Ringraziamo il Dott. Krishanu Ray per gli stock di Drosophila, Tarjani Agarwal per il mantenimento di una gabbia di Drosophila, Peter Juo per nuIs25 e CGC per C. elegans ceppi. SPK fatto jsIs609 nel laboratorio di Michael Nonet. Ringraziamo Arpan Agnihotri (BITS Pilani) per il suo aiuto in time-lapse imaging di trasporto dei mitocondri jsIs609 animali in dispositivi microfluidici. Siamo grati al Dr. Vatsala Thirumalai e Surya Prakash per averci fornito embrioni di zebrafish. Ringraziamo il Dott. Krishna e CIFF a BCN per l&#39;uso del microscopio confocale disco rotante sostenuto dal Dipartimento di Scienze e Tecnologie-Centro per le Nanotecnologie (n. SR/55/NM-36-2005). Ringraziamo anche Kaustubh Rau, V. Venkatraman e Chetana Sachidanand per le discussioni. Questo lavoro è stato finanziato dal DBT post-dottorato (SM), DST accelerata regime (SM) e una borsa di studio a DBT (SPK). SA è stata sostenuta da sovvenzioni DST e CSIR a SPK.

1. SU8 Maestro Fabrication <ol><li> Progettare le strutture microfluidica utilizzando software Clewin e stamparlo con 65.024 plotter DPI laser con dimensione minima di 8 micron su pellicola circuito. </li><li> Pulire 2 cm x 2 centimetri wafer di silicio con ossido nativo in KOH al 20% per 1 min e risciacquo in acqua deionizzata; wafer uno strato per ogni flusso e il suo livello di controllo corrispondente. </li><li> Asciugare i pezzi con gas azoto e disidratare su una piastra calda a 120 ° C per 4 h. Permettono i pezzi raffreddare a temperatura ambiente prima di procedere alla fase successiva. </li><li> Luogo pezzi di silicio, uno alla volta sul mandrino filatore e accendere il vuoto. Coprire le superfici di silicio con ~ 20 microlitri esametil-disilazane (HMDS) e spalmare con un SPIN150 filatore a 500 rpm per 5 sec seguita da 3.000 rpm per 30 sec. </li><li> Coprire completamente con wafer di silicio ~ 1.5 ml di SU8-2025 ( <a href="http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm" target="_blank">http://</a>www.microchem.com/Prod-SU82000.htm) e wafer manto con SPIN150 filatore a 500 rpm per 5 sec seguita da 2.000 rpm per 30 sec. Questo protocollo filatura produce uno spessore di fotoresist ~ 40 pm che è adatto per il controllo di flusso e di strati per primi stadi larvali di C. elegans. </li><li> Spin ~ 1,5 ml SU8-2050 utilizzando SPIN150 filatore a 500 rpm per 5 sec seguita da 2.000 rpm per 30 secondi per ottenere uno spessore di fotoresist ~ 80 um che è adatto per la fabbricazione di flusso strato di ritardo stadi larvali di C. elegans, strato basale di flusso per Drosophila / zebrafish larve e le loro livelli di controllo corrispondenti. </li><li> Mettere i pezzi di silicio sulla piastra calda con lo strato SU8 rivestimento sulla parte superiore. Morbido cuocere i pezzi rivestito in silicone a 65 ° C per 1 min seguito da 95 ° C per 10 min. Permettono i pezzi raffreddare a temperatura ambiente prima di procedere alla fase successiva. </li><li> Posizionare i soft-cotti pezzi di silicio sul palco esposizione con SU8-2025 rivestito sursulla faccia superiore rivolta verso la lampada UV. Utilizzare la maschera foto con disegno I (L1, Figura 1B) e design II (L2, Figura 1B) per il livello del flusso e lo strato di pattern di controllo rispettivamente per i primi stadi larvali di C. elegans. Posizionare la maschera fotografica sopra dello strato SU8 e garantire la maschera è piatta contro lo strato di rivestimento. Aprire lo sportello della lampada UV ed esporre i soft-forno SU8 wafer a 200 Watt lampada UV attraverso la maschera foto per 15 sec. </li><li> Utilizzare la maschera di foto con disegno I (L1, Figura 1B) e design II (L2, Figura 1B) su SU8-2050 pezzi rivestiti (preparato secondo il punto 1.6) per produrre il livello di flusso e livello di controllo per fine stadi larvali di C. elegans. Utilizzare la maschera foto con il disegno I (L1, Figura 1C) e design II (L2, Figura 1C) per il livello di flusso basale e strato di controllo rispettivamente per Drosophila / zebrafish larve su wafer rivestiti con SU8-2050 (preparato in punto 1.6). Esporre le SU8 superfici attraverso la maschera foto per la lampada UV 200 Watt per 15 sec. </li><li> Posizionare i pezzi di silicio esposti su una piastra calda con lo strato di rivestimento sulla parte superiore. Lasciare cuocere i wafer a 65 ° C per 1 min seguita da 95 ° C per 10 min. Permettono i pezzi raffreddare prima di procedere alla fase successiva. </li><li> Sviluppare i pezzi con il SU8 soluzione di sviluppo per 20 min. Sciacquare i pezzi in Alcole isopropilico (IPA) ed asciugare con gas azoto. </li><li> Posizionare i pezzi di silicio in un essiccatore con il modello SU8 sopra. Rivestire i pezzi con 50 pl di tricholoro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluoroottil) silano vapore in un essiccatore per 2 h. </li></ol> Precauzioni: Prendere misure di sicurezza per la manipolazione dei prodotti chimici durante il trattamento con KOH, rivestimento photoresist e lo sviluppo. Silano rivestimento vapore deve essere eseguita all&#39;interno di un essiccatore in una zona ventilata. Proteggere SU8 resistere da eccessiva esposizione alla luce. Usare occhiali di protezione con un lig UVht sorgente. 2. PDMS Mold Fabrication <ol><li> Preparare 10:01 PDMS combinando 50 g di Sylgard 184 base con 5 g di catalizzatore in una tazza di plastica. Mescolare il contenuto manualmente per ~ 3 min. Degassare la miscela all&#39;interno di un essiccatore per rimuovere tutte le bolle d&#39;aria formatesi durante la miscelazione. </li><li> Versare da 5 mm di spessore miscela PDMS nei wafer di silicio con SU8 modello di progettazione II, per il livello di controllo, delicatamente per evitare la formazione di bolle d&#39;aria. In caso di formazione durante versando, degassare il PDMS sul modello SU8 in basso vuoto per rimuovere tutte le bolle. </li><li> Mettere le fette di silicio con SU8-2025 modello di design che, per il livello di flusso, il mandrino filatore e accendere il vuoto per tenerli. Coprire le cialde con ~ 1 ml di miscela PDMS e coprire le wafer mediante SPIN150 filatore a 500 rpm per 5 sec seguita da 1.500 rpm per 30 sec. </li><li> Coat ~ 1 ml mix PDMS su wafer di silicio con 80 micron SU8-2050 modello di progettazione I (L1, Figura 1B), per lastrato di flusso per fine stadi larvali di C. elegans utilizzando la SPIN150 filatore a 500 rpm per 5 sec seguita da 1.000 rpm per 30 sec. Coat uno spesso strato di miscela PDMS sui pezzi in silicone con SU8-2050 modello di progettazione I flussi strato (L1, Figura 1C) per Drosophila / zebrafish larve, utilizzando SPIN150 filatore a 500 rpm per 35 sec. </li><li> Cuocere i pezzi di silicio PDMS rivestite di progettazione I e II wafer con il disegno corrispondente per il controllo del livello contenente PDMS per C. larve elegans e / o Drosophila / zebrafish in un forno a convezione di aria calda a 50 ° C per 6 ore. </li><li> Tagliare il pezzo PDMS dal substrato di silicio contenente il modello SU8 II C. elegans e / o Drosophila / zebrafish larve con una lama affilata. Effettuare un piccolo foro di circa 1 mm di diametro sulla parte superiore del serbatoio collega la trappola principale nello stampo PDMS utilizzando un perforatore Harris. </li><li> Posizionare il pugno PDMS blocco (che contiene lo stampo 40 micron di spessore per il controllostrato L2) su un vassoio di plastica, con il lato stampato dello strato di controllo verso l&#39;alto. Posizionare il wafer di silicio rivestito PDMS contenente i 40 micron di spessore SU8 che disegno sul vassoio stesso, con la superficie PDMS rivestita rivolta verso l&#39;alto. Inserire il vassoio all&#39;interno della camera di plasma detergente e attivare il vuoto per 2 min. Successivamente, accendere il plasma e abbassare la pressione della camera finché la camera diventa di colore rosa chiaro. Esporre entrambe le superfici a 18 Watt aria plasma sotto vuoto basso per 2 min. </li><li> Posizionare il blocco di un pugno PDMS rimosso dai 80 micron di spessore SU8 master contenente modello II per la fine di stadi larvali di C. larve elegans o Drosophila / zebrafish su un vassoio di plastica, con il lato stampato dello strato di controllo verso l&#39;alto. Posizionare la corrispondente rotazione cotto strato rivestito PDMS sul wafer di silicio contenente 80 micron di spessore motivo ho per dopo C. stadi elegans o Drosophila / zebrafish larve contemporaneamente sullo stesso vassoio con la s rivestito piatto PDMSurface rivolto verso l&#39;alto. Utilizzare lo stesso protocollo di cui sopra per esporli al plasma ad aria. </li><li> Posizionare le due superfici trattate al plasma per C. elegans e / o Drosophila / zebrafish larve con leggera pressione e cuocere in forno a convezione di aria calda a 50 ° C per 2 h. </li><li> Tagliare i dispositivi legati dal substrato di silicio con disegno che SU8 per C. elegans e / o Drosophila / zebrafish larve. Fori di accesso punzone i serbatoi di ingresso e uscita del canale di flusso. </li><li> Mettere lo stampo PDMS incollata su un vassoio di plastica per C. elegans, con il lato stampato del disegno strato flusso rivolto verso l&#39;alto. Clean fodera in vetro (22 X 22 mm, n ° 1 spessore) e posizionarlo sul vassoio di plastica stessa. Inserire il vassoio contenente stampo PDMS e fodera in vetro all&#39;interno della camera di plasma. Esporre la superficie inferiore del dispositivo PDMS e fodera di vetro a 18 Watt plasma di aria a bassa pressione per 2 min. Posizionare le due superfici trattate con plasma genpressione tle e cuocere in forno caldo a convezione d&#39;aria a 50 ° C per 2 ore. </li><li> Conservare il dispositivo in un ambiente pulito per uso futuro. </li></ol> 3. Operazioni aggiuntive per la Drosophila / Zebrafish dispositivo <ol><li> Esporre superficie pulita di vetro di dimensioni 2 cm x 2 cm con 50 pl di tricholoro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluoroottil) silano vapore in un essiccatore per 2 h. </li><li> Spin ~ 1 ml di miscela 10:01 PDMS preparato nella fase 2,1 sulla superficie di vetro silanizzato con SPIN150 filatore a 500 rpm per 35 sec. Cuocere i substrati di vetro rivestite PDMS in un forno ad aria calda a 50 ° C per 6 ore con la superficie rivestita rivolta verso l&#39;alto. Permettere lo strato PDMS raffreddare a temperatura ambiente prima di procedere alla fase successiva. </li><li> Punzone dello strato rivestito con un perforatore personalizzato costruito in metallo affilato al centro del PDMS, per formare lo strato distanziatore PDMS. La forma del metallo perforatore è progettato simile al disegno di flusso per Drosophila / zebrafish (L1, Figura 1C </strong&gt;). </li><li> Esporre il strato distanziatore PDMS e il singolo-bonded blocco (livello di flusso e livello di controllo, fatta allo step 2.9 per Drosophila / zebrafish larve) a 18 Watt al plasma ad aria con filtro plasma a basso vuoto. Posizionare le due superfici trattate insieme plasma e cuocere in forno ad aria calda a 50 ° C per 2 h. </li><li> Tagliare il dispositivo accoppiato dal vetro, fori di accesso punzone i serbatoi di ingresso e uscita e il legame ad un vetrino di vetro (22 X 22 mm, spessore No. 1) usando un detergente plasma come indicato nel passo 2,11. Ciò produrrebbe un dispositivo di immobilizzazione per primo larve instar Drosophila con altezza canale di ~ 500 micron. Per le larve di zebrafish, duplicare il processo distanziatore PDMS strato di fabbricazione con un passo ulteriore legame. Il doppio strato di PDMS-S produce una altezza canale di 900 micron per 30 larve HFP zebrafish. </li></ol> Precauzioni: Evitare di particelle di polvere durante la fabbricazione del dispositivo. Due plasma pulito superficies devono essere completamente priva di polvere per l&#39;incollaggio corretto. Memorizzare i dispositivi in ​​un essiccatore in situazioni in cui una camera pulita speciale non è disponibile per minimizzare l&#39;accumulo di particelle di polvere in dispositivi. 4. Utilizzo di membrana PDMS <ol><li> Collegare un&#39;estremità di un micro-flex tubo (diametro interno ~ 1,6 mm, diametro esterno ~ 4,8 mm) ad una pressione regolatore di alimentazione di gas azoto e l&#39;altra estremità al serbatoio principale trappola attraverso un ago 18 gauge (diametro esterno ~ 1,25 mm) incollati al tubo. Un rubinetto a 3 vie utilizzato al centro del tubo di collegamento consente l&#39;applicazione o il rilascio della pressione sulla membrana. </li><li> Riempire il tubo collegato al dispositivo PDMS con una colonna da 10 cm di acqua distillata prima di collegarlo al serbatoio della trappola principale di un C. elegans e / o Drosophila / zebrafish dispositivo di larve. </li><li> Ruotare la valvola di alimentazione dell&#39;azoto per leggere 14 psi e controllare la membrana della trappola principale deviando verso the canale di flusso a basso ingrandimento di un microscopio invertito. Lunghezza della colonna d&#39;acqua nel micro-flex tubo viene compressa quando il rubinetto a 3 vie è aperta. Bordi della membrana deflesso sono visibili in luce trasmessa (Figura 1I e 1J). Deflessione della membrana provoca lo spostamento delle particelle di polvere / bolle sotto la membrana PDMS e li spinge ai confini di canale. </li><li> Attendere che il liquido riempie il frontale microcanali completamente senza l&#39;aria intrappolata. </li><li> Rilasciare la pressione mediante il rubinetto a 3 vie per rilassare la membrana nella posizione di riposo. </li></ol> 5. Inserimento di C. Le larve elegans, Drosophila e Zebrafish nel dispositivo e Immobilizzare sotto la membrana flessibile PDMS <ol><li> Riempire il canale di flusso con M9 buffer [3 g KH 2 PO 4, 6 g di Na 2 HPO 4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO 4, H 2 O a 1 L, sterilizzare in autoclaving] per C. elegans 18 o 1X PBS [8 g di NaCl, KCl 0,2 g, 1,44 g di Na 2 HPO 4, 0,24 g di KH 2 PO 4, H 2 O a 1 L, sterilizzare in autoclave] per Drosophila / zebrafish 19 larve per 10 minuti prima di esperimento. </li><li> Individuare un unico C. elegans di fase richiesto su un piatto NGM 18 (o primo stadio le larve di Drosophila da piastra di agar uovo o manualmente dechorionated 30 larve di zebrafish hpf in mezzo liquido 20) con un basso stereo microscopio ingrandimento. Scegliere un singolo animale con un piccolo volume di soluzione tampone in una punta micro. Utilizzare una punta micro con la sua estremità tagliate per ospitare grandi la Drosophila o larve zebrafish in tampone. </li><li> Spingere il singolo organismo attraverso l&#39;ingresso canale di flusso. Regolare la pressione di pipettaggio per posizionare il singolo animale sotto la trappola principale. </li><li> Aumentare la pressione della membrana PDMS lentamente per posizionare l&#39;animale contro la chanNel confine e immobilizzarlo con 14 psi di pressione per C. elegans, 7 psi per Drosophila e 3 psi per le larve di zebrafish. </li><li> Posizionare l&#39;animale immobilizzato al centro del campo di vista microscopico. Utilizzare un microscopio invertito con le impostazioni desiderate per il settore alta risoluzione luminoso o imaging di fluorescenza. Acquisizione di immagini singole o fluorescenza time-lapse a frame rate predefinito. </li><li> Rilasciare la pressione trappola e monitorare la locomozione dell&#39;animale per 5-10 min a basso ingrandimento. </li><li> Lavare l&#39;animale e inserire un animale fresco per ripetere i passaggi precedenti. </li><li> Lavare tutti gli animali dalla riserva dei rifiuti con acqua distillata applicato con una siringa. Asciugare il canale premendo aria utilizzando una siringa per il riutilizzo futuro. </li></ol> Precauzioni: Animali che richiedono la pressione pipettaggio superiore al flusso all&#39;interno del canale principale tendono a mostrare scarsa locomozione / salute dopo l&#39;uscita dalla trappola e dovrebbe essere evitato per imaging. Pulire il canale di flusso per ogni traccia di tampone per evitare l&#39;intasamento del canale da cristalli. Se viene utilizzato olio per immagini ad alta risoluzione, pulire il vetrino di vetro per poter mantenere buon rapporto segnale rumore per successivi esperimenti.

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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin-related+gene+unc-104+is+required+for+axonal+transport+of+synaptic+vesicles+in+C.+elegans.">Kinesin-related gene unc-104 is required for axonal transport of synaptic vesicles in C. elegans.</a> Cell. 65, 837-847 (1991).</li><li>Kumar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caenorhabditis+elegans+Kinesin-3+motor+UNC-104/KIF1A+is+degraded+upon+loss+of+specific+binding+to+cargo.">The Caenorhabditis elegans Kinesin-3 motor UNC-104/KIF1A is degraded upon loss of specific binding to cargo.</a> PLoS Genet. 6, e1001200 (2010).</li><li>Ou, G., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+signatures+of+cell+migration+in+C.+elegans+Q+neuroblasts.">Molecular signatures of cell migration in C. elegans Q neuroblasts.</a> J. Cell. Biol. 185, 77-85 (2009).</li><li>Levitan, E. S., Lanni, F., Shakiryanova, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+vesicle+motion+and+release+at+the+Drosophila+neuromuscular+junction.">In vivo imaging of vesicle motion and release at the Drosophila neuromuscular junction.</a> Nat. Protoc. 2, 1117-1125 (2007).</li><li>Morris, R. L., Hollenbeck, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+bidirectional+mitochondrial+transport+is+coordinated+with+axonal+outgrowth.">The regulation of bidirectional mitochondrial transport is coordinated with axonal outgrowth.</a> J. Cell. Sci. 104, 917-927 (1993).</li><li>Louie, K., Russo, G. J., Salkoff, D. B., Wellington, A., Zinsmaier, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+imaging+conditions+on+mitochondrial+transport+and+length+in+larval+motor+axons+of+Drosophila.">Effects of imaging conditions on mitochondrial transport and length in larval motor axons of Drosophila.</a> Comp. Biochem. Physiol. A. Mol. Integr. Physiol. 151, 159-172 (2008).</li><li>Pilling, A. D., Horiuchi, D., Lively, C. M., Saxton, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin-1+and+Dynein+are+the+primary+motors+for+fast+transport+of+mitochondria+in+Drosophila+motor+axons.">Kinesin-1 and Dynein are the primary motors for fast transport of mitochondria in Drosophila motor axons.</a> Mol. Biol. Cell. 17, 2057-2068 (2006).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

PDMS dispositivi microfluidici sono otticamente trasparente, pertanto può essere utilizzata per alta risoluzione immagini in vivo di qualsiasi trasparente / traslucido organismo modello. Il nostro design è adatto per l&#39;alta ingrandimento spazio-temporale di immagini di eventi cellulari e sub-cellulari in intatti animali vivi. Microfabrication con tecniche di litografia soft permette una facile manipolazione delle dimensioni del dispositivo disponibili per varie dimensioni di organismi modello. Dispositivi...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td> Wafer di silicio </td><td> Università di wafer </td><td> 150 mm (100) Mech Grado SSP Si </td><td></td></tr><tr><td> Clewin Software </td><td> WieWeb software </td><td> Versione 2.90 </td><td></td></tr><tr><td> Plotter laser </td><td> Linea Imaging fine </td><td> 65024 DPI </td><td></td></tr><tr><td> HMDS </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 440191-100ML </td><td></td></tr><tr><td> SU8 </td><td> Microchem </td><td> SU8-2025, SU8-2050 </td><td></td></tr><tr><td> Sviluppatore </td><td> Microchem </td><td> SU8 Developer </td><td></td></tr><tr><td> Silano </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 448931-10G </td><td></td></tr><tr><td> PDMS </td><td> Dow corning </td><td> Sylgard 184 </td><td></td></tr><tr><td> Lampada UV </td><td> Finestra sporgente </td><td> 66943 </td><td> 200W Hg Oriel Luce </td></tr><tr><td> Stufa ad aria calda </td><td> Strumenti Ultra </td><td> Una soluzione su misura </td><td> A 50 ° C </td></tr><tr><td> Placca di cottura </td><td> IKA Apparecchiature di laboratorio </td><td> 3810000 </td><td> <a href="http://www.ika.com" target="_blank">http://www.ika.com</a> </td></tr><tr><td> Plasma cleaner </td><td> Harrick Plasma </td><td> PDC-32G </td><td></td></tr><tr><td> Spinner </td><td> Semiconduttore e Sistemi di Produzione </td><td> SPIN150-NPP </td><td> <a href="http://www.SPS-Europe.com" target="_blank">www.sps-Europe.com</a> </td></tr><tr><td> Vetro fodera </td><td> Gold Seal </td><td> 22 X 22 mm, spessore No. 1 </td><td></td></tr><tr><td>C. elegans </td><td> Caenorhabditis Genetics Center (CGC) </td><td> e1265, ayIs4 </td><td></td></tr><tr><td> Drosophila </td><td> Bloomington </td><td> P {} chaGAL4 / cyo, UAS-syt.eGFP </td><td></td></tr><tr><td> Zebrafish </td><td> Indiano wild type </td><td> Tipo selvatico </td><td></td></tr><tr><td> Tygon Tubo </td><td> Sigma </td><td> Z279803 </td><td></td></tr><tr><td> Micro ago </td><td> Sigma </td><td> Z118044 </td><td> Tagliare a pezzi di cm 1 </td></tr><tr><td> Rubinetto a 3 vie </td><td> Sigma </td><td> S7521 </td><td></td></tr><tr><td> Harris puncher </td><td> Sigma </td><td> Z708631 </td><td></td></tr><tr><td> Gas azoto compresso </td><td> Gas locale </td><td></td><td> Utilizzare un regolatore per il controllo della pressione </td></tr><tr><td> Microscopio Stereo &lt;/ Td&gt; <td> Nikon </td><td> SMZ645 </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio confocale </td><td> Andor &amp; Olympus </td><td> Yokogawa filatura disco microscopio confocale </td><td></td></tr><tr><td> ImageJ </td><td> National Institutes of Health </td><td> <a href="http://www.rsbweb.nih.gov/ij" target="_blank">www.rsbweb.nih.gov / IJ</a> </td><td> Basato su Java programma di elaborazione delle immagini </td></tr></tbody></table>

simple microfluidic devices for in vivo imaging of c. elegans, drosophila and zebrafish

Micro dispositivi fabbricati fluidici fornire un micro-ambiente accessibile per gli studi in vivo su piccoli organismi. Processi di fabbricazione semplici sono disponibili per i dispositivi microfluidici che utilizzano tecniche di litografia morbidi 1-3. Dispositivi microfluidici sono stati utilizzati per la sub-cellulare di imaging 4,5, in vivo laser microchirurgia 2,6 e 4,7 di imaging cellulare. In vivo imaging richiede immobilizzazione di microrganismi. Questo è stato ottenuto utilizzando aspirazione 5,8, 6,7,9 canali conici, membrane deformabili 2-4,10, aspirazione con raffreddamento supplementare 5, gas anestetico 11, gel sensibili alla temperatura 12, 13 e colla cianoacrilato anestetici come levamisole 14 , 15. Anestetici comunemente usati influenzare la trasmissione sinaptica 16,17 e sono noti per avere effetti nocivi sulla sub-cellulare 4 Trasporti neuronale. In questa study si dimostra una membrana a base di poli-dimetil-silossano (PDMS), dispositivo che permette di immobilizzazione senza anestetico intatte organismi modello genetiche come Caenorhabditis elegans (C. elegans), larve di Drosophila e larve di zebrafish. Questi organismi modello sono adatti per gli studi in vivo in dispositivi microfluidici causa dei loro diametri piccoli e organismi otticamente trasparenti o traslucide. Diametri del corpo vanno da ~ 10 micron a ~ 800 micron per i primi stadi larvali di C. elegans e zebrafish larve e richiedono dispositivi microfluidici di diverse dimensioni per ottenere l &#39;immobilizzazione completa ad alta risoluzione time-lapse imaging. Questi organismi sono immobilizzati mediante pressione esercitata dal gas azoto compresso attraverso una colonna di liquido e ripreso utilizzando un microscopio invertito. Animali rilasciati dalla trappola tornare alla normale locomozione entro 10 min. Dimostriamo quattro applicazioni di time-lapse imaging in C. elegansvale a dire, il trasporto di imaging mitocondriale nei neuroni, pre-sinaptico di trasporto delle vescicole in un trasporto difettoso-mutante, il trasporto recettori del glutammato e la divisione neuroblasti Q cellulare. I dati ottenuti da questi film mostrano che l&#39;immobilizzazione microfluidica è un mezzo utile e preciso di acquisire dati in vivo di eventi cellulari e sub-cellulari rispetto agli animali anestetizzati (Figura 1J e 3C-F 4). Dimensioni del dispositivo sono state modificate per consentire time-lapse imaging di diverse fasi di C. elegans, Drosophila primo stadio le larve e larve di zebrafish. Trasporto di vescicole contrassegnati con synaptotagmin contrassegnati con GFP (syt.eGFP) nei neuroni sensoriali mostra movimento diretto di marcatori delle vescicole sinaptiche espressi nei neuroni colinergici sensoriali intatte prima larve instar Drosophila. Un dispositivo simile è stato utilizzato per effettuare time-lapse imaging del battito cardiaco in ~ 30 ore dopo la fecondazione (HPF)Zebrafish larve. Questi dati mostrano che i dispositivi semplici che abbiamo sviluppato può essere applicato ad una varietà di sistemi modello per lo studio di fenomeni biologici diversi cellulari e di sviluppo in vivo.

Il dispositivo di immobilizzazione è un blocco bistrato PDMS fabbricato legando due strati: uno strato di flusso (Layer 1) e uno strato di controllo (Layer 2) come mostrato in Figura 1. La trappola principale è collegato ad una bombola di gas azoto attraverso un regolatore ed un rubinetto di arresto a 3 vie per applicare necessaria (3-14 psi) di pressione sulla membrana attraverso una colonna di liquido (Figura 1A). La membrana deviato immobilizza C. larve elegans, Drosop...

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Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

Un semplice dispositivo microfluidico è stato sviluppato per eseguire anestetico libera<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging<em&gt; C. elegans</em&gt;, Intatto<em&gt; Drosophila</em&gt; Larve e larve di zebrafish. Il dispositivo utilizza una membrana deformabile PDMS per immobilizzare questi organismi modello per eseguire lapse imaging tempo di numerosi processi come il battito cardiaco, la divisione cellulare e subcellulare trasporto neuronale. Abbiamo illustrato l&#39;utilizzo di questo dispositivo e mostrano esempi di diversi tipi di dati raccolti da diversi sistemi modello.

Semplici dispositivi microfluidici per<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging di<em&gt; C. elegans</em&gt;,<em&gt; Drosophila</em&gt; E Zebrafish

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are ...

simple-microfluidic-devices-for-vivo-imaging-c-elegans-drosophila

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

17.0K Views.  NCBS-TIFR. Un semplice dispositivo microfluidico è stato sviluppato per eseguire anestetico libera In vivo Imaging C. elegans, Intatto Drosophila Larve e larve di zebrafish. Il dispositivo utilizza una membrana deformabile PDMS per immobilizzare questi organismi modello per eseguire lapse imaging tempo di numerosi processi come il battito cardiaco, la divisione cellulare e subcellulare trasporto neuronale. Abbiamo illustrato l'utiliz...

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Separating Beads and Cells in Multi-channel Microfluidic Devices Using Dielectrophoresis and Laminar Flow

Microfluidic devices have advanced cell studies by providing a dynamic fluidic environment on the scale of the cell for studying, manipulating, sorting and counting cells. However, manipulating the cell within the fluidic domain remains a challenge and requires complicated fabrication protocols for forming valves and electrodes, or demands specialty equipment like optical tweezers. Here, we demonstrate that conventional printed circuit boards (PCB) can be used for the non-contact manipulation of cells by employing dielectrophoresis (DEP) for bead and cell manipulation in laminar flow fields for bioactuation, and for cell and bead separation in multichannel microfluidic devices. First, we present the protocol for assembling the DEP electrodes and microfluidic devices, and preparing the cells for DEP. Then, we characterize the DEP operation with polystyrene beads. Lastly, we show representative results of bead and cell separation in a multichannel microfluidic device. In summary, DEP is an effective method for manipulating particles (beads or cells) within microfluidic devices.

Dielectrophoresis (DEP) is an effective method to manipulate cells. Printed circuit boards (PCB) can provide inexpensive, reusable and effective electrodes for contact-free cell manipulation within microfluidic devices. By combining PDMS-based microfluidic channels with coverslips on PCBs, we demonstrate bead and cell manipulation and separation within multichannel microfluidic devices.

Perle di separazione e celle a multi-canale dispositivi Microfluidic Utilizzando dielettroforesi e flusso laminare

Microfluidic devices have advanced cell studies by providing a dynamic fluidic environment on the scale of the cell for studying, manipulating, sorting ...

Ricerca

Bioingegneria

A Microfluidic Technique to Probe Cell Deformability

Here we detail the design, fabrication, and use of a microfluidic device to evaluate the deformability of a large number of individual cells in an efficient manner. Typically, data for ~102 cells can be acquired within a 1 hr experiment. An automated image analysis program enables efficient post-experiment analysis of image data, enabling processing to be complete within a few hours. Our device geometry is unique in that cells must deform through a series of micron-scale constrictions, thereby enabling the initial deformation and time-dependent relaxation of individual cells to be assayed. The applicability of this method to human promyelocytic leukemia (HL-60) cells is demonstrated. Driving cells to deform through micron-scale constrictions using pressure-driven flow, we observe that human promyelocytic (HL-60) cells momentarily occlude the first constriction for a median time of 9.3 msec before passaging more quickly through the subsequent constrictions with a median transit time of 4.0 msec per constriction. By contrast, all-trans retinoic acid-treated (neutrophil-type) HL-60 cells occlude the first constriction for only 4.3 msec before passaging through the subsequent constrictions with a median transit time of 3.3 msec. This method can provide insight into the viscoelastic nature of cells, and ultimately reveal the molecular origins of this behavior.

We demonstrate a microfluidics-based assay to measure the timescale for cells to transit through a sequence of micron-scale constrictions.

Una tecnica Microfluidic per sondare deformabilità cellulare

Here we detail the design, fabrication, and use of a microfluidic device to evaluate the deformability of a large number of individual cells in an ...

Layer-by-layer Collagen Deposition in Microfluidic Devices for Microtissue Stabilization

Although microfluidics provides exquisite control of the cellular microenvironment, culturing cells within microfluidic devices can be challenging. 3D culture of cells in collagen type I gels helps to stabilize cell morphology and function, which is necessary for creating microfluidic tissue models in microdevices. Translating traditional 3D culture techniques for tissue culture plates to microfluidic devices is often difficult because of the limited channel dimensions. In this method, we describe a technique for modifying native type I collagen to generate polycationic and polyanionic collagen solutions that can be used with layer-by-layer deposition to create ultrathin collagen assemblies on top of cells cultured in microfluidic devices. These thin collagen layers stabilize cell morphology and function, as shown using primary hepatocytes as an example cell, allowing for the long term culture of microtissues in microfluidic devices.

The creation of functional microtissues within microfluidic devices requires the stabilization of cell phenotypes by adapting traditional cell culture techniques to the limited spatial dimensions in microdevices. Modification of collagen allows the layer-by-layer deposition of ultrathin collagen assemblies that can stabilize primary cells, such as hepatocytes, as microfluidic tissue models.

Layer-by-layer collagene Deposizione nel Microfluidic Dispositivi per microtessuto Stabilizzazione

Although microfluidics provides exquisite control of the cellular microenvironment, culturing cells within microfluidic devices can be challenging. 3D ...

Electrotaxis Studies of Lung Cancer Cells using a Multichannel Dual-electric-field Microfluidic Chip

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of physiological dcEF in guiding cell movement during embryo development, cell differentiation, and wound healing has been demonstrated in many studies. By applying microfluidic chips to an electrotaxis assay, the investigation process is shortened and experimental errors are minimized. In recent years, microfluidic devices made of polymeric substances (e.g., polymethylmethacrylate, PMMA, or acrylic) or polydimethylsiloxane (PDMS) have been widely used in studying the responses of cells to electrical stimulation. However, unlike the numerous steps required to fabricate a PDMS device, the simple and rapid construction of the acrylic micro&#64258;uidic chip makes it suitable for both device prototyping and production. Yet none of the reported devices facilitate the efficient study of the simultaneous chemical and dcEF effects on cells. In this report, we describe our design and fabrication of an acrylic-based multichannel dual-electric-field (MDF) chip to investigate the concurrent effect of chemical and electrical stimulation on lung cancer cells. The MDF chip provides eight combinations of electrical/chemical stimulations in a single test. The chip not only greatly shortens the required experimental time but also increases accuracy in electrotaxis studies.

Many microfluidic devices have been developed for use in the study of electrotaxis. Yet, none of these chips allows the efficient study of the simultaneous chemical and electric-field (EF) effects on cells. We developed a polymethylmethacrylate-based device that offers better-controlled coexisting EF and chemical stimulation for use in electrotaxis research.

Electrotaxis Studi di polmone cellule tumorali usando un Multicanale Dual-campo elettrico Microfluidic Chip

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of ...

Using Adhesive Patterning to Construct 3D Paper Microfluidic Devices

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol adhesive through a metal stencil, the overall amount of adhesive used in assembling paper microfluidic devices can be significantly reduced. We show on a simple 4-layer planar paper microfluidic device that the optimal adhesive application technique and device construction style depends heavily on desired performance characteristics. By moderately increasing the overall area of a device, it is possible to dramatically decrease the wicking time and increase device success rates while also reducing the amount of adhesive required to keep the device together. Such adhesive application also causes the adhesive to form semi-permanent bonds instead of permanent bonds between paper layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use. Nonplanar 3D origami devices also benefit from the semi-permanent bonds during folding, as it reduces the likelihood that unrelated faces may accidently stick together. Like planar devices, nonplanar structures see reduced wicking times with patterned adhesive application vs uniformly applied adhesive.

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct 3D paper microfluidic devices. This method of adhesive application forms semi-permanent bonds between layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use and to ease folding complex nonplanar structures.

Utilizzando adesivo Patterning per costruire dispositivi microfluidici di carta 3D

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol ...

Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to entry for non-specialists who would benefit greatly from the ability to develop their own microfluidic devices to address research questions. Particularly lacking has been the open dissemination of protocols related to photolithography, a key step in the development of a replica mold for the manufacture of polydimethylsiloxane (PDMS) devices. While the fabrication of single height silicon masters has been explored extensively in literature, fabrication steps for more complicated photolithography features necessary for many interesting device functionalities (such as feature rounding to make valve structures, multi-height single-mold patterning, or high aspect ratio definition) are often not explicitly outlined. 
Here, we provide a complete protocol for making multilayer microfluidic devices with valves and complex multi-height geometries, tunable for any application. These fabrication procedures are presented in the context of a microfluidic hydrogel bead synthesizer and demonstrate the production of droplets containing polyethylene glycol (PEG diacrylate) and a photoinitiator that can be polymerized into solid beads. This protocol and accompanying discussion provide a foundation of design principles and fabrication methods that enables development of a wide variety of microfluidic devices. The details included here should allow non-specialists to design and fabricate novel devices, thereby bringing a host of recently developed technologies to their most exciting applications in biological laboratories.

Multilayer microfluidic devices often involve the fabrication of master molds with complex geometries for functionality. This article presents a complete protocol for multi-step photolithography with valves and variable height features tunable to any application. As a demonstration, we fabricate a microfluidic droplet generator capable of producing hydrogel beads.

Multi-step altezza variabile fotolitografia per Valvolati multistrato microfluidici Devices

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to ...

Fabrication of Three-dimensional Paper-based Microfluidic Devices for Immunoassays

Paper wicks fluids autonomously due to capillary action. By patterning paper with hydrophobic barriers, the transport of fluids can be controlled and directed within a layer of paper. Moreover, stacking multiple layers of patterned paper creates sophisticated three-dimensional microfluidic networks that can support the development of analytical and bioanalytical assays. Paper-based microfluidic devices are inexpensive, portable, easy to use, and require no external equipment to operate. As a result, they hold great promise as a platform for point-of-care diagnostics. In order to properly evaluate the utility and analytical performance of paper-based devices, suitable methods must be developed to ensure their manufacture is reproducible and at a scale that is appropriate for laboratory settings. In this manuscript, a method to fabricate a general device architecture that can be used for paper-based immunoassays is described. We use a form of additive manufacturing (multi-layer lamination) to prepare devices that comprise multiple layers of patterned paper and patterned adhesive. In addition to demonstrating the proper use of these three-dimensional paper-based microfluidic devices with an immunoassay for human chorionic gonadotropin (hCG), errors in the manufacturing process that may result in device failures are discussed. We expect this approach to manufacturing paper-based devices will find broad utility in the development of analytical applications designed specifically for limited-resource settings.

We detail a method to fabricate three-dimensional paper-based microfluidic devices for use in the development of immunoassays. Our approach to device assembly is a type of multilayer, additive manufacturing. We demonstrate a sandwich immunoassay to provide representative results for these types of paper-based devices.

Fabbricazione di dispositivi microfluidici basati su carta tridimensionale per gli immunodosaggi

Paper wicks fluids autonomously due to capillary action. By patterning paper with hydrophobic barriers, the transport of fluids can be controlled and ...

Polydimethylsiloxane-polycarbonate Microfluidic Devices for Cell Migration Studies Under Perpendicular Chemical and Oxygen Gradients

This paper reports a microfluidic device made of polydimethylsiloxane (PDMS) with an embedded polycarbonate (PC) thin film to study cell migration under combinations of chemical and oxygen gradients. Both chemical and oxygen gradients can greatly affect cell migration in vivo; however, due to technical limitations, very little research has been performed to investigate their effects in vitro. The device developed in this research takes advantage of a series of serpentine-shaped channels to generate the desired chemical gradients and exploits a spatially confined chemical reaction method for oxygen gradient generation. The directions of the chemical and oxygen gradients are perpendicular to each other to enable straightforward migration result interpretation. In order to efficiently generate the oxygen gradients with minimal chemical consumption, the embedded PC thin film is utilized as a gas diffusion barrier. The developed microfluidic device can be actuated by syringe pumps and placed into a conventional cell incubator during cell migration experiments to allow for setup simplification and optimized cell culture conditions. In cell experiments, we used the device to study migrations of adenocarcinomic human alveolar basal epithelial cells, A549, under combinations of chemokine (stromal cell-derived factor, SDF-1&#945;) and oxygen gradients. The experimental results show that the device can stably generate perpendicular chemokine and oxygen gradients and is compatible with cells. The migration study results indicate that oxygen gradients may play an essential role in guiding cell migration, and cellular behavior under combinations of gradients cannot be predicted from those under single gradients. The device provides a powerful and practical tool for researchers to study interactions between chemical and oxygen gradients in cell culture, which can promote better cell migration studies in more in vivo-like microenvironments.

The control of chemical and oxygen gradients is essential for cell cultures. This paper reports a polydimethylsiloxane-polycarbonate (PDMS-PC) microfluidic device capable of reliably generating combinations of chemical and oxygen gradients for cell migration studies, which can be practically utilized in biological labs without sophisticated instrumentation.

Polidimetilsilossano-policarbonato dispositivi microfluidici per Cell Migration Studies Sotto perpendicolare chimica e gradienti di ossigeno

This paper reports a microfluidic device made of polydimethylsiloxane (PDMS) with an embedded polycarbonate (PC) thin film to study cell migration under ...

A Simple and Scalable Fabrication Method for Organic Electronic Devices on Textiles

Today, wearable electronics devices combine a large variety of functional, stretchable, and flexible technologies. However, in many cases, these devices cannot be worn under everyday conditions. Therefore, textiles are commonly considered the best substrate to accommodate electronic devices in wearable use. In this paper, we describe how to selectively pattern organic electroactive materials on textiles from a solution in an easy and scalable manner. This versatile deposition technique enables the fabrication of wearable organic electronic devices on clothes.

In this paper, we present a protocol to selectively deposit organic materials on textiles, which allows for the direct integration of organic electronic devices with wearables. The fabricated devices can be fully integrated in textiles, respecting their mechanical appearance and enabling sensing capabilities.

Un metodo semplice e scalabile di fabbricazione per dispositivi elettronici organici sui tessili

Today, wearable electronics devices combine a large variety of functional, stretchable, and flexible technologies. However, in many cases, these devices ...

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved useful as a convenient live imaging platform providing capabilities for precise control of experimental conditions in real time. In this article, we demonstrate live imaging of individual worms employing WormSpa, a previously-published custom microfluidic device. In the device, multiple worms are individually confined to separate chambers, allowing multiplexed longitudinal surveillance of various biological processes. To illustrate the capability, we performed proof-of-principle experiments in which worms were infected in the device with pathogenic bacteria, and the dynamics of expression of immune response genes and egg laying were monitored continuously in individual animals. The simple design and operation of this device make it suitable for users with no previous experience with microfluidic-based experiments. We propose that this approach will be useful for many researchers interested in longitudinal observations of biological processes under well-defined conditions.

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

In this article, we demonstrate live imaging of individual worms employing a custom microfluidic device. In the device, multiple worms are individually confined to separate chambers, allowing multiplexed longitudinal surveillance of various biological processes.

Una piattaforma microfluidica per Imaging longitudinale in Caenorhabditis elegans

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved ...