These studies were supported in part by the Development Corporation of Abilene which provides laboratory space and salary support for Experimmune, a Center for Immunotherapeutic Development at Texas Tech University Health Sciences Center and Resonant Sensors Incorporated.

Etica dichiarazione: campioni De-identificati tessuti e plasma umano sono stati ottenuti da Hendrick Medical Center in un Institutional Review Board ha approvato il protocollo. 1. Aggiunta di anticorpo biotilinato NOTA: Il monitoraggio di questo passaggio è facoltativo. Vedere protocollo alternativo, se non di monitoraggio. <ol><li> Ottenere piastre in commercio derivati ​​rivestito avidina (vedi Materiali e attrezzature Table). </li><li> Aggiungere 50 ml di fosfato salina tamponata (PBS) pH 7,2 per pozzi. NOTA: Preincubare PBS a 28 ° C per minimizzare relativi alla temperatura risonanza turni. </li><li> Aprire software dello scanner bioassay e seguire l&#39;installazione guidata per definire la procedura sperimentale che prevede la selezione di bianchi, standardi e campioni nel layout di piastra, regolazione della temperatura (28 ° C), il numero di scansioni al minuto (1), e la durata della sperimentazione ( 150 min per ospitare per fasi preparative). </li&gt; <li> Inserire la piastra di test predisposto nello scanner bioassay libera etichetta e avviare la prima scansione. Quando la prima scansione, selezionare &quot;auto di riferimento per iniziare&quot;. La linea di base è l&#39;insieme iniziale di scansioni raccolti all&#39;inizio dell&#39;esperimento. Se questa è la prima lettura effettuata su questa piastra specifica, consentire allo scanner di funzionare per equilibrare la temperatura ed eliminare la deriva della linea di base. Vedere la Figura 2 per uno screenshot di una linea di base seguito da aggiunta del campione. </li><li> Dopo la linea di base è stabilizzato, o almeno 5 scansioni, mettere in pausa la lettura ed espellere la piastra. </li><li> Rimuovere PBS dal dumping nel lavandino e aggiungere 50 microlitri RL21A anticorpo biotinilato a [10 mg / ml in PBS pH 7,2] a tutti, ma pozzetti di controllo sulla piastra. Aggiungere 50 microlitri PBS ai pozzetti di controllo. </li><li> Inserire la piastra posteriore nello scanner bioassay e riprendere la lettura fino a saturazione, di circa 1,5 ore. </li><li> Pausa di lettura ed espellere la piastra. </li><li> Lavare il<html> piastra 3 volte con 200 microlitri / pozzetto tampone fosfato + 0,05% Tween 20 (PBST) seguito da 3 lavaggi con 200 microlitri / pozzetto di PBS pH 7,2. Ripetere con PBS. Toccare eccesso PBS dalla piastra su carta assorbente prima di passare alla fase successiva. NOTA: Questa fase può essere eseguita su un lavatore automatico delle lastre o lavare la piastra 3 volte con 200 microlitri PBST scaricando liquido in un lavandino e sostituendo PBST con una pipetta. </li><li> Aggiungere 50 ml di PBS pH 7,2 per tutti i pozzi attivi. </li><li> Inserire la piastra posteriore nello scanner bioassay e riprendere la lettura per il monitoraggio post-wash risonanza. </li><li> Fermare la lettura ed espellere la piastra. </li></ol> Protocollo alternativo per Step 1: <ol start="13"><li> Aggiungere 50 ml RL21A anticorpo biotinilato a [10 mg / ml di PBS] a tutti i pozzetti. </li><li> Incubare a temperatura ambiente per 1,5 ore o per una notte a 4 ° C. </li><li> Lavare la piastra 3 volte con 200 microlitri / bene PBST seguito da 3 risciacqui con 200 microlitri / pozzetto PBS come al punto 1.9. </li></ol>jove_title &quot;&gt; 2. Aggiunta di Analita <ol><li> Rimuovere la PBS e aggiungere 50 ml per pozzetto di un adeguato tampone. Per questo test, disponibile in commercio siero umano normale è stato utilizzato diluito 1:20 in PBS. </li><li> Aprire software dello scanner bioassay e seguire l&#39;installazione guidata per definire procedura sperimentale. </li><li> Inserire la piastra nello scanner bioassay e iniziare una linea di base leggere. Se questa è la prima lettura effettuata su questa piastra specifica, far funzionare scanner per equilibrare la temperatura ed eliminare la deriva della linea di base. </li><li> Dopo la linea di base è stabilizzato, o almeno 5 scansioni, mettere in pausa la lettura ed espellere la piastra. </li><li> Rimuovere il tampone dai pozzetti. </li><li> Controlli Spike con HLA A * 02: 01 monomero cuscinetto rilevante (FLSL) o irrilevanti (SLLV, YLEV, o KVL) peptidi a concentrazioni che vanno da [,625-10 mg / ml] in tampone. Aggiungere 50 ml di standard ai pozzetti di controllo della piastra </li><li> Aggiungere 50 ml di analita in tampone al campionepozzetti della piastra. Per questo test, a spillo siero umano disponibile in commercio è stata utilizzata. </li><li> Inserire la piastra posteriore nello scanner bioassay e riprendere la lettura fino a saturazione, di circa 30-60 min. </li><li> Pausa di lettura ed espellere la piastra. </li><li> Lavare la piastra 3 volte con 200 microlitri / bene PBST seguito da 3 risciacqui con 200 microlitri / pozzetto PBS come al punto 1.9. </li><li> Aggiungere 50 microlitri tampone a tutti i pozzetti attivi. </li><li> Inserire la piastra posteriore nello scanner bioassay e riprendere la lettura per il monitoraggio post-wash risonanza. </li><li> Fermare la lettura ed espellere la piastra. NOTA: Il tampone potrebbe essere PBS, tessuto di coltura, o di siero umano diluito 1:20 in PBS a seconda l&#39;obiettivo del test. </li></ol> Analisi 3. Dati <ol><li> Analizzare con il software dello scanner saggio biologico o esportare file di dati grezzi a preferito software di analisi statistica. Il software dello scanner saggio biologico genera automaticamente la curva vincolante basata sullalayout della piastra fornita durante l&#39;installazione sperimentale. NOTA: Se non si utilizza il software dello scanner saggio biologico per l&#39;analisi, seguire i passaggi 3,2-3,4. </li><li> Sottrarre la linea di base e il controllo negativo per ogni successivo punto dati. </li><li> Calcolare la media e la deviazione standard per i pozzi di replica per ogni punto temporale. </li><li> Genera un grafico della curva di legame o selezionare Dati finali per grafici a barre. </li></ol>

<ol>
	<li>Shastri, N., Schwab, S., Serwold, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Producing+nature's+gene-chips:+the+generation+of+peptides+for+display+by+MHC+class+I+molecules.">Producing nature's gene-chips: the generation of peptides for display by MHC class I molecules.</a> Annu Rev Immunol. 20, 463-493 (2002).</li><li>Peaper, D. R., Cresswell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+MHC+class+I+assembly+and+peptide+binding.">Regulation of MHC class I assembly and peptide binding.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 343-368 (2008).</li><li>Hawkins, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+HLA-presented+fragment+of+macrophage+migration+inhibitory+factor+is+a+therapeutic+target+for+invasive+breast+cancer.">An HLA-presented fragment of macrophage migration inhibitory factor is a therapeutic target for invasive breast cancer.</a> J Immunol. 186 (11), 6607-6616 (2011).</li><li>Verma, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TCR+mimic+monoclonal+antibody+targets+a+specific+peptide/HLA+class+I+complex+and+significantly+impedes+tumor+growth+in+vivo+using+breast+cancer+models.">TCR mimic monoclonal antibody targets a specific peptide/HLA class I complex and significantly impedes tumor growth in vivo using breast cancer models.</a> J Immunol. 184 (4), 2156-2165 (2010).</li><li>Verma, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TCR+mimic+monoclonal+antibodies+induce+apoptosis+of+tumor+cells+via+immune+effector-independent+mechanisms.">TCR mimic monoclonal antibodies induce apoptosis of tumor cells via immune effector-independent mechanisms.</a> J Immunol. 186 (5), 3265-3276 (2011).</li><li>Bassani-Sternberg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soluble+plasma+HLA+peptidome+as+a+potential+source+for+cancer+biomarkers.">Soluble plasma HLA peptidome as a potential source for cancer biomarkers.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (44), 18769-18776 (2010).</li><li>Hickman, H. D., Yewdell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mining+the+plasma+immunopeptidome+for+cancer+peptides+as+biomarkers+and+beyond.">Mining the plasma immunopeptidome for cancer peptides as biomarkers and beyond.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (44), 18747-18748 (2010).</li><li>Neethling, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+vaccine+potency+using+TCRmimic+antibodies.">Assessing vaccine potency using TCRmimic antibodies.</a> Vaccine. 26 (25), 3092-3102 (2008).</li><li>Mittendorf, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+trial+results+of+the+HER-2/neu+(E75)+vaccine+to+prevent+breast+cancer+recurrence+in+high-risk+patients:+from.">Clinical trial results of the HER-2/neu (E75) vaccine to prevent breast cancer recurrence in high-risk patients: from.</a> US Military Cancer Institute Clinical Trials Group Study I-01 and I-02. Cancer. 118 (10), 2594-2602 (2012).</li><li>Winter, H., Fox, B. A., Ruttinger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Future+of+cancer+vaccines.">Future of cancer vaccines.</a> Methods Mol Biol. 1139, 555-564 (2014).</li><li>Magnusson, R., Wawro, D., Zimmerman, S., Ding, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resonant+photonic+biosensors+with+polarization-based+multiparametric+discrimination+in+each+channel.">Resonant photonic biosensors with polarization-based multiparametric discrimination in each channel.</a> Sensors. 11 (2), 1476-1488 (2011).</li><li>Kaja, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+novel+biomarkers+for+ovarian+cancer+with+an+optical+nanotechnology+detection+system+enabling+label-free+diagnostics.">Detection of novel biomarkers for ovarian cancer with an optical nanotechnology detection system enabling label-free diagnostics.</a> J Biomed Opt. 17 (8), 081412-081411 (2012).</li><li>Magnusson, R., Wang, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+principle+for+optical+filters.">New principle for optical filters.</a> Appl. Phys. Lett. 61, 1022-1024 (1992).</li><li>Wawro, D., Tibuleac, S., Magnusson, R., Liu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+fiber+endface+biosensor+based+on+resonances+in+dielectric+waveguide+gratings.">Optical fiber endface biosensor based on resonances in dielectric waveguide gratings.</a> Proc. SPIE. 3911, 86-94 (2000).</li><li>Altman, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+analysis+of+antigen-specific+T+lymphocytes.">Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes.</a> Science. 274 (5284), 94-96 (1996).</li></ol>

Gli autori, Debra Wawro Weidanz e Robert Magnusson, rispettivamente Amministratore Delegato e Chief Technology Officer di Resonant Sensori Incorporated, che produce il lettore e test piastra piastre bioassay utilizzati in questo articolo.

Il metodo descritto introduce un sistema di screening per la diagnosi del cancro biomarker che permettano la rapida individuazione di solubili complessi peptide / HLA in campioni di siero, plasma, urina o saliva di pazienti in un volume alto 96- o 384 pozzetti. Questo sistema di dosaggio utilizzando recettore delle cellule T imitando anticorpi monoclonali e un sistema di rilevamento senza etichetta taglia il tempo di analisi per meno di 1 ora rispetto a 3,5 hr mediante ELISA convenzionale. Questo approccio high-throughput consente una rapida stratificazione dei pazienti per gli studi clinici per i vaccini terapeutici del cancro o farmaci biologici. Gli attuali metodi per l&#39;individuazione di questi obiettivi di malattia richiedono purificazione per affinità e HPLC-MS / MS dei campioni individuali, un processo che richiede tempo e ingombrante. Anche se questo metodo è suscettibile di tecniche convenzionali ELISA, vi è la preoccupazione che i reagenti di rivelazione secondari come l&#39;anticorpo anti-microglobulina β2 potrebbero alterare la struttura del nascente HLUna molecola ed inibire il legame al rilevamento limitazione TCRM. Free Detection-Label allevia queste preoccupazioni. Questa procedura può essere modificata per l&#39;uso su altri sistemi senza etichetta come un sistema di risonanza plasmonica di superficie. Tuttavia, ciò ridurrebbe notevolmente le capacità di throughput superiori rispetto al sistema di saggio biologico utilizzato in questo studio. Questo protocollo può essere efficacemente modificato per l&#39;individuazione di biomarker non-HLA nel siero del paziente e plasma con aderenza ad alcuni punti critici. Il monitoraggio del processo di rivestimento anticorpo iniziale è raccomandato per l&#39;ottimizzazione della superficie, come &lt;200 pm spostamento probabilmente porterà a segnale basso per la fase successiva rilevazione. La linea di base e post-wash legge sono utili per l&#39;analisi finale, come l&#39;abbondanza di proteine ​​del siero può mascherare vincolante di bassa concentrazione dell&#39;analita. Infine, variazione di temperatura dei campioni può provocare a variazioni ben bene. Si raccomanda che tutti i campioni siano pre-incubate und il biosassay libera termoregolatore unità etichetta fissato a 2-3 ° C sopra la temperatura ambiente. Campioni refrigerati dovrebbe essere consentito un tempo sufficiente per raggiungere la temperatura di esercizio. Modifiche future di questo protocollo comprenderanno multiplexing del TCRM sulla superficie della piastra. Il sistema biologico è attualmente suscettibili di macchia di pozzetti ad una densità di almeno 8-plex. Con l&#39;introduzione di 4-8 TCRM a ciascun pozzetto, per volumi di campione di prova sono ridotti e consentire la raccolta di dati sempre più complesse per paziente. Questa capacità potrebbe informare ulteriormente i pazienti per quanto riguarda le opzioni terapeutiche.

Gli antigeni di classe I (HLA) campioni peptidi di 8-11 aminoacidi di lunghezza derivanti dalla degradazione proteasoma della proteina intracellulare repertorio e presenta questi peptidi sulla superficie di ogni cellula nucleata 1,2. Il complesso HLA è &quot;biomarker della natura&quot;, indicante la salute di ogni cella (Figura 1) per circolanti linfociti T citotossici (CTL). Il riconoscimento di malattia associata peptidi provoca l&#39;eliminazione della cellula incriminata dal CTL. Pertanto, la risposta immunitaria adattativa è altamente efficace per eliminare l&#39;infezione virale e tumore. Tuttavia, il sistema immunitario esercita una pressione che spesso promuove selezione di virus o tumore grado di eludere una risposta efficace CTL. Recettore delle cellule T (mimando TCRM) anticorpi monoclonali (MAK, MAB), che riconoscono specifici peptide / HLA-A * 02: 01 complessi, come quelli derivati ​​da proteine ​​associate al cancro al seno, fattore inibitorio migrazione di macrofagi (MIF19-27) 3 e NY-ESO-1 157-165, consentire l&#39;individuazione e la distruzione delle cellule del cancro al seno, in assenza di un anti-tumorale efficace CTL risposta 4,5. Questo lavoro rappresentativo è focalizzata sulla HLA-A * 0201 molecola, che si esprime fino al 30% della popolazione. Tuttavia, l&#39;identificazione delle altre pertinenti complessi HLA / peptide, seguita dalla produzione di TCRM consente lo sviluppo di immunoterapie mirate e diagnostica delle malattie guidata, espandendo l&#39;utilità di questo lavoro ad una popolazione molto più ampio. Una parte dei complessi peptide / HLA dirette superficie cellulare viene rilasciata nel plasma. A causa della elevata complessità del peptide / piscine HLA, gli attuali metodi per l&#39;estrazione del immunopeptidome per biomarcatori HLA associati sono tempo. Questo processo richiede la purificazione per affinità di HLA solubili dal plasma, separazione dei peptidi HLA associati da fase inversa cromatografia liquida ad alta pressione(RP-HPLC) e peptide sequenziamento mediante spettrometria di massa tandem (MS / MS) 6,7. Anche se questo processo è una valida opzione per la scoperta di nuovi bersagli terapeutici, è un processo complicato come strumento diagnostico compagno per obiettivi connessi HLA già nel vaccino terapeutico o di una condotta biofarmaceutica 8-10. TCRM diretto contro questi obiettivi forniscono gli strumenti per un rapido sviluppo compagno diagnostica volte a stratificazione dei pazienti in studi clinici rilevanti e fornire opzioni terapeutiche più informate. In questo lavoro, un sistema di screening svolta biomarker per la diagnosi del cancro è presentato che utilizza TCRM e un sistema di test biologico privo di etichetta che controlla le interazioni biologiche con minime fasi di lavorazione. Il sistema di saggio biologico senza etichetta si basa su un metodo, che utilizza l&#39;effetto di risonanza modo guidato (GMR) che si verifica in reticoli guida dielettrica 11-14. Quando la luce a banda larga di diffrazionegrattugiatura nelle piastre necessari per questo sistema, due specifiche lunghezze d&#39;onda vengono riflesse. L&#39;interazione di legame tra un recettore immobilizzato e il suo ligando è monitorata in tempo reale tracciando spostamento della lunghezza d&#39;onda di risonanza con un analizzatore di spettro 12. Picchi di risonanza separati verificano per incidente TE (vettore elettrico normale al piano di incidenza) e TM (magnetica vettore normale al piano di incidenza) stati di polarizzazione forniscono più punti di dati che possono potenzialmente aumentare la precisione di rilevamento 11,14. Utilizzando anticorpi lastre pre-sensibilizzate in questo sistema di analisi privo di etichetta, il tempo di esecuzione del test con l&#39;analisi dei dati è di circa 45 min. Inoltre, più campioni del paziente possono essere interrogati in un formato da 96 o 384 pozzetti, un chiaro vantaggio rispetto un formato basato HPLC-MS / MS.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1191">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:521px;"><a name="RANGE!A1:D29">Name of the Material/Equipment</a></td>
			<td style="width:195px;">Company</td>
			<td style="width:120px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:355px;">Comments/Description (optional)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ResoSens Label-free Bioassay Detection System</td>
			<td>Resonant Sensors Incorporated</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Avidin Sensitized Bionetic 96-well Plates</td>
			<td>Resonant Sensors Incorporated</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ResoVu software</td>
			<td>Resonant Sensors Incorporated</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RL21A Biotinylated TCRm mAb&#160;</td>
			<td>PureMHC, LLC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RL9A Biotinylated TCRm mAb&#160;</td>
			<td>PureMHC, LLC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FLSL HLA-A*02:01 Monomer&#160;</td>
			<td>Experimmune</td>
			<td></td>
			<td>full peptide sequence: FLSELTQQL</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SLLV HLA-A*02:01 Monomer&#160;</td>
			<td>Experimmune</td>
			<td></td>
			<td>full peptide sequence: SLLMWITQV</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">YLEV HLA-A*02:01 Monomer&#160;</td>
			<td>Experimmune</td>
			<td></td>
			<td>full peptide sequence: YLEPGPVTV</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KVL HLA-A*02:01 Monomer&#160;</td>
			<td>Experimmune</td>
			<td></td>
			<td>full peptide sequence: KVLEYVIKV</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pooled Normal Human Serum&#160;</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP2657100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">MDA-MB-231 Cell Supernatant</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-26</td>
			<td style="width:355px;">Cells grown in IMDM , 10% FBS and 1% penn/strep. Supernatants harvested from 3 day confluent cultures.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Iscove&#39;s Modification of Dulbecco&#39;s Medium (IMDM)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12440-053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10082-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin/Streptomycin&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15070-63</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Hydroxide</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>5318-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP665-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phosphate Buffered Saline + 0.05% Tween 20 (PBST)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2,2&#8217;-Azinobis [3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid]-diammonium salt (ABTS)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>37615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">rabbit anti-human &#946;2 microglobulin&#160;</td>
			<td>Dako</td>
			<td>A0072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Peroxidase conjugated goat anti-rabbit IgG&#160;</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>111-035-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nunc&#160; microplates</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td align="right">439454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Synergy 2 microplate reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immpress Reagent Kit</td>
			<td>Vector</td>
			<td>MP-7402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immpact DAB</td>
			<td>Vector</td>
			<td>SK-4105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hematoxylin QS</td>
			<td>Vector</td>
			<td>H3403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IgG2a</td>
			<td>MP BioMedicals</td>
			<td>50328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IgG2b</td>
			<td>MP BioMedicals</td>
			<td>50330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-HLA-A2 (BB7.2)</td>
			<td>Experimmune</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Prism 5</td>
			<td>Graphpad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of human leukocyte antigen biomarkers in breast cancer utilizing label-free biosensor technology

Secondo l&#39;American Cancer Society, più di 200.000 donne saranno con diagnosi di cancro al seno invasivo ogni anno e circa 40.000 moriranno dalla malattia. Campioni La classe antigene leucocitario umano (HLA) I peptidi derivati ​​dal proteasoma degradazione delle proteine ​​cellulari e presenta questi frammenti sulla superficie cellulare per essere interrogati dai linfociti circolanti T citotossici (CTL). Generazione di mimica recettore delle cellule T (TCRM) anticorpi monoclonali (MAK, MAB), che riconoscono il cancro al seno specifico peptide / HLA-A * 02: 01 complessi, come quelli derivati ​​dalla migrazione dei macrofagi fattore inibitorio (MIF 19-27) e NY-ESO- 1 157-165 consentire l&#39;individuazione e la distruzione delle cellule del cancro al seno, in assenza di una efficace risposta CTL anti-tumorale. Intatte classe I complessi HLA / peptide sono capannone dalle cellule di cancro al seno e rappresentano potenzialmente rilevanti biomarcatori tumorali. In questo lavoro, un sistema di screening per il cancro svolta biomarcatore diagnosticos incorporando recettore delle cellule T anticorpi monoclonali mimici combinati con un romanzo, biosensore senza etichetta che utilizza in modalità guidata di risonanza (GMR) tecnologia dei sensori è presentato. Rilevamento di capannone MIF / HLA-A * 02: 01 complessi in sovranatanti cellulari MDA-MB-231, a spillo siero umano e plasma del paziente è dimostrata. L&#39;impatto di questo lavoro potrebbe rivoluzionare la medicina personalizzata attraverso lo sviluppo della diagnostica delle malattie compagno per immunoterapie mirate.

Un insieme rappresentativo di esperimenti è stata effettuata utilizzando la ben caratterizzato TCRM, RL21A, un anticorpo murino IgG2a monoclonale che riconosce specificamente un peptide (MIF 19-27 o FLSL) nell&#39;ambito del HLA-A * 02: 01 molecola 3. L&#39;affine monomero peptide / HLA, nonché irrilevante HLA monomero 15, è stato utilizzato per dimostrare la procedura descritta. Figura 3 illustra il formato del dosaggio. RL21A è specifico per il monomero FLSL / HLA con crocetta reattività con altri peptide / HLA complessi 3. Questa specificità è ricapitolato usando il sistema di saggio biologico senza etichetta (Figura 4). La sensibilità del sistema di saggio biologico libera etichetta per questo esperimento è nel range nanomolare basso come determinato mediante titolazione dell&#39;anticorpo RL21A sulla FLSL immobilizzato / HLA monomero (Figura 5). Anche se il segnale di fondo è significativamente aumentata in campioni di siero, srilevamento pecific di FLSL / HLA monomero nel siero umano spillo è raggiunto in figura 6 ed un gradiente di concentrazione è facilmente distinguibile in questi campioni. Infine, supernatanti dalla linea di cellule MDA-MB-231, mostrato in precedenza per presentare la FLSL / HLA-A * 02: 01 molecola, sono indicati per contenere solubile FLSL monomero utilizzando questa piattaforma test gratuito etichetta (Figura 7). La successiva aggiunta di FLSL / HLA monomero aumenta il segnale RL21A (Figura 7). A causa della sensibilità del sistema, oltre alla variazione ben compreso possono verificarsi come risultato di variazioni di temperatura come visto in funzione delle deviazioni standard in figure 4 e 5 turni risonanza negativi. Queste variazioni possono essere ridotti drasticamente pre-incubazione di tutti i campioni e il lettore di piastre saggio biologico ad una temperatura in leggero eccesso di temperatura ambiente (cioè, 28 ° C). In Figura 8, brevemente, 96-well lastre di polistirene sono stati rivestiti con [10 ug / ml] di RL21A per 2 ore a temperatura ambiente, lavata con PBST, bloccato con 0,5% latte magro, lavato con PBST, e incubate per 2 ore a temperatura ambiente con diluizioni seriali di FLSL HLA monomero nel siero umano normale diluito 1:10 in PBS per generare una curva standard o plasma del paziente diluito 1:10 in PBS. La piastra è stata lavata con PBST, incubate 1 ora a temperatura ambiente con coniglio β2 microglobulina anti-umano [1: 5,000] per rilevare HLA intatto, e lavato in PBST. Le piastre sono state poi incubate per 30 min con capra anti-IgG di coniglio [1: 10.000] e lavati con PBST. Rilevamento colorimetrico stata eseguita usando ABTS (2,2&#39;-Azinobis [acido 3-ethylbenzothiazoline-6-solfonico] sale -diammonium) substrato con un tempo di incubazione 15 min e osservato a 405 nm su un lettore di micropiastre. FLSL / HLA è stata rilevata in tre campioni di pazienti. Nella Figura 8B, RL.064 plasma del paziente è stato diluito 1:20 in PBS e quindi aggiungereed alla piastra e monitorato sul rivelatore senza etichetta per 60 min. Individuazione specifica del complesso FLSL / HLA nel siero del paziente è stata compiuta. Test t di Student è stato eseguito utilizzando grafici e statistiche software (p &lt;0.05). In Figura 8C, sezioni di tessuto sono state colorate a 1 mg / ml con topo anti-HLA-A2 (BB7.2) come controllo positivo, RL21A, IgG2b e IgG2a rispettivamente come controlli negativi. La colorazione è stato rilevato utilizzando un kit anti-topo rilevamento, DAB (diaminobenzadine), e QS ematossilina per la colorazione nucleare come indicato dal produttore. La colorazione del tessuto tumorale da RL21A conferma la presentazione di complessi FLSL / HLA. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig1highres.jpg" /> Figura 1:. Tumore presentazione dell&#39;antigene da parte dell&#39;antigene umano leucociti classe I trasformazione cancerosa è un disordine intracellulare. Campione intracellul HLAproteine ​​AR e rivelare i cambiamenti legati al cancro alla superficie cellulare. CTL e TCRM sono in grado di riconoscere le cellule cancerose mediante complessi HLA-peptide distinte a tali cellule. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig2highres.jpg" /> Figura 2:. Schermata di acquisizione dei dati nel software dello scanner bioassay Esempio di acquisizione dati che mostra la linea di base iniziale scan seguito RL21A anticorpi Oltre a una piastra ricoperta con 10 ug / ml di complesso FLSL / HLA. Le concentrazioni di anticorpi sono come indicato. Ogni linea rappresenta un individuo ben monitorato nel tempo. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig3highres.jpg" /> Figura 3:. Formato Assay Illustrazione di anticorpi immobilizzato sulla superficie del reticolo di diffrazione della rel piastra test catturaEvant peptide / complessi HLA in soluzione. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig4highres.jpg" /> Figura 4: Specificità RL21A per FLSL / HLA complesso dimostrazione della specificità del biotinilato RL21A TCRM per la sua rilevante (FLSL) HLA monomero rispetto irrilevante monomero HLA (YLEV, SLLV, e KVL).. Biotinilato RL21A TCRM [10 ug / ml] è stato immobilizzato sulla superficie della piastra rivestita dosaggio avidina e la rilevazione è stata eseguita utilizzando non marcato monomero HLA rilevante o irrilevante [10 ug / ml] in PBS. RL21A era specifico per FLSL / HLA Complex. ANOVA a due vie è stata effettuata utilizzando grafici e statistiche software (p &lt;0.001). <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig5highres.jpg" /> Figura 5:. Binding sensibilità del RL21A al suo peptide complesso affine / HLA Illustrazione del detectiil limite di sensibilità e RL21A legame al complesso FLSL / HLA. Biotinilato HLA Monomero FLSL [10 ug / ml] è stato immobilizzato sulla superficie della piastra del test e RL21A non marcato è stato aggiunto alla piastra in diluizioni seriali in PBS come indicato. Rilevamento di questo sistema era nell&#39;intervallo nanomolare bassa. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig6highres.jpg" /> Figura 6: Rilevamento di HLA Complessi in Spiked Human Serum Dimostrazione della rilevazione di HLA nel siero umano.. Biotinilato RL21A TCRM [10 mg / ml] è stato immobilizzato sulla superficie della piastra test avidina rivestita. Siero umano normale pool di spillo con relativa (FLSL) o irrilevanti (SLLV) HLA monomero è stato diluito 1:20 in PBS e poi aggiunto alla piastra e monitorato sul rivelatore senza etichetta per 60 min. Individuazione specifica del complesso FLSL / HLA nel siero umano è stato compiuto. In generale, segnale di fondo (irrilevante SLLV monomero) è altoer per i campioni di siero diluiti rispetto al analiti purificate in PBS (vedi Figura 4). Due vie ANOVA è stata effettuata utilizzando grafici e statistiche software (p &lt;0,0001). <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig7highres.jpg" /> Figura 7:. Complessi HLA sono stati rilevati nel cancro al seno supernatanti di colture cellulari La capacità di rilevare HLA in seno surnatanti di cellule di cancro è dimostrata. Biotinilato RL21A TCRM, RL9A TCRM (controllo negativo), e un controllo isotipico state immobilizzate sulla superficie della piastra test. Spiked [5 mg / ml] e non addizionati supernatanti di colture cellulari MDA-231 sono stati aggiunti e vincolante è stata monitorata per 60 minuti sul rivelatore senza etichetta. FLSL e SLLV HLA monomero spillo campioni rappresentano controlli positivi per RL9A e RL21A vincolanti. One-way ANOVA è stata effettuata utilizzando grafici e statistiche software (p &lt;0,0001). Figura 8:. Rilevamento specifico di complessi FLSL / HLA in campioni dei pazienti (A) Un enzima tradizionale Immunoenzimatico Assay (ELISA) è stata utilizzata per rilevare FLSL / HLA complessi specifici nel plasma dei pazienti. (B) biotilinato RL21A TCRM o IgG2a [10 mg / ml] è stato immobilizzato sul piatto test avidina. (C) tessuto tumorale del seno da RL.064 paziente era macchiato come descritto in precedenza 3 per verificare presentazione tumore dei complessi FLSL / HLA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52159/52159fig8large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Detection of Human Leukocyte Antigen Biomarkers in Breast Cancer Utilizing Label-free Biosensor Technology

Intatte classe I complessi HLA / peptide sono capannone dalle cellule tumorali, che rappresenta un potenziale biomarcatore cancro rilevante. Utilizzando la tecnologia dei sensori senza etichetta e il recettore delle cellule T mimando anticorpi monoclonali, rilevamento di capannone MIF / HLA-A * 02: 01 complessi in sovranatanti cellulari MDA-MB-231, spillo siero umano, e plasma del paziente è dimostrata, consentendo lo sviluppo di un romanzo cancro piattaforma diagnostica.

Rilevamento dei leucociti umani Antigen Biomarkers in Breast Cancer Utilizzando libero-Label Biosensor Tecnologia

According to the American Cancer Society, more than 200,000 women will be diagnosed with invasive breast cancer each year and approximately 40,000 will ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.4K Views.  Texas Tech University Health Sciences Center.  Intatte classe I complessi HLA / peptide sono capannone dalle cellule tumorali, che rappresenta un potenziale biomarcatore cancro rilevante. Utilizzando la tecnologia dei sensori senza etichetta e il recettore delle cellule T mimando anticorpi monoclonali, rilevamento di capannone MIF / HLA-A * 02: 01 complessi in sovranatanti cellulari MDA-MB-231, spillo siero umano, e plasma del paziente è dimostrata, consentendo lo sviluppo di un romanzo cancro piattaforma diagnostic...

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Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists. The value of 2P microscopy is that it provides rich spatiotemporal information regarding cell behaviors within intact tissues and in live mice. Leukocyte recruitment plays a significant role in host defense against infection and when unchecked, can contribute to inflammatory and autoimmune diseases. Studying leukocyte recruitment in vivo is technically challenging since cells are moving rapidly within vessels located deep within light scattering tissues. To date, most intravital imaging studies require surgical preparation to expose the blood vessels and tissues. To avoid the tissue damage and inflammation induced by surgery itself, here, we describe a non-invasive single-cell imaging approach that can be used to study leukocyte trafficking in the mouse footpad and phalanges. We discuss the technical aspects of our 2P imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Here, we describe a non-invasive two-photon (2P) microscopy approach to study leukocyte homing in the mouse footpad. We discuss the technical aspects of our tissue imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Non invasiva di imaging di homing dei leucociti e la migrazione In vivo</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in situ hybridization (FISH) for rapid culture-independent detection of Salmonella spp. Cell-charged tapes can also be placed face-down on selective agar for solid-phase enrichment prior to detection. Alternatively, low-volume liquid enrichments (liquid surface miniculture) can be performed on the surface of the tape in non-selective broth, followed by FISH and analysis via flow cytometry. To begin, sterile adhesive tape is brought into contact with fresh produce, gentle pressure is applied, and the tape is removed, physically extracting microbes present on these surfaces. Tapes are mounted sticky-side up onto glass microscope slides and the sampled cells are fixed with 10% formalin (30 min) and dehydrated using a graded ethanol series (50, 80, and 95%; 3 min each concentration). Next, cell-charged tapes are spotted with buffer containing a Salmonella-targeted DNA probe cocktail and hybridized for 15 - 30 min at 55&deg;C, followed by a brief rinse in a washing buffer to remove unbound probe. Adherent, FISH-labeled cells are then counterstained with the DNA dye 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) and results are viewed using fluorescence microscopy. For solid-phase enrichment, cell-charged tapes are placed face-down on a suitable selective agar surface and incubated to allow in situ growth of Salmonella microcolonies, followed by FISH and microscopy as described above. For liquid surface miniculture, cell-charged tapes are placed sticky side up and a silicone perfusion chamber is applied so that the tape and microscope slide form the bottom of a water-tight chamber into which a small volume (&le; 500 &mu;L) of Trypticase Soy Broth (TSB) is introduced. The inlet ports are sealed and the chambers are incubated at 35 - 37&deg;C, allowing growth-based amplification of tape-extracted microbes. Following incubation, inlet ports are unsealed, cells are detached and mixed with vigorous back and forth pipetting, harvested via centrifugation and fixed in 10% neutral buffered formalin. Finally, samples are hybridized and examined via flow cytometry to reveal the presence of Salmonella spp. As described here, our "tape-FISH" approach can provide simple and rapid sampling and detection of Salmonella on tomato surfaces. We have also used this approach for sampling other types of fresh produce, including spinach and jalape&ntilde;o peppers.

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple adhesive-tape-based approach for sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by rapid whole cell detection of Salmonella using fluorescence in situ hybridization (FISH).

Combinazione di nastro adesivo a base di campionamento e di fluorescenza In situ</emIbridazione> per il rilevamento rapido di Salmonella Su prodotti freschi

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Detection of Invasive Pulmonary Aspergillosis in Haematological Malignancy Patients by using Lateral-flow Technology

Invasive pulmonary aspergillosis (IPA) is a leading cause of morbidity and mortality in haematological malignancy patients and hematopoietic stem cell transplant recipients1. Detection of IPA represents a formidable diagnostic challenge and, in the absence of a 'gold standard', relies on a combination of clinical data and microbiology and histopathology where feasible. Diagnosis of IPA must conform to the European Organization for Research and Treatment of Cancer and the National Institute of Allergy and Infectious Diseases Mycology Study Group (EORTC/MSG) consensus defining "proven", "probable", and "possible" invasive fungal diseases2. Currently, no nucleic acid-based tests have been externally validated for IPA detection and so polymerase chain reaction (PCR) is not included in current EORTC/MSG diagnostic criteria.
Identification of Aspergillus in histological sections is problematic because of similarities in hyphal morphologies with other invasive fungal pathogens3, and proven identification requires isolation of the etiologic agent in pure culture. Culture-based approaches rely on the availability of biopsy samples, but these are not always accessible in sick patients, and do not always yield viable propagules for culture when obtained.
An important feature in the pathogenesis of Aspergillus is angio-invasion, a trait that provides opportunities to track the fungus immunologically using tests that detect characteristic antigenic signatures molecules in serum and bronchoalveolar lavage (BAL) fluids. This has led to the development of the Platelia enzyme immunoassay (GM-EIA) that detects Aspergillus galactomannan and a 'pan-fungal' assay (Fungitell test) that detects the conserved fungal cell wall component (1 &rarr;3)-&beta;-D-glucan, but not in the mucorales that lack this component in their cell walls1,4. Issues surrounding the accuracy of these tests1,4-6 has led to the recent development of next-generation monoclonal antibody (MAb)-based assays that detect surrogate markers of infection1,5.
Thornton5 recently described the generation of an Aspergillus-specific MAb (JF5) using hybridoma technology and its use to develop an immuno-chromatographic lateral-flow device (LFD) for the point-of-care (POC) diagnosis of IPA. A major advantage of the LFD is its ability to detect activity since MAb JF5 binds to an extracellular glycoprotein antigen that is secreted during active growth of the fungus only5. This is an important consideration when using fluids such as lung BAL for diagnosing IPA since Aspergillus spores are a common component of inhaled air. The utility of the device in diagnosing IPA has been demonstrated using an animal model of infection, where the LFD displayed improved sensitivity and specificity compared to the Platelia GM and Fungitell (1 &rarr; 3)-&beta;-D-glucan assays7.
Here, we present a simple LFD procedure to detect Aspergillus antigen in human serum and BAL fluids. Its speed and accuracy provides a novel adjunct point-of-care test for diagnosis of IPA in haematological malignancy patients.

A rapid and accurate point-of-care test for invasive pulmonary aspergillosis is presented. It takes advantage of lateral-flow technology using a specific monoclonal antibody that binds to an Aspergillus antigen secreted during pulmonary infections. The assay is compatible with serum and brochoalveolar lavage and represents a novel adjunct test for disease diagnosis.

Rilevamento di aspergillosi polmonare in pazienti con neoplasie ematologiche maligne utilizzando la tecnologia a flusso laterale

Invasive pulmonary aspergillosis (IPA) is a leading cause of morbidity and mortality in haematological malignancy patients and hematopoietic stem cell ...

Utilizing the Antigen Capsid-Incorporation Strategy for the Development of Adenovirus Serotype 5-Vectored Vaccine Approaches

Adenovirus serotype 5 (Ad5) has been extensively modified with traditional transgene methods for the vaccine development. The reduced efficacies of these traditionally modified Ad5 vectors in clinical trials could be primarily correlated with Ad5 pre-existing immunity (PEI) among the majority of the population. To promote Ad5-vectored vaccine development by solving the concern of Ad5 PEI, the innovative Antigen Capsid-Incorporation strategy has been employed. By merit of this strategy, Ad5-vectored we first constructed the hexon shuttle plasmid HVR1-KWAS-HVR5-His6/pH5S by subcloning the hypervariable region (HVR) 1 of hexon into a previously constructed shuttle plasmid HVR5-His6/pH5S, which had His6 tag incorporated into the HVR5. This HVR1 DNA fragment containing a HIV epitope ELDKWAS was synthesized. HVR1-KWAS-HVR5-His6/pH5S was then linearized and co-transformed with linearized backbone plasmid pAd5/&#8710;H5 (GL) , for homologous recombination. This recombined plasmid pAd5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6 was transfected into cells to generate the viral vector Ad5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6. This vector was validated to have qualitative fitness indicated by viral physical titer (VP/ml), infectious titer (IP/ml) and corresponding VP/IP ratio. Both the HIV epitope and His6 tag were surface-exposed on the Ad5 capsid, and retained epitope-specific antigenicity of their own. A neutralization assay indicated the ability of this divalent vector to circumvent neutralization by Ad5-positive sera in vitro. Mice immunization demonstrated the generation of robust humoral immunity specific to the HIV epitope and His6. This proof-of-principle study suggested that the protocol associated with the Antigen Capsid-Incorporation strategy could be feasibly utilized for the generation of Ad5-vectored vaccines by modifying different capsid proteins. This protocol could even be further modified for the generation of rare-serotype adenovirus-vectored vaccines.

Here, we present a protocol to generate a proof-of-principle divalent adenovirus type 5 (Ad5) vector Ad5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6 by utilizing the Antigen Capsid-Incorporation strategy. This vector was demonstrated to exhibit qualitative fitness, the capability to escape Ad5-positive sera in vitro, and the antigenicity as well as immunogenicity to the incorporated antigens.

Utilizzando la strategia di Antigen Capside-Incorporation per lo sviluppo di approcci Adenovirus sierotipo 5 Vectored vaccino

Adenovirus serotype 5 (Ad5) has been extensively modified with traditional transgene methods for the vaccine development. The reduced efficacies of these ...

Intravital Microscopy of Leukocyte-endothelial and Platelet-leukocyte Interactions in Mesenterial Veins in Mice

Intravital microscopy is a method that can be used to investigate different processes in different regions and vessels in living animals. In this protocol, we describe intravital microscopy of mesentery veins. This can be performed in a short period of time with reproducible results showing leukocyte-endothelial interactions in vivo. We describe an inflammatory setting after LPS challenge of the endothelium. But in this model one can apply many different types of inflammatory conditions, like bacterial, chemical or biological and investigate the administration of drugs and their direct effects on the living animal and its impact on leukocyte recruitment. This protocol has been applied successfully to a number of different treatments of mice and their effects on inflammatory response in vessels. Herein, we describe the visualization of leukocytes and platelets by fluorescently labeling these with rhodamine 6G. Additionally, any specific imaging can be performed using targeted fluorescently labeled molecules.

This simplified application of intravital microscopy of mesentery veins in mice can be used in different models of inflammation to observe leukocyte-endothelial and platelet-leukocyte interactions.

Interazioni intravitale Microscopia di leucociti-endoteliali e piastrine-leucociti in Mesenterial Vene Mice

Intravital microscopy is a method that can be used to investigate different processes in different regions and vessels in living animals. In this ...

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, cloning TCRs specific for various tumor-associated antigens has been the goal of many studies. To elicit an effective T cell response, the TCR must recognize the target antigen with optimal affinity. However, cloning such TCRs has been a challenge and many available TCRs possess sub-optimal affinity for the cognate antigen. In this protocol, we describe a method of cloning de novo high affinity antigen-specific TCRs using existing TCRs by exploiting hemichain centricity. It is known that for some TCRs, each TCR&#945; or TCR&#946; hemichain do not contribute equally to antigen recognition, and the dominant hemichain is referred to as the centric hemichain. We have shown that by pairing the centric hemichain with counter-chains differing from the original counter-chain, we are able to maintain the antigen specificity, while modulating its interaction strength for the cognate antigen. Thus, the therapeutic potential of a given TCR can be improved by optimizing the pairing between the centric and counter hemichains.

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

Herein we describe a novel method to generate antigen-specific T cell receptors (TCRs) by pairing the TCR&#945; or TCR&#946; of an existing TCR, possessing the antigen-specificity of interest, with complementary hemichain of the peripheral T cell receptor repertoire. The de novo generated TCRs retain antigen-specificity with varying affinity.

Generazione<em&gt; De Novo</em&gt; Antigene-specifici T umana recettori cellulari di trasduzione retrovirale di Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol specifically intended to measure antigen-specific killing without an infection. This protocol is designed and describes methods to overcome these limitations by allowing for the detection of antigen-specific killing of a target cell by CD8+ T cells in vivo. This is accomplished by merging a vaccination model with a traditional CFSE-labeled target killing assay. This combination allows the researcher to assess the antigen-specific CTL potential directly and quickly as the assay is not dependent upon tumor growth or infection. In addition, the readout is based on flow cytometry and so should be readily accessible to most researchers. The major limitation of the study is identifying the timeline in vivo that is appropriate to the hypothesis being tested. Variations in antigen strength and mutations in the T cells that may result in differential cytolytic function need to be carefully assessed to determine the optimal time for cell harvest and assessment. The appropriate concentration of peptide for vaccination has been optimized for hgp10025-33 and OVA257-264, but further validation would be needed for other peptides that may be more appropriate to a given study. Overall, this protocol allows a quick assessment of killing function in vivo and can be adapted to any given antigen.

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

The goal of this protocol is to allow for detection of in vivo antigen-specific killing of a target cell in a murine model.

In Vivo Test per la determinazione della funzione citolitica di cellule T antigene-specifiche utilizzando un modello di vaccinazione

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...

Ultrasensitive Detection of Biomarkers by Using a Molecular Imprinting Based Capacitive Biosensor

The ability to detect and quantitate biomolecules in complex solutions has always been highly sought-after within natural science; being used for the detection of biomarkers, contaminants, and other molecules of interest. A commonly used technique for this purpose is the Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA), where often one antibody is directed towards a specific target molecule, and a second labeled antibody is used for the detection of the primary antibody, allowing for the absolute quantification of the biomolecule under study. However, the usage of antibodies as recognition elements limits the robustness of the method; as does the need of using labeled molecules. To overcome these limitations, molecular imprinting has been implemented, creating artificial recognition sites complementary to the template molecule, and obsoleting the necessity of using antibodies for initial binding. Further, for even higher sensitivity, the secondary labeled antibody can be replaced by biosensors relying on the capacitance for the quantification of the target molecule. In this protocol, we describe a method to rapidly and label-free detect and quantitate low-abundant biomolecules (proteins and viruses) in complex samples, with a sensitivity that is significantly better than commonly used detection systems such as the ELISA. This is all mediated by molecular imprinting in combination with a capacitance biosensor.

Here, we present a protocol for the detection and quantification of low abundant molecules in complex solutions using molecular imprinting in combination with a capacitance biosensor.

Ultrasensibile rilevazione di biomarcatori utilizzando un Imprinting molecolare basato biosensore capacitivo

The ability to detect and quantitate biomolecules in complex solutions has always been highly sought-after within natural science; being used for the ...

A Protein Microarray Assay for Serological Determination of Antigen-specific Antibody Responses Following Clostridium difficile Infection

We provide a detailed overview of a novel high-throughput protein microarray assay for the determination of anti-Clostridium difficile antibody levels in human sera and in separate preparations of polyclonal intravenous immunoglobulin (IVIg). The protocol describes the methodological steps involved in sample preparation, printing of arrays, assay procedure, and data analysis. In addition, this protocol could be further developed to incorporate diverse clinical samples including plasma and cell culture supernatants. We show how protein microarray can be used to determine a combination of isotype (IgG, IgA, IgM), subclass (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2), and strain-specific antibodies to highly purified whole C. difficile toxins A and B (toxinotype 0, strain VPI 10463, ribotype 087), toxin B from a C. difficile toxin-B-only expressing strain (CCUG 20309), a precursor form of a B fragment of binary toxin, pCDTb, ribotype-specific whole surface layer proteins (SLPs; 001, 002, 027), and control proteins (tetanus toxoid and Candida albicans). During the experiment, microarrays are probed with sera from individuals with C. difficile infection (CDI), individuals with cystic fibrosis (CF) without diarrhea, healthy controls (HC), and from individuals pre- and post-IVIg therapy for the treatment of CDI, combined immunodeficiency disorder, and chronic inflammatory demyelinating polyradiculopathy. We encounter significant differences in toxin neutralization efficacies and multi-isotype specific antibody levels between patient groups, commercial preparations of IVIg, and sera before and following IVIg administration. Also, there is a significant correlation between microarray and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for antitoxin IgG levels in serum samples. These results suggest that microarray could become a promising tool for profiling antibody responses to C.difficile antigens in vaccinated or infected humans. With further refinement of antigen panels and a reduction in production costs, we anticipate that microarray technology may help optimize and select the most clinically useful immunotherapies for C. difficile infection in a patient-specific manner.

A Protein Microarray Assay for Serological Determination of Antigen-specific Antibody Responses Following Clostridium difficile Infection

This article describes a simple protein microarray method for profiling humoral immune responses to a 7-plex panel of highly purified Clostridium difficile antigens in human sera. The protocol can be extended for the determination of specific antibody responses in preparations of polyclonal intravenous immunoglobulin.

Un'analisi di Microarray della proteina per determinazione sierologica dell'infezione di Clostridium difficile anticorpo seguenti risposte antigene-specifiche

We provide a detailed overview of a novel high-throughput protein microarray assay for the determination of anti-Clostridium difficile antibody levels in ...

Label-free Neutrophil Enrichment from Patient-derived Airway Secretion Using Closed-loop Inertial Microfluidics

Airway secretions contain a large number of immune-related cells, e.g., neutrophils, macrophages, and lymphocytes, which can be used as a major resource to evaluate a variety of pulmonary diseases, both for research and clinical purposes. However, due to the heterogeneous and viscous nature of patient mucus, there is currently no reliable dissociation method that does not damage the host immune cells in the patient airway secretion. In this research, we introduce a sample preparation method that uses inertial microfluidics for the patient&#39;s immune assessment. Regardless of the heterogeneous fluidic properties of the clinical samples, the proposed method recovers more than 95% of neutrophils from airway secretion samples that are diluted 1,000-fold with milliliters of clean saline. By recirculating the concentrated output stream to the initial sample reservoir, a high concentration, recovery, and purity of the immune cells are provided; recirculation is considered a trade-off to the single-run syringe-based operation of inertial microfluidics. The closed-loop operation of spiral microfluidics provides leukocytes without physical or chemical disturbance, as demonstrated by the phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)-induced elastase release of sorted neutrophils.

In this research, we demonstrate a label-free neutrophil separation method from clinical airway secretions using closed-loop operation of spiral inertial microfluidics. The proposed method would expand the clinical in vitro assays for various respiratory diseases.

Label-free del neutrofilo arricchimento da secrezione di paziente-derivato della via aerea utilizzando microfluidica inerziale Closed-loop

Airway secretions contain a large number of immune-related cells, e.g., neutrophils, macrophages, and lymphocytes, which can be used as a major resource ...