Drs. CJP Grimmelikhuijzen e Michael Williamson presso l&#39;Università di Copenaghen (Danimarca) sono apprezzati per fornire le aequorina plasmide. Il nostro collaboratore, il dottor Ronald J. Nachman da USDA-ARS (TX, USA), è riconosciuto per la sintesi di peptidi e per fornire il lettore di piastre Novostar.

1. Creazione di linee cellulari stabili <ol><li> Clonare il vostro GPCR di interesse e inserirlo in un vettore di espressione che incorpora un 5 &#39;sequenza consenso Kozak (AMCC / GCCATGG) intorno al codone di inizio per la ottimale legame ribosomiale in un sistema di mammifero (Kozak, 1986). Qui usiamo il pcDNA3.1/Bm-KR plasmide per il recettore zecca chinina, e il plasmide pcDNA3.1/Aedae-KR per il recettore zanzara chinina (Holmes et al, 2003;. Pietrantonio et al, 2005).. Il pcDNA3.1 (-) vettore codifica resistenza all&#39;ampicillina per la selezione di batteri e neomicina (G418) resistenza per la selezione in cellule di mammifero. </li><li> Crescere CHO-K1 celle vuote (senza plasmidi) (ATCC, Manassas, VA, USA) o altri linea cellulare desiderato in un T-25 pallone (BD Falcon) a 37 ° C in un 5% di CO 2 umidificata incubatore (Holmes et al ., 2003). Tutte le incubazioni più dovrebbe essere fatto in queste condizioni se non diversamente specificato. Mantenere le celle vuote nel mezzo di crescita (media F12K con il 10% di siero fetale bovino) con 1X antibiotici Antimicotici (Invitrogen, CA). </li><li> Per dividere le celle, riscaldare tutte le soluzioni a 37 ° C. Rimuovere vecchi media nel T-25 pallone e lavare con 5 ml di PBS e quindi rimuovere PBS. Per trypsinize cellule, aggiungere 2 ml di PBS-tripsina-EDTA (34 ml di PBS, 2 ml di bicarbonato di sodio 7,5%, 4 ml 10X tripsina-EDTA) per 2 min. Aggiungere 3 ml di mezzo e aspirare media su e giù per miscelare cellule. Trasferimento di media con le cellule in una provetta conica e centrifugare per 2 min a ~ 200-300 g (1.000 rpm). Gettare il surnatante e risospendere le cellule in 5 ml di mezzo. Diluire le cellule risospese ad una concentrazione di 1:5 o 1:10 con terreno fresco e trasferire 5 ml in una nuova T-25 pallone. </li><li> Dopo che le cellule crescono sani (circa 2-3 giorni), il seme CHO-K1 cellule in fiasche tessuto T-25 cultura e farle crescere durante la notte nel mezzo di crescita senza antibiotici fino a circa il 30% confluenti (circa 18 ore). Il grado di confluenza può essere determinato dalle cellule sotto osservazione invertita microscopia a fluorescenza. </li><li> Preparare le miscele seguenti per ogni campione: <ol><li> Combina 1-2 DNA mcg (esempio: 4μl uso di 265μg/μl pcDNA3.1/Aedae-KR) con 100 l Opti-MEM ho ridotto Media siero (Invitrogen). </li><li> Mix 6 Reattivo microlitri Lipofectin (InvitrogenTM) in 100 l di media F12K siero libero, facendo un rapporto 1:1 di Lipofectin al DNA. Incubare a temperatura ambiente per 30-45 min. </li></ol> Mescolare delicatamente le soluzioni da 1.5.1 a 1.5.2 in una goccia a goccia moda (volume totale = 200 mL). Lasciare riposare a temperatura ambiente per 10-15 min. </li><li> Rimuovere il supporto di vecchia crescita dalle cellule e lavare le cellule con 5 ml di mezzo F12K siero libero e poi rimuovere il supporto di F12K siero libero. In un tubo da 15 ml, mescolare delicatamente la miscela di trasfezione in 1,8 ml di medium F12K fresco in un goccia a goccia moda. Allora, lavate le cellule dal punto 1.5 con PBS e aggiungere questa nuova soluzione di trasfezione per le cellule. Incubare per 18 ore. </li><li> Modificare il medio F12K medio più il 10% di siero fetale bovino senza antibiotici e incubare una notte. Dividere le celle in due T-25 palloni di media F12K più il 10% di siero fetale bovino senza antibiotici per altre 18 ore (per la divisione delle celle si prega di vedere il punto 1.3). </li><li> Sostituire la media con terreno selettivo (media F12K più 10% di siero fetale bovino con 800μg/ml GENETICIN, Invitrogen). Coltura le cellule utilizzando il terreno selettivo per 3-4 settimane. Nel corso del tempo questo selezionerà per le cellule che hanno incorporato il plasmide stabilmente nel loro DNA genomico. Continuare a mantenere le cellule utilizzando terreno di mantenimento (media F12K più 10% di siero fetale bovino con 400μg/ml GENETICIN). Periodicamente congelare linee cellulari con rapporto 1:1 dei supporti di congelamento (terreno selettivo con il 20% DMSO) per evitare che perde in caso di contaminazione inattese. </li><li> Selezione clonale linee cellulari: in una prima fase, trypsinize e centrifugare le cellule a partire dal punto 1.8 con terreno di mantenimento come al punto 1.3. Risospendere le cellule in 5 ml di mezzo di manutenzione, prendere 0,5 ml della cellula sospendere e aggiungere 4,5 ml di terreno di mantenimento fresca per fare una diluizione 10x. Trasferire la diluizione 10x in 12 pozzetti di una piastra 96 ​​pozzetti, aggiungendo 100 l in ciascun pozzetto di selezionare per le singole cellule. </li><li> Continuare a fare 10x diluizioni seriali di queste cellule per una sospensione teorica finale di una cella per 100 l (di solito la diluizione finale sarà nel range di 10 -11 e 10 -19; il numero totale di 10x diluizioni seriali è ~ 19) . Subito dopo ogni diluizione, trasferire 100 ul della diluizione in 12 pozzetti della piastra 96 ​​pozzetti. Dopo 18 ore di incubazione, osservare Piastre a 96 pozzetti sotto una luce invertito o pozzi microscopio a fluorescenza e marchio che sembrano contenere solo una singola cella o contenere due celle che, ovviamente, divisi da una sola cellula. Mantenere l&#39;osservanza di ogni giorno e medie cambiano ogni tre giorni. </li><li> Quando i pozzi sono 80% confluENT (circa una settimana), lavare i pozzi contrassegnati con 200 l di PBS e trypsinize con 100 l di PBS-tripsina-EDTA soluzione. Cellule trasferimento da ciascuno segnato anche in un pozzetto di un 6-pozzetti con 1 ml di mezzo di manutenzione. Crescere queste cellule per 3 giorni poi trasferire le cellule in singoli T25 pallone. Test di queste cellule mediante il test bioluminescenza calcio con peptidi agonisti (vedere la sezione 2). </li><li> Selezionare 1 linea cellulare