue </td><td> No major, minor due </td><td> Negativo </td><td> 0,25 (negativo) </td><td> Possibile </td><td> Nessuno </td><td> Negativo </td><td> Negativo (-) </td></tr><tr><td> 16 </td><td> Infezioni del torace </td><td> 3 criteri minori tra nuova effusione plurale infiltrato più </td><td> Negativo </td><td> 0,16 (negativo) </td><td> Possibile </td><td> Nessuno </td><td> Negativo </td><td> Negativo (-) </td></tr></tbody></table> 1 noduli o aloni su una tomografia computerizzata di scansione è suggestivo di infezione fungina 2 Candida glabrata nel BAL verrebbe considerato come contaminante in quanto è la seconda più comune lievito isolato come parte della normale flora umani 9 3 Un indice di&gt; 0,8 nel test GM VIA del BAL è indicativa di infezione da Aspergillus 4 Sulla base dei 2002 EORTC / MSG criteri diagnostici per la &#39;possible &#39;,&#39; probabilmente &#39;o&#39; provata &#39;malattia fungina invasiva 10 5 Sulla base delle riviste (2008) EORTC / MSG criteri diagnostici per la &#39;possibile&#39;, &#39;probabile&#39; o &#39;provata&#39; la malattia fungina invasiva 2 Tabella 1. Risultati delle prove LFD di campioni di BAL da pazienti affetti da leucemia mieloide acuta con IPA probabile e dal controllo di pazienti con LMA (nessuna evidenza di infezione), e EORTC / MSG diagnosi di infezione.

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Non abbiamo nulla da rivelare.

L&#39;identificazione definitiva di IPA può realmente essere raggiunti mediante isolamento dell&#39;agente eziologico da campioni bioptici, ma il recupero di campioni adeguati spesso non è possibile in pazienti molto malati e Aspergillus è raramente recuperabile dal sangue. Mentre grandi progressi sono stati fatti nell&#39;uso di scansione tomografica computerizzata del torace nella diagnosi IPA, caratteristiche che sono indicativi di IPA polmonare come il &quot;alone&quot; o &quot;mezzaluna&quot; air-segni sono transiente o può essere attribuito ad artefatti respirazione o di altre infezioni fungine 11,12. Tali dati sono quindi integrati con le tecniche sierologiche che mirano a identificare le molecole di firma (GM e β-glucano) da funghi che circolano nel siero del paziente o che sono presenti nei fluidi BAL, espettorato o 13 campioni di urina. Mentre questi test visualizzare sensibilità soddisfacente, mancano di specificità sufficiente o soffrono di interferenze determinate condizioni, 1,6 </sup&gt;. Il test per la rilevazione di IPA LFD qui presentato permette di diagnosticare il &#39;point-of-care&#39; della tecnologia IPA ed exploit che è stato utilizzato fino ad oggi nel test per la ricerca di virus, batteri, parassiti e tossine e 14-19, il più famoso, per il test di gravidanza a casa prima introdotto da Unipath nel 1988. Nella LFD Aspergillus qui descritto, l&#39;Aspergillus-specifico MAb JF5 è immobilizzato a una zona di cattura (linea del test) su una membrana di nitrocellulosa porosa. Immunoglobulina anti-topo immobilizzato alla membrana in una zona separata servito come controllo interno (linea di controllo). In aggiunta di siero o liquido BAL alla porta di rilascio, MAb JF5-coniugato di oro colloidale nel supporto di rilascio lega l&#39;antigene bersaglio e il complesso passa poi lungo la membrana porosa per azione capillare. MAb JF5 immobilizzato nella zona di cattura si lega alla JF5-oro colloidale-antigene complesso risultante in una linea di test rossa. Qualsiasi JF5-oro colloidale non legatoconiugato si lega al controllo interno, che indica che il test è stato eseguito correttamente. Ciò si traduce in una linea di controllo rossa. Il test è rapido, tenuto a soli 15 minuti per eseguire, è a buon mercato rispetto ai test di siero e BAL a base di GM e β-glucano di rilevamento, e non richiede costose attrezzature o strutture di laboratorio, per l&#39;esecuzione. Inoltre, MAb JF5 non cross-reagiscono con i farmaci o agenti inquinanti che sono stati indicati per causare falso positivo di reazione in GM e β-glucano test 1,4,6. Un ulteriore vantaggio importante rispetto agli attuali test diagnostici è la capacità di rilevare LFDs attività che è indicativo della crescita invasiva delle specie di Aspergillus. Un punto critico del procedimento LFD è la necessità di leggere i risultati 15 min dopo l&#39;applicazione del campione di siero o BAL al dispositivo. Il test non deve essere lasciato per più di 15 minuti prima di registrare i risultati, in quanto questo risultato interpretati polarizzazione puòsul. Una reazione debole non sarà rafforzata, estendendo il periodo di incubazione. Il trattamento termico di siero di modelli animali di infezione è stato trovato per migliorare la sensibilità del saggio. Una limitazione del test è che è qualitativa, e si affida al gestore di effettuare una valutazione soggettiva di positività. L&#39;intensità della linea di test varia a seconda del contenuto antigene di campioni di siero e BAL (Figura 1). Tuttavia, qualsiasi reazione positiva (determinata rispetto ai negativi noti) indica la presenza di antigene Aspergillus e quindi l&#39;infezione. Per limitare la soggettività di saggi LFD, dispositivi palmari sono disponibili che consentono la quantificazione delle intensità LFD linea del test e consentire la fissazione di valori soglia per il rilevamento dell&#39;antigene 20. Gli sviluppi futuri della direttiva sulle discariche sono la sua commercializzazione e lo sviluppo di un LFD multiplex che permette la rilevazione simultanea di altri agenti patogeni fungine invasiveanticorpi monoclonali altamente specifici utilizzando 3.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> Aspergillus LFD </td><td> Università di Exeter </td><td></td><td> Disponibile presso l&#39;autore corrispondente su richiesta </td></tr><tr><td> RPMI-1640 </td><td> Sigma </td><td> R0883 </td><td></td></tr><tr><td> L-Glutammina </td><td> Sigma </td><td> G7513 </td><td></td></tr><tr><td> Siero fetale di vitello </td><td> Biosera </td><td> S9100 </td><td> Altre fonti di siero di vitello fetale possono essere utilizzati nella preparazione di TCM </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Fisher Scientific </td><td> BPE120-1 </td><td></td></tr></tbody></table>

detection of invasive pulmonary aspergillosis in haematological malignancy patients by using lateral-flow technology

L&#39;aspergillosi polmonare invasiva (IPA) è una delle principali cause di morbilità e mortalità nei pazienti con neoplasie ematologiche e staminali ematopoietiche riceventi trapianto di cellule 1. Rilevamento di IPA rappresenta una sfida formidabile diagnostica e, in assenza di un &#39;gold standard&#39;, si basa su una combinazione di dati clinici e di microbiologia e istopatologia, ove possibile. La diagnosi di IPA devono essere conformi alla Organizzazione Europea per la Ricerca e la Cura del Cancro e l&#39;Istituto Nazionale di Allergologia e Malattie Infettive Micologia Study Group (EORTC / MSG) la definizione di un consenso &quot;provato&quot;, &quot;probabile&quot;, e &quot;possibile&quot; malattie fungine invasive 2 . Attualmente, non a base di acido nucleico prove sono state esternamente convalidato di rilevazione IPA e quindi la reazione a catena della polimerasi (PCR) non è incluso nelle attuali EORTC / MSG criteri diagnostici. Identificazione di Aspergillus in sezioni istologiche è problematico a causa di Simiirregolarità in morfologie ifali con altri patogeni fungine invasive 3, e l&#39;identificazione comprovata richiede l&#39;isolamento dell&#39;agente eziologico in coltura pura. Cultura approcci basati contare sulla disponibilità di campioni di biopsia, ma questi non sono sempre accessibili in pazienti malati, e non sempre producono propaguli vitali per la cultura se sono stati ottenuti. Una caratteristica importante nella patogenesi di Aspergillus è angio-invasione, una caratteristica che fornisce la possibilità di monitorare il fungo immunologicamente con test che rilevano le firme caratteristiche antigeniche molecole nel siero e nel lavaggio broncoalveolare (BAL) fluidi. Questo ha portato allo sviluppo del immunoenzimatico Platelia (GM-EIA) che rileva Aspergillus galattomannano e un saggio &#39;pan-fungini&#39; (test Fungitell) che rileva il conservato fungina componente della parete cellulare (1 → 3)-β-D- glucano, ma non nelle Mucorales che non hanno tale componente in 1,4 loro pareti cellulari. Ècita che circonda l&#39;accuratezza di questi test 1,4-6 ha portato al recente sviluppo della prossima generazione di anticorpi monoclonali (MAb) basati su saggi in grado di rilevare marker surrogati di infezione 1,5. Thornton 5 recentemente descritta la generazione di un Aspergillus-MAb specifico (JF5) usando la tecnologia degli ibridomi e suo uso per sviluppare un immunocromatografico a flusso laterale dispositivo (LFD) per la point-of-care (POC) diagnosi di IPA. Un importante vantaggio della LFD è la capacità di rilevare l&#39;attività dal MAb JF5 lega ad un antigene glicoproteina extracellulare che viene secreto durante la crescita attiva del fungo solo 5. Questa è una considerazione importante quando si utilizza fluidi come BAL polmonare per la diagnosi di IPA in quanto le spore di Aspergillus sono una componente comune di aria inalata. L&#39;utilità del dispositivo nella diagnosi IPA è stata dimostrata utilizzando un modello animale di infezione, in cui il LFD visualizzato sensibilità e specificity rispetto al GM Platelia e Fungitell (1 → 3)-β-D-glucano saggi 7. Qui vi presentiamo una semplice procedura LFD per rilevare l&#39;antigene Aspergillus nel siero e fluidi umani BAL. La sua velocità e la precisione fornisce una nuova aggiunta point-of-care test per la diagnosi di IPA nei pazienti con neoplasie ematologiche maligne.

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Detection of Invasive Pulmonary Aspergillosis in Haematological Malignancy Patients by using Lateral-flow Technology

Una rapida e accurata point-of-care test per aspergillosi polmonare è presentato. Esso si avvale di flusso laterale tecnologia utilizza uno specifico anticorpo monoclonale che si lega ad uno<em&gt; Aspergillus</emAntigene&gt; secreto durante le infezioni polmonari. Il saggio è compatibile con lavaggio siero e brochoalveolar e rappresenta un nuovo test aggiunta per la diagnosi della malattia.

Rilevamento di aspergillosi polmonare in pazienti con neoplasie ematologiche maligne utilizzando la tecnologia a flusso laterale

Invasive pulmonary aspergillosis (IPA) is a leading cause of morbidity and mortality in haematological malignancy patients and hematopoietic stem cell ...

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JoVE Journal

Immunology and Infection

27.8K Views.  University of Exeter. Una rapida e accurata point-of-care test per aspergillosi polmonare è presentato. Esso si avvale di flusso laterale tecnologia utilizza uno specifico anticorpo monoclonale che si lega ad uno Aspergillus secreto durante le infezioni polmonari. Il saggio è compatibile con lavaggio siero e brochoalveolar e rappresenta un nuovo test aggiunta per la diagnosi della malattia.

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Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists. The value of 2P microscopy is that it provides rich spatiotemporal information regarding cell behaviors within intact tissues and in live mice. Leukocyte recruitment plays a significant role in host defense against infection and when unchecked, can contribute to inflammatory and autoimmune diseases. Studying leukocyte recruitment in vivo is technically challenging since cells are moving rapidly within vessels located deep within light scattering tissues. To date, most intravital imaging studies require surgical preparation to expose the blood vessels and tissues. To avoid the tissue damage and inflammation induced by surgery itself, here, we describe a non-invasive single-cell imaging approach that can be used to study leukocyte trafficking in the mouse footpad and phalanges. We discuss the technical aspects of our 2P imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Here, we describe a non-invasive two-photon (2P) microscopy approach to study leukocyte homing in the mouse footpad. We discuss the technical aspects of our tissue imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Non invasiva di imaging di homing dei leucociti e la migrazione In vivo</em

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Immunologia e infezioni

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in situ hybridization (FISH) for rapid culture-independent detection of Salmonella spp. Cell-charged tapes can also be placed face-down on selective agar for solid-phase enrichment prior to detection. Alternatively, low-volume liquid enrichments (liquid surface miniculture) can be performed on the surface of the tape in non-selective broth, followed by FISH and analysis via flow cytometry. To begin, sterile adhesive tape is brought into contact with fresh produce, gentle pressure is applied, and the tape is removed, physically extracting microbes present on these surfaces. Tapes are mounted sticky-side up onto glass microscope slides and the sampled cells are fixed with 10% formalin (30 min) and dehydrated using a graded ethanol series (50, 80, and 95%; 3 min each concentration). Next, cell-charged tapes are spotted with buffer containing a Salmonella-targeted DNA probe cocktail and hybridized for 15 - 30 min at 55&deg;C, followed by a brief rinse in a washing buffer to remove unbound probe. Adherent, FISH-labeled cells are then counterstained with the DNA dye 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) and results are viewed using fluorescence microscopy. For solid-phase enrichment, cell-charged tapes are placed face-down on a suitable selective agar surface and incubated to allow in situ growth of Salmonella microcolonies, followed by FISH and microscopy as described above. For liquid surface miniculture, cell-charged tapes are placed sticky side up and a silicone perfusion chamber is applied so that the tape and microscope slide form the bottom of a water-tight chamber into which a small volume (&le; 500 &mu;L) of Trypticase Soy Broth (TSB) is introduced. The inlet ports are sealed and the chambers are incubated at 35 - 37&deg;C, allowing growth-based amplification of tape-extracted microbes. Following incubation, inlet ports are unsealed, cells are detached and mixed with vigorous back and forth pipetting, harvested via centrifugation and fixed in 10% neutral buffered formalin. Finally, samples are hybridized and examined via flow cytometry to reveal the presence of Salmonella spp. As described here, our "tape-FISH" approach can provide simple and rapid sampling and detection of Salmonella on tomato surfaces. We have also used this approach for sampling other types of fresh produce, including spinach and jalape&ntilde;o peppers.

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple adhesive-tape-based approach for sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by rapid whole cell detection of Salmonella using fluorescence in situ hybridization (FISH).

Combinazione di nastro adesivo a base di campionamento e di fluorescenza In situ</emIbridazione> per il rilevamento rapido di Salmonella Su prodotti freschi

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

IgY Technology: Extraction of Chicken Antibodies from Egg Yolk by Polyethylene Glycol (PEG) Precipitation

Hens can be immunized by means of i.m. vaccination (Musculus pectoralis, left and right, injection volume 0.5-1.0 ml) or by means of Gene-Gun plasmid-immunization. Dependent on the immunogenicity of the antigen, high antibody-titres (up to 1:100,000 - 1:1,000,000) can be achieved after only one or 3 - 4 boost immunizations. Normally, a hen lays eggs continuously for about 72 weeks, thereafter the laying capacity decreases. This protocol describes the extraction of total IgY from egg yolk by means of a precipitation procedure (PEG. Polson et al. 1980). The method involves two important steps. The first one is the removal of lipids and the second is the precipitation of total IgY from the supernatant of step one. After dialysis against a buffer (normally PBS) the IgY-extract can be stored at -20&deg;C for more than a year. The purity of the extract is around 80 %, the total IgY per egg varies from 40-80 mg, dependent on the age of the laying hen. The total IgY content increases with the age of the hen from around 40 mg/egg up to 80 mg/egg (concerning PEG precipitation). The laying capacity of a hen per year is around 325 eggs. That means a total potential harvest of 20 g total IgY/year based on a mean IgY content of 60 mg total IgY/egg (see Table 1).

IgY Technology: Extraction of Chicken Antibodies from Egg Yolk by Polyethylene Glycol PEG Precipitation

This protocol describes in particular the extraction of total IgY from egg yolk by means of polyethylene glycol precipitation and gives general information about IgY technology.

Tecnologia IgY: Estrazione di anticorpi pollo rosso d&#39;uovo con polietilenglicole (PEG) Precipitazioni

Hens can be immunized by means of  i.m. vaccination (Musculus pectoralis, left and right, injection volume  0.5-1.0 ml) or by means of Gene-Gun ...

In Vivo Imaging Systems (IVIS) Detection of a Neuro-Invasive Encephalitic Virus

Modern advancements in imaging technology encourage further development and refinement in the way viral research is accomplished. Initially proposed by Russel and Burch in Hume's 3Rs (replacement, reduction, refinement), the utilization of animal models in scientific research is under constant pressure to identify new methodologies to reduce animal usage while improving scientific accuracy and speed. A major challenge to Hume's principals however, is how to ensure the studies are statistically accurate while reducing animal disease morbidity and overall numbers. Vaccine efficacy studies currently require a large number of animals in order to be considered statistically significant and often result in high morbidity and mortality endpoints for identification of immune protection. We utilized in vivo imaging systems (IVIS) in conjunction with a firefly bioluminescent enzyme to progressively track the invasion of the central nervous system (CNS) by an encephalitic virus in a murine model. Typically, the disease progresses relatively slowly, however virus replication is rapid, especially within the CNS, and can lead to an often, lethal outcome. Following intranasal infection of the mice with TC83-Luc, an attenuated Venezuelan equine encephalitis virus strain modified to expresses a luciferase gene; we are able to visualize virus replication within the brain at least three days before the development of clinical disease symptoms. Utilizing CNS invasion as a key encephalitic disease development endpoint we are able to quickly identify therapeutic and vaccine protection against TC83-Luc infection before clinical symptoms develop. With IVIS technology we are able to demonstrate the rapid and accurate testing of drug therapeutics and vaccines while reducing animal numbers and morbidity.

In Vivo Imaging Systems IVIS Detection of a Neuro-Invasive Encephalitic Virus

Utilizing luciferase and in vivo imaging systems (IVIS) as a novel means to identify disease endpoints before clinical developments occur. IVIS has allowed us to visualize in real time the invasion of encephalitic viruses over multiple days, providing a more accurate disease model for future study. It has also allowed us to identify the potential protective features of antivirals and vaccines faster than currently utilized animal models. The capability to utilize individual animals over multiple time points ensures reduced animal requirements, costs, and overall morbidity to the animals utilized ensuring a more humane and more scientific means of disease study.

In Vivo Imaging Systems (IVIS) il rilevamento di un neuro-invasiva Virus encephalitic

Modern advancements in imaging technology encourage further development and refinement in the way viral research is accomplished. Initially proposed by ...

Detection of Human Leukocyte Antigen Biomarkers in Breast Cancer Utilizing Label-free Biosensor Technology

According to the American Cancer Society, more than 200,000 women will be diagnosed with invasive breast cancer each year and approximately 40,000 will die from the disease. The human leukocyte antigen (HLA) class I samples peptides derived from proteasomal degradation of cellular proteins and presents these fragments on the cell surface for interrogation by circulating cytotoxic T lymphocytes (CTL). Generation of T-cell receptor mimic (TCRm) monoclonal antibodies (mAbs) which recognize breast cancer specific peptide/HLA-A*02:01 complexes such as those derived from macrophage migration inhibitory factor (MIF19-27) and NY-ESO-1157-165 enable detection and destruction of breast cancer cells in the absence of an effective anti-tumor CTL response. Intact class I HLA/peptide complexes are shed by breast cancer cells and represent potentially relevant cancer biomarkers. In this work, a breakthrough biomarker screening system for cancer diagnostics incorporating T-cell receptor mimic monoclonal antibodies combined with a novel, label-free biosensor utilizing guided-mode resonance (GMR) sensor technology is presented. Detection of shed MIF/HLA-A*02:01 complexes in MDA-MB-231 cell supernatants, spiked human serum, and patient plasma is demonstrated. The impact of this work could revolutionize personalized medicine through development of companion disease diagnostics for targeted immunotherapies.

Intact class I HLA/peptide complexes are shed by cancer cells, representing a potential relevant cancer biomarker. Utilizing label-free sensor technology and T-cell receptor mimicking monoclonal antibodies, detection of shed MIF/HLA-A*02:01 complexes in MDA-MB-231 cell supernatants, spiked human serum, and patient plasma is demonstrated, enabling development of a novel cancer diagnostic platform.

Rilevamento dei leucociti umani Antigen Biomarkers in Breast Cancer Utilizzando libero-Label Biosensor Tecnologia

According to the American Cancer Society, more than 200,000 women will be diagnosed with invasive breast cancer each year and approximately 40,000 will ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of combining reactions together. We designed and evaluated a panel based on this principle to rapidly identify the presence of common disease agents in dogs and horses with acute respiratory illness. This manuscript describes a nanoscale diagnostic PCR workflow for sample preparation, amplification, and analysis of target pathogen sequences, focusing on procedures that are different from microliter scale reactions. In the respiratory panel presented, 18 assays were each set up in triplicate, accommodating up to 48 samples per plate. A universal extraction and pre-amplification workflow was optimized for high-throughput sample preparation to accommodate multiple matrices and DNA and RNA based pathogens. Representative data are presented for one RNA target (influenza A matrix) and one DNA target (equine herpesvirus 1). The ability to quickly and accurately test for a comprehensive, syndrome-based group of pathogens is a valuable tool for improving efficiency and ergonomics of diagnostic testing and for acute respiratory disease diagnosis and management.

High-throughput testing of DNA and RNA based pathogens by nanoscale PCR is described using a syndromic canine and equine respiratory PCR panel.

Detection High-throughput respiratorie patogeni nei campioni animali da Nanoscale PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

Generation of Murine Monoclonal Antibodies by Hybridoma Technology

Monoclonal antibodies are universal binding molecules and are widely used in biomedicine and research. Nevertheless, the generation of these binding molecules is time-consuming and laborious due to the complicated handling and lack of alternatives. The aim of this protocol is to provide one standard method for the generation of monoclonal antibodies using hybridoma technology. This technology combines two steps. Step 1 is an appropriate immunization of the animal and step 2 is the fusion of B lymphocytes with immortal myeloma cells in order to generate hybrids possessing both parental functions, such as the production of antibody molecules and immortality. The generated hybridoma cells were then recloned and diluted to obtain stable monoclonal cell cultures secreting the desired monoclonal antibody in the culture supernatant. The supernatants were tested in enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) for antigen specificity. After the selection of appropriate cell clones, the cells were transferred to mass cultivation in order to produce the desired antibody molecule in large amounts. The purification of the antibodies is routinely performed by affinity chromatography. After purification, the antibody molecule can be characterized and validated for the final test application. The whole process takes 8 to 12 months of development, and there is a high risk that the antibody will not work in the desired test system.

An optimized protocol is presented for the generation of monoclonal antibodies based on the hybridoma technology. Mice were immunized with an immunoconjugate. Spleen cells were fused by PEG and an electric impulse with immortal myeloma cells. Antibody-producing hybridoma cells were selected by HAT and antigen-specific ELISA screening.

Generazione di Murine anticorpi monoclonali da ibridomi Tecnologia

Monoclonal antibodies are universal binding molecules and are widely used in biomedicine and research. Nevertheless, the generation of these binding ...

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome (HUS), colonize to the intestinal tract of humans. To study the detailed mechanism of EHEC colonization in vivo, it is essential to have animal models to monitor and quantify EHEC colonization. We demonstrate here a mouse-EHEC colonization model by transforming the bioluminescent expressing plasmid to EHEC to monitor and quantify EHEC colonization in living hosts. Animals inoculated with bioluminescence-labeled EHEC show intense bioluminescent signals in mice by detection with a non-invasive in vivo imaging system. After 1 and 2 days post infection, bioluminescent signals could still be detected in infected animals, which suggests that EHEC colonize in hosts for at least 2 days. We also demonstrate that these bioluminescent EHEC locate to mouse intestine, specifically in the cecum and colon, from ex vivo images. This mouse-EHEC colonization model may serve as a tool to advance the current knowledge of the EHEC colonization mechanism.

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

A detailed protocol of a mouse model for enterohemorrhagic E. coli (EHEC) colonization by using bioluminescence-labeled bacteria is presented. The detection of these bioluminescent bacteria by a non-invasive in vivo imaging system in live animals can advance our current understanding of EHEC colonization.

Rilevamento della colonizzazione di Escherichia Coli enteroemorragica in murino Host di sistema Non invasivo In Vivo bioluminescenza

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome ...

Histological Quantification to Determine Lung Fungal Burden in Experimental Aspergillosis

The quantification of lung fungal burden is critical for the determination of the relative levels of immune protection and fungal virulence in mouse models of pulmonary fungal infection. Although multiple methods are used to assess fungal burden, quantitative polymerase chain reaction (qPCR) of fungal DNA has emerged as a technique with several advantages over previous culture-based methods. Currently, a comprehensive assessment of lung pathology, leukocyte recruitment, fungal burden, and gene expression in mice with invasive aspergillosis (IA) necessitates the use of a significant number of experimental and control animals. Here the quantification of lung histological staining to determine fungal burden using a reduced number of animals was examined in detail. Lung sections were stained to identify fungal structures with Gomori&#39;s modified methanamine silver (GMS) staining. Images were taken from the GMS-stained sections from 4 discrete fields of each formalin-fixed paraffin-embedded lung. The GMS stained areas within each image were quantified using an image analysis program, and from this quantification, the mean percentage of stained area was determined for each sample. Using this strategy, eosinophil-deficient mice exhibited decreased fungal burden and disease with caspofungin therapy, while wild-type mice with IA did not improve with caspofungin. Similarly, fungal burden in mice lacking &#947;&#948; T cells were also improved by caspofungin, as measured by qPCR and GMS quantification. GMS quantification is therefore introduced as a method for the determination of relative lung fungal burden that may ultimately reduce the quantity of experimental animals required for comprehensive studies of invasive aspergillosis.

Here we describe a protocol to determine pulmonary fungal burden in mice with invasive aspergillosis by quantification of Gomori&#39;s modified methanamine silver staining in histological sections. Use of this method resulted in comparable results with less animals compared to assessment of fungal burden by quantitative PCR of lung fungal DNA.

Istologico quantificazione per determinare il fardello fungine del polmone nell'aspergillosi sperimentale

The quantification of lung fungal burden is critical for the determination of the relative levels of immune protection and fungal virulence in mouse ...

Ultrasensitive Detection of Biomarkers by Using a Molecular Imprinting Based Capacitive Biosensor

The ability to detect and quantitate biomolecules in complex solutions has always been highly sought-after within natural science; being used for the detection of biomarkers, contaminants, and other molecules of interest. A commonly used technique for this purpose is the Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA), where often one antibody is directed towards a specific target molecule, and a second labeled antibody is used for the detection of the primary antibody, allowing for the absolute quantification of the biomolecule under study. However, the usage of antibodies as recognition elements limits the robustness of the method; as does the need of using labeled molecules. To overcome these limitations, molecular imprinting has been implemented, creating artificial recognition sites complementary to the template molecule, and obsoleting the necessity of using antibodies for initial binding. Further, for even higher sensitivity, the secondary labeled antibody can be replaced by biosensors relying on the capacitance for the quantification of the target molecule. In this protocol, we describe a method to rapidly and label-free detect and quantitate low-abundant biomolecules (proteins and viruses) in complex samples, with a sensitivity that is significantly better than commonly used detection systems such as the ELISA. This is all mediated by molecular imprinting in combination with a capacitance biosensor.

Here, we present a protocol for the detection and quantification of low abundant molecules in complex solutions using molecular imprinting in combination with a capacitance biosensor.

Ultrasensibile rilevazione di biomarcatori utilizzando un Imprinting molecolare basato biosensore capacitivo

The ability to detect and quantitate biomolecules in complex solutions has always been highly sought-after within natural science; being used for the ...