da 1,11 passo con la più alta risposta al saggio di bioluminescenza piatto di calcio e di eseguire per la seconda volta la singola cellula seguenti passaggi selezione 1,9-1,11. Periodicamente congelare linee cellulari. </li><li> Dalla selezione secondario descritto al punto 1.12, scegliere 2-3 linee cellulari con la più alta risposta nel saggio piatto calcio bioluminescenza e mantenerli in coltura per ulteriori test calcio bioluminescenza piatto. Tenere traccia dei numeri passaggio. Di tanto in tanto, congelare linee cellulari da primi passaggi in modo che si può sempre tornare indietro a loro se le linee cellulari con più passaggi fermare l&#39;esecuzione in modo coerente. </li></ol> 2. Il calcio bioluminescenza saggio piatto <ol><li> Legare il gene reporter di interesse in un vettore di espressione. Qui abbiamo usato mtAEQ/pcDNA1 plasmide aequorina (un dono di Drs. CJP Grimmelikhuijzen e Michael Williamson, Università di Copenhagen, Danimarca). Trasformare il plasmide in E. coli MC1061/PS (Invitrogen) e purificare usando un QIAprep giro miniprep kit (Qiagen Inc.). Nella fase finale eluire il plasmide con Tris buffer senza EDTA, non l&#39;acqua. </li><li> Crescono linee cellulari a partire dal punto che esprimono il recettore 1,13 desiderato in terreno di mantenimento. Quando le cellule sono il 90% confluenti, trypsinize, centrifuga e poi ri-sospendere le cellule in 5 ml di terreno di mantenimento come al punto 1.3. Diluire le cellule (circa 10x con terreno di mantenimento) e contare il numero di cellule con cellule contatore (Bright-line emocitometro) al microscopio. Regolare il numero di cellulare di circa 2 x 10 5 cellule / ml (media 20 celle in uno dei 9 quadrati mostrato nel emocitometro). Seed 2 celle ml diluito in media in ciascun pozzetto di una piastra ben sei. Incubare per 24 ore (le cellule dovrebbe raggiungere circa il 60% dopo la confluenza di incubazione). </li><li> Cambiare supporto nella piastra 6 pozzi a OPTI-MEM medium. Per ogni bene, mescolare 96 microlitri OPTI-MEM con 4 microlitri FuGENE 6 reagente Transfection (Biochemicals Roche) in una provetta per microcentrifuga e lasciate riposare a temperatura ambiente per 5 min. Aggiungere 1 mg di aequorina / pcDNA 1 DNA plasmidico in ciascuna provetta e poi delicatamente agitare il campione per 1 min, incubare a temperatura ambiente per 15-20 minuti. Aggiungi ciascuna miscela in ciascun pozzetto in modo goccia a goccia, mentre scuotendo leggermente la piastra bene. Incubare le piastre per 6 ore e mezzo per cambiare il F12K terreno contenente 10% di siero fetale bovino senza antibiotico. </li><li> Dopo aver incubato le cellule in sei pozzetti per 24 ore, trypsinize, centrifuga e risospendere le cellule come punto 1.3. Contare il numero di cellulare a 400.000 cellule / ml come passo 2.1 e trasferire 100 ul (totale 40.000 cells/100 microlitri) in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti fondo bianco sottile microtitolazione (Costar 3610). Incubare per altre 24 ore fino a circa l&#39;80% confluenza delle cellule. Questa è la concentrazione ottimale di cellule per l&#39;analisi bioluminescenza. </li><li> Preparare 90μl/well di un calcio senza mezzi DMEM (Invitrogen) contenente 5 coelenterazine mM (Invitrogen) al buio (coelenterazine è sensibile alla luce). Prendete il piatto da 2,4, rimuovere i supporti vecchi e aggiungere questo 90μl in ciascun pozzetto. Incubare le piastre per 3 ore al buio a 37 ° C e 5% di CO 2, dopo che le cellule nella piastra sono pronti per essere testati. </li></ol> 3. Strumento funzionamento e l&#39;analisi dei dati <ol><li> Ogni lettore di piastre bioluminescenza è diverso. Realizziamo i nostri test con un (Labtechnologies BMG) lettore di piastre Novostar in modalità bioluminensence. Se si utilizza uno strumento diverso, è necessario adattare il protocollo. </li><li> Purge le pompe piastra lettore (o POMPE PRIME) prima dell&#39;uso. Spegnere la luce nella stanza prima di mettere la piastra sul portatarga. Una volta che il portatarga ha chiuso, accendere le luci. </li><li> Solubilizzare peptidi (in un tubo Eppendorf da 1,5 ml) nel calcio senza mezzi DMEM. Impostare la &quot;Profondità Aspirare&quot; e &quot;Determinazione di posizione&quot; della soluzione di peptide prima dell&#39;uso. Sfida le cellule con 10 microlitri (10x) di concentrazioni variabili dei peptidi (FFFSWG-NH2, Aedes-K1-3, o altro peptide desiderato) e immediatamente iniziare a registrare l&#39;emissione luminosa. Abbiamo impostato lo strumento per registrare l&#39;emissione di luce (465 nm) per ogni bene ogni 2 secondi per un tempo totale di 50 secondi. </li><li> Assicurati di includere un controllo positivo, come un attivo analogico (analogico FFFSWGa è stato utilizzato, Taneja-Bageshwar et al., 2009) e un controllo negativo come le cellule trasfettate solo vettore. Il controllo negativo sarà necessario durante l&#39;analisi dei dati per impostare la soglia di riferimento (vedi risultati rappresentativi).Un estraneo, peptide inattivo può anche essere aggiunto come controllo negativo. </li><li> Dopo la corsa è terminata, lavare la pompa strumento (o POMPE PRIME) e poi inserire il vostro campione successivo peptide. Salvare i dati e lavare le pompe di nuovo. </li><li> Il trattamento dei dati: Trasferire i dati di emissione di luce da ogni bene in un foglio dati di Microsoft Excel. </li><li> Incollare i dati da Excel a software Prism 4.0 da GraphPad Software Inc. (San Diego, CA, USA). Le concentrazioni di peptide vari è l&#39;asse X e unità bioluminescenza è l&#39;asse Y. Per normalizzare i dati, la trama di un registro curva di risposta. Selezionare una curva di analisi di regressione lineare in forma (sigmoidale dose-risposta equazione con pendenza variabile) per ottenere curve concentrazione-risposta per ciascun peptide. Il programma traccia i valori, alla fine, e dà la CE 50. </li><li> Ogni esperimento deve essere ripetuto tre volte per l&#39;analisi dei dati. </li></ol> 4. Rappresentante dei risultati: Quando espressa in cellule CHO-K1, la zanzara Aedes aegypti recettore chinina si è comportato come un recettore multiligand e funzionalmente risposto a concentrazioni fino a 1 nM del endogenours tre Aedes chinine, Aedae chinine 1-3, testato singolarmente usando la bioluminescenza saggio di calcio piastra . La Figura 1 mostra che l&#39;ordine rango di potenza è stato ottenuto Aedae-K-3&gt; Aedae-K-2&gt; Aedae-K-1, sulla base dei rispettivi valori di EC 50 Aedae-K-3, 16.04 nM; Aedae-K- 2, 26,6 nM e Aedae-K-1, 48,85 nM, che sono state differenze statisticamente significative (P &lt;0,05) (Pietrantonio et al., 2005). Abbiamo anche usato questo test per determinare quali residui di chinina sono fondamentali per la chinina peptide-recettore. Insetti peptidi chinina condividere un C-terminale pentapeptide che rappresenta la sequenza di minimi necessari per l&#39;attività biologica, noto anche come nucleo. Nella tabella 1, la chinina analoghi nucleo peptidi sono stati sintetizzati come una serie sostituzione Alanina della chinina nucleo pentapeptide FFSWGa e testato da un test piastra di calcio bioluminescenza (Taneja-Bageshwar et al., 2006). Abbiamo scoperto che gli aminoacidi Phe Trp 1 e 4 sono stati essenziali per l&#39;attività delle chinine insetti per entrambi i recettori. Il test può anche essere utilizzato per testare peptidi progettato per biostabilità migliorata. La tabella 2 mostra gli analoghi progettato chinina contenenti aminoacidi isobutirrico (Aib), testato sul recettore tick ricombinante chinine e la Figura 2 mostra il confronto l&#39;attività di sei alfa-amino acido isobutirrico analoghi sul recettore chinina tick esprimere CHO-K1 linea cellulare da un calcio bioluminescenza saggio piastra (Taneja-Bageshwar et al., 2009). Il esapeptide analogico FFFSWGa è aggiunto per un controllo positivo per l&#39;attività del recettore. L&#39;analogo FF [Aib] WGA portato più attivi di questo controllo analogico esapeptide. L&#39;analogo con due sostituzioni acido aminoisobutyric, [Aib] FF [Aib] WGA, è stato il più potente della doppia sostituzione analoghi testate (Tabella 2 e Figura 2). Per ulteriori esempi di come questo saggio è stata e può essere applicato vedere Nachman e Pietantonio (2010), Nachman et al. (2009), Taneja-Bageshwar et al. (2008a), e Taneja-Bageshwar et al. (2008b). <img src="/files/ftp_upload/2732/2732fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Stima di Aedes chinine concentrazione efficace (CE 50) su cellule CHO-K1 E10 da un calcio-bioluminescenza saggio piatto. L&#39;asse y nel curve concentrazione-risposta è stato ottenuto da unità di bioluminescenza, espressa in percentuale della risposta massima osservata per ogni peptide. Punti dati rappresentano la media di sei repliche ottenute nel corso di tre esperimenti indipendenti. Barre rappresentano l&#39;errore standard. (A) Stima della Aedae-K1 EC 50 = 48 nM. (B) Stima del Aedae-K2 EC 50 = 26 nM. (C) Stima del Aedae-K3 EC 50 = 16 nM. EC 50 Aedae-K3 &lt;EC 50 Aedae-K2 &lt;EC 50 Aedae-K1, p &lt;0,05. Analisi statistiche e grafici sono stati con il software Prism GraphPad 4.0. <img src="/files/ftp_upload/2732/2732fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Confronto l&#39;attività di sei alfa-amino acido isobutirrico analoghi sul recettore tick kinin esprimere CHO-K1 linea cellulare da un saggio di piatto calcio bioluminescenza. L&#39;asse y rappresenta la massima unità di bioluminescenza per cento per ogni analogico espressa in percentuale di bioluminescenza osservato una concentrazione rispetto alla risposta massima osservata tra tutte le concentrazioni testate per ciascun analogico. Analisi statistiche e grafici sono stati eseguiti con il software Prism GraphPad 4.0. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td colspan="2"> Tick ​​linea cellulare del recettore </td><td colspan="2"> Mosquito recettore linea cellulare </td></tr&gt; <tr><td> Peptidi </td><td> CE 50 (nM) </td><td > Bioluminescenza risposta massima di 1 mm </td><td> CE 50 (nM) </td><td> Bioluminescenza risposta massima di 1 mm </td></tr><tr><td> AFSWGa </td><td> Io </td><td> Io </td><td> Io </td><td> Io </td></tr><tr><td> FASWGa </td><td> 586 </td><td> 5600 </td><td> ND </td><td> 400 </td></tr><tr><td> FFAWGa </td><td> 64 </td><td> 12.800 </td><td> 621 </td><td> 3050 </td></tr><tr><td> FFSAGa </td><td> Io </td><td> Io </td><td> Io </td><td> Io </td></tr><tr><td> FFSWAa </td><td> 417 </td><td> 10.600 </td><td> 2800 </td><td> 1830 </td></tr><tr><td> FFSWGa </td><td> 590 </td><td> 10.800 </td><td> ND </td><td> 525 </td></tr><tr><td> FSWGa </td><td> Io </td><td> Io </td><td> Io </td><td> Io </td></tr><tr><td> FFSWa </td><td> Io </td><td> Io </td><td> Io </td><td> Io </td></tr><tr><td> FFSWG-OH </td><td> Io </td><td> Io </td><td> Io </td><td> Io </td></tr><tr><td> FFFSWGa </td><td> 259 </td><td> 13.000 </td><td> 562 </td><td> 10.000 </td></tr><tr><td> FF [Aib] WGA </td><td> 29 </td><td> 12.700 </td><td> 445 </td><td> 9300 </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Potenze stimato (CE 50) e la risposta bioluminescenza massima di tutti i peptidi testati su zecche e zanzare linee cellulari transfettate recettore *. * L&#39;EC 50 stime la concentrazione necessaria per indurre una mezza massima risposta. I: inattivo se la risposta bioluminescenza è inferiore a 300 unità (livello del vettore solo cellule transfettate). R: La posizione in cui il residuo corrispondente nella FFSWGa peptide è stato sostituito da alanina. ND: L&#39;analogico è stato testato, ma era o non era molto attivo o non attivo a basse molarità, quindi un EC50 non può essere determinato. <table border="1"><tbody><tr><td> K-Aib-1 </td><td> [Aib] FF [Aib] WGA </td></tr><tr><td> K-Aib-2 </td><td> [Α MEF] FF [Aib] WGA </td></tr><tr><td> K-Aib-3 </td><td> Ac-R [Aib] FF [Aib] WGA </td></tr><tr><td> K-Aib-4 </td><td> Ac-R [β3F] FF [Aib] WGA </td></tr><tr><td> K-Aib-5 </td><td> [Aib] RFF [Aib] WGA </td></tr><tr><td> K-Aib-6 </td><td> [Aib-Aib-Aib-Aib] RFF [Aib] WGA </td></tr></tbody></table> Tabella 2. Chinina analoghi (K) che contiene aminoacidi isobutirrico (Aib), testato sul recettore tick ricombinante chinina. Ac: acetil; α me: α metil-fenilalanina; β3F: β3-fenilalanina, un: ammide.

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	<li>Kozak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+5'-noncoding+sequences+from+699+vertebrate+messenger+RNAs.">An analysis of 5'-noncoding sequences from 699 vertebrate messenger RNAs.</a> Nucleic Acids Research. 15, 8125-8148 (1987).</li><li>Nachman, R., Pietrantonio, P. V., Geary, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+mimetic+analogs+of+insect+kinin+neuropeptides+with+arthropod+receptors.">Interaction of mimetic analogs of insect kinin neuropeptides with arthropod receptors.</a> Neuropeptide systems as Targets for Parasite and Pest Control. , (2010).</li><li>Nachman, R. J., Pietrantonio, P. V., Coast, G. 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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Siamo stati in grado di eseguire la caratterizzazione funzionale del recettore del neuropeptide scoperto dal Aracnidi (zecche, acari e ragni), il recettore chinina zecca, con questo protocollo. Questo metodo ha tre applicazioni principali. In primo luogo, la tecnica può essere applicata per deorphanization recettore attraverso misurazioni dell&#39;attività ligando. In secondo luogo, il test può risolvere ligando-recettore relazioni struttura-attività (SAR). In terzo luogo, i metodi possono essere utilizzati nella scoperta della droga. Inoltre, questo protocollo può essere usato per studiare l&#39;attività di agonisti o antagonisti su quasi tutti i GPCR. Stiamo cominciando ad adattare questo protocollo per lo screening di librerie di piccole dimensioni. La linea cellulare abbiamo utilizzato non esprime la proteina onnipresente G G 16. Non abbiamo bisogno perché artropodi recettori chinina segnale attraverso le proteine ​​Gq e la cascata di calcio intracellulare e conservano questa proprietà di segnalazione in cellule di mammifero come mostrato qui.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti (opzionale) </th></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> ABCD1234 </td><td></td></tr><tr><td> Cellule CHO-K1 </td><td> ATCC </td><td> CCL-61 </td><td> Manassas, VA, USA </td></tr><tr><td> F12K media </td><td> Invitrogen </td><td> 21127 </td><td></td></tr><tr><td> Siero bovino fetale </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F0643 </td><td></td></tr><tr><td> Tripsina-EDTA (10x) </td><td> Invitrogen </td><td> 15400 </td><td></td></tr><tr><td> Antibiotico-Antimicotici </td><td> Invitrogen </td><td> 15240 </td><td></td></tr><tr><td> Opti-MEM ho ridotto Media siero </td><td> Invitrogen </td><td> 31985 </td><td></td></tr><tr><td> Reattivo Lipofectin </td><td> Invitrogen </td><td> 18292-011 </td><td></td></tr><tr><td> GENETICIN </td><td> Invitrogen </td><td> 10131035 </td><td></td></tr><tr><td> MC1061/P3 Ultracomp </td><td> Invitrogen </td><td> C663-03 </td><td></td></tr><tr><td> QIAprep rotazione miniprep kit </td><td> Qiagen Inc. </td><td> 19064 </td><td></td></tr><tr><td> FuGENE 6 Transfection reagente </td><td> Roche </td><td> 11 814 443 001 </td><td></td></tr><tr><td> 96-bene bianco sottile piastra inferiore microtitere </td><td> Co-star </td><td> 3610 </td><td></td></tr><tr><td> calcio senza mezzi DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 21068 </td><td></td></tr><tr><td> Coelenterazine </td><td> Invitrogen </td><td> C-2944 </td><td></td></tr><tr><td> Bright-line emocitometro </td><td> Hausser scientifico </td><td></td><td> Horsham, PA </td></tr><tr><td> Novostar </td><td> BMG Labtechnologies </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Prism software 4.0 </td><td> GraphPad Software Inc. </td><td></td><td> San Diego, CA, USA </td></tr><tr><td> T-25 e T-75 fiasche </td><td> BD Falcon </td><td> 353014 e 353135 </td><td></td></tr></tbody></table>

a calcium bioluminescence assay for functional analysis of mosquito (aedes aegypti) and tick (rhipicephalus microplus) g protein-coupled receptors

Recettori ormonali artropodi sono potenziali obiettivi per i pesticidi romanzo come si regolano molti processi fisiologici e comportamentali indispensabili. La maggior parte di essi appartengono alla superfamiglia delle proteine ​​G recettori accoppiati (GPCR). Ci siamo concentrati sulla caratterizzazione artropodi recettori chinina da zecche e zanzare. Chinine artropodi sono neuropeptidi polifunzionale con myotropic, diuretico, e la funzione dei neurotrasmettitori. Qui, un metodo per l&#39;analisi sistematica delle relazioni struttura-attività di chinine insetti su due eterologa chinina che esprimono i recettori sistemi è descritto. Forniamo informazioni importanti per lo sviluppo di analoghi biostabile chinina con la possibilità di interrompere il diuretico, myotropic, e / o processi digestivi a zecche e zanzare. I recettori chinina dalla zecca del sud bestiame, Boophilus Microplus (Canestrini), e la zanzara Aedes aegypti (Linneo), sono stati stabilmente espressi nella linea cellulare di mammifero CHO-K1. Analisi funzionale di questi recettori sono stati completati con un saggio di bioluminescenza calcio piastra che misura bioluminescenza per determinare i livelli intracellulari di calcio citoplasmatico su richiesta peptide a queste cellule ricombinanti. Questo metodo sfrutta la proteina aequorina, un fotoproteine ​​isolato da meduse luminescenti. Noi trasfettate transitoriamente la aequorina plasmide (mtAEQ/pcDNA1) in linee cellulari che stabilmente espresso i recettori chinina. Queste cellule sono poi trattate con il coelenterazine cofattore, che complessi con aequorina intracellulare. Rompe questo legame, in presenza di calcio, che emettono i livelli di luminescenza indicativo della concentrazione di calcio. Come il recettore chinina segnali attraverso il rilascio di calcio intracellulare, l&#39;intensità del segnale è legato alla potenza del peptide. Questo protocollo è una sintesi di diversi protocolli precedentemente descritti, con modificazioni, presenta passo-passo le istruzioni per l&#39;espressione stabile di GPCR in una linea cellulare di mammifero attraverso saggi piastra funzionale (Staubly et al, 2002 e Scuderie et al, 1997.. ). Utilizzando questa metodologia, siamo stati in grado di stabilire linee cellulari stabili che esprimono la zanzara ei recettori zecca chinina, confrontare la potenza di tre chinine zanzara, identificare critica posizioni di aminoacidi per il ligando-recettore, ed eseguire semi-throughput screening di un peptide biblioteca. Perché chinine insetti sono sensibili alla rapida degradazione enzimatica da parte di peptidasi endogene, sono fortemente limitate in uso come strumenti per il controllo dei parassiti o studi endocrinologici. Pertanto, abbiamo provato anche gli analoghi chinina amminoacido isobutirrico (Aib) per migliorare la loro potenza e biostabilità. Questo peptidasi-resistente analogica rappresenta una guida importante per lo sviluppo di analoghi biostabile chinine insetti e può contribuire allo sviluppo di strategie di artropodi neuropeptide controllo basato su.

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A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito Aedes aegypti and Tick Rhipicephalus microplus G Protein-coupled Receptors

Questo protocollo fornisce le istruzioni per la selezione clonale di cellule di linea e un saggio di bioluminescenza di calcio per analizzare la struttura-attività di sintetizzata neuropeptidi artropodi sul loro affini GPCR. Questo test può essere utilizzato per deorphanization recettore e struttura-attività degli studi rapporto di sintesi per la progettazione analogica e peptide / farmaco-lead scoperta.

Un saggio di calcio bioluminescenza di analisi funzionale del Mosquito ( Aedes aegypti) E Tick ( Rhipicephalus Microplus) G recettori accoppiati alla proteina

Arthropod hormone receptors are potential targets for novel pesticides as they regulate many essential physiological and behavioral processes.  The ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito (Aedes aegypti) and Tick (Rhipicephalus microplus) G Protein-coupled Receptors

15.5K Views.  Texas A&M University (TAMU). Questo protocollo fornisce le istruzioni per la selezione clonale di cellule di linea e un saggio di bioluminescenza di calcio per analizzare la struttura-attività di sintetizzata neuropeptidi artropodi sul loro affini GPCR. Questo test può essere utilizzato per deorphanization recettore e struttura-attività degli studi rapporto di sintesi per la progettazione analogica e peptide / farmaco-lead scoperta.

Video: A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito Aedes aegypti and Tick Rhipicephalus microplus G Protein-coupled Receptors

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

Mosquitoes are vectors for a number of disease-causing pathogens such as the yellow fever virus, malaria parasites and filarial worms. Laboratories are investigating anti-pathogen components of the innate immune system in disease vector species in the hopes of generating transgenic mosquitoes that are refractory to such pathogens1, 2. The innate immune system of mosquitoes consists of several lines of defense 3. Pathogens that manage to escape the barrier imposed by the epithelium-lined mosquito midgut 4 enter the hemolymph and encounter circulating hemocytes, important cellular components that encapsulate and engulf pathogens 5, 6. Researchers have not found evidence for hematopoietic tissues in mosquitoes and current evidence suggests that the number of hemocytes is fixed at adult emergence and numbers may actually decline as the mosquito ages 7. The ability to properly collect and identify hemocytes from medically important insects is an essential step for studies in cellular immunity. However, the small size of mosquitoes and the limited volume of hemolymph pose a challenge to collecting immune cells. 
Two established methods for collecting mosquito hemocytes include expulsion of hemolymph from a cut proboscis 8, and volume displacement (perfusion), in which saline is injected into the membranous necklike region between the head and thorax (i.e., cervix) and the perfused hemolymph is collected from a torn opening in a distal region of the abdomen 9, 10. These techniques, however, are limited by low recovery of hemocytes and possible contamination by fat body cells, respectively 11. More recently a method referred to as high injection/recovery improved recovery of immunocytes by use of anticoagulant buffers while reducing levels of contaminating scales and internal tissues 11. While that method allows for an improved method of collecting and maintaining hemocytes for primary culture, it entails a number of injection and collecting steps that are not necessary if the downstream goal is to collect, fix and stain hemocytes for diagnostics. Here, we demonstrate our method of collecting mosquito hemolymph that combines the simplicity of perfusion, using anticoagulant buffers in place of saline solution, with the accuracy of high injection techniques to isolate clean preparations of hemocytes in Aedes mosquitoes.

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

A simplified yet accurate method to collect and stain mosquito hemocytes is described. Our method combines the simplicity of perfusion with the accuracy of high injection techniques to isolate clean preparations of hemocytes in Aedes mosquitoes. This method facilitates studies requiring knowledge of the types of hemocytes and their abundance.

Un protocollo per la raccolta e la colorazione ematociti concentrati dal Mosquito febbre gialla Aedes aegypti</em

 Mosquitoes are vectors for a number  of disease-causing pathogens such as the yellow fever virus, malaria parasites  and filarial worms. Laboratories are ...

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Immunologia e infezioni

Genetic Manipulation in &Delta;ku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene function and phenotype(s). The development of mutant strains with targeted gene deletions, targeted mutations, complemented gene function, and/or tagged genes provides powerful strategies to address gene function, particularly if these genetic manipulations can be efficiently targeted to the gene locus of interest using integration mediated by double cross over homologous recombination.
Due to very high rates of nonhomologous recombination, functional genomic analysis of Toxoplasma gondii has been previously limited by the absence of efficient methods for targeting gene deletions and gene replacements to specific genetic loci. Recently, we abolished the major pathway of nonhomologous recombination in type I and type II strains of T. gondii by deleting the gene encoding the KU80 protein1,2. The &Delta;ku80 strains behave normally during tachyzoite (acute) and bradyzoite (chronic) stages in vitro and in vivo and exhibit essentially a 100% frequency of homologous recombination. The &Delta;ku80 strains make functional genomic studies feasible on the single gene as well as on the genome scale1-4.
Here, we report methods for using type I and type II &Delta;ku80&Delta;hxgprt strains to advance gene targeting approaches in T. gondii. We outline efficient methods for generating gene deletions, gene replacements, and tagged genes by targeted insertion or deletion of the hypoxanthine-xanthine-guanine phosphoribosyltransferase (HXGPRT) selectable marker. The described gene targeting protocol can be used in a variety of ways in &Delta;ku80 strains to advance functional analysis of the parasite genome and to develop single strains that carry multiple targeted genetic manipulations. The application of this genetic method and subsequent phenotypic assays will reveal fundamental and unique aspects of the biology of T. gondii and related significant human pathogens that cause malaria (Plasmodium sp.) and cryptosporidiosis (Cryptosporidium).

Genetic Manipulation in &lt;em&gt;&amp;Delta;ku80&lt;/em&gt; Strains for Functional Genomic Analysis of &lt;em&gt;Toxoplasma gondii&lt;/em&gt;

Here we report a method for using type I and type II &Delta;ku80 strains of Toxoplasma gondii to efficiently generate targeted gene deletions and gene replacements for functional genomic analysis.

La manipolazione genetica in<em&gt; Δku80</em&gt; Ceppi per analisi genomica funzionale di<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene ...

Rearing Ixodes scapularis, the Black-legged Tick: Feeding Immature Stages on Mice

Ixodes scapularis, the vector of Lyme disease, is one of the most important disease vectors in the eastern and Midwestern United States. This species is a three host tick that requires a blood meal from a vertebrate host for each development stage, and the adult females require a blood meal for reproduction. Larval ticks attach to their host for 3 - 5 days for feeding and drop off the host when fully engorged. This dependency on several different hosts and the lengthy attachment time for engorgement complicates tick rearing in the laboratory setting. However, to understand tick biology and tick-pathogen interactions, the production of healthy, laboratory-reared ticks is essential. Here, we demonstrate a simple, cost-effective protocol for immature tick feeding on mice. We modified the existing protocols for decreased stress on mice and increased tick feeding success and survival by using disposable cages without mesh bottoms to avoid contact of ticks with water contaminated with mice urine and feces.

Rearing Ixodes scapularis, the Black-legged Tick: Feeding Immature Stages on Mice

The production of healthy laboratory-reared ticks is essential to studies on tick biology, and tick-pathogen interactions. Here we demonstrate a simple protocol for immature tick feeding that is cost-effective and less stressful to mice.

impennata<em&gt; Ixodes scapularis,</em&gt; Il Tick Black-legged: Alimentazione stadi immaturi sui topi

Ixodes scapularis, the vector of Lyme disease, is one of the most important disease vectors in the eastern and Midwestern United States. This species is a ...

Dynamic Adhesion Assay for the Functional Analysis of Anti-adhesion Therapies in Inflammatory Bowel Disease

Gut homing of immune cells is important for the pathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD). Integrin-dependent cell adhesion to addressins is a crucial step in this process and therapeutic strategies interfering with adhesion have been successfully established. The anti-&#945;4&#946;7 integrin antibody, vedolizumab, is used for the clinical treatment of Crohn&#39;s disease (CD) and ulcerative colitis (UC) and further compounds are likely to follow.
The details of the adhesion procedure and the action mechanisms of anti-integrin antibodies are still unclear in many regards due to the limited available techniques for the functional research in this field.
Here, we present a dynamic adhesion assay for the functional analysis of human cell adhesion under flow conditions and the impact of anti-integrin therapies in the context of IBD. It is based on the perfusion of primary human cells through addressin-coated ultrathin glass capillaries with real-time microscopic analysis. The assay offers a variety of opportunities for refinements and modifications and holds potentials for mechanistic discoveries and translational applications.

Dynamic adhesion of immune cells to the vessel wall is a prerequisite for gut homing. Here, we present a protocol for a functional in vitro assay for the impact analysis of anti-integrin antibodies, chemokines or other factors on the dynamic cell adhesion of human cells using addressin-coated capillaries.

Analisi di adesione dinamico per l'analisi funzionale delle terapie di anti-adesione nelle malattie intestinali infiammatorie

Gut homing of immune cells is important for the pathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD). Integrin-dependent cell adhesion to addressins is a ...

Co-immunoprecipitation Assay for Studying Functional Interactions Between Receptors and Enzymes

Receptor-associated enzymes are the major mediators of cellular activation. These enzymes are regulated, at least in part, by physical interactions with cytoplasmic tails of the receptors. The interactions often occur through specific protein domains and result in activation of the enzymes. There are several methods to study interactions between proteins. While co-immunoprecipitation is commonly used to study domains that are required for protein-protein interactions, there are no assays that document the contribution of specific domains to activity of the recruited enzymes at the same time. Accordingly, the method described here combines co-immunoprecipitation and an on-bead enzymatic activity assay for simultaneous evaluation of interactions between proteins and associated enzymatic activation. The goal of this protocol is to identify the domains that are critical for physical interactions between a protein and enzyme and the domains that are obligatory for complete activation of the enzyme. The importance of this assay is demonstrated, as certain receptor protein domains contribute to the binding of the enzyme to the cytoplasmic tail of the receptor, while other domains are necessary to regulate the function of the same enzyme.

Here, we present a protocol for co-immunoprecipitation and an on-bead enzymatic activity assay to simultaneously study the contribution of specific protein domains of plasma membrane receptors to both enzyme recruitment and enzyme activity.

Analisi di co-immunoprecipitazione per lo studio delle interazioni funzionali tra recettori e gli enzimi

Receptor-associated enzymes are the major mediators of cellular activation. These enzymes are regulated, at least in part, by physical interactions with ...

Disclosing Hemolymph Collection and Inoculation of Metarhizium Blastospores into Rhipicephalus Microplus Ticks Towards Invertebrate Pathology Studies

Ticks are obligate hematophagous ectoparasites and Rhipicephalus microplus has great importance in veterinary medicine because it causes anemia, weight loss, depreciation of the animals&#39; leather and also can act as a vector of several pathogens. Due to the exorbitant costs to control these parasites, damage to the environment caused by the inappropriate use of chemical acaricides, and the increased resistance against traditional parasiticides, alternative control of ticks, by the use of entomopathogenic fungi, for example, has been considered an interesting approach. Nevertheless, few studies have demonstrated how the tick&#39;s immune system acts to fight these entomopathogens. Therefore, this protocol demonstrates two methods used for entomopathogen inoculation into engorged females and two techniques used for hemolymph collection and hemocytes harvesting. Inoculation of pathogens at the leg insertion in the tick female&#39;s body allows evaluation of females biologic parameters unlike the inoculation between the scutum and capitulum, which frequently damages Gen&#233;&#39;s organ. Dorsal hemolymph collection yielded a higher volume recovery than collection through the legs. Some limitations of tick hemolymph collection and processing include i) high rates of hemocytes&#39; disruption, ii) hemolymph contamination with disrupted midgut, and iii) low hemolymph volume recovery. When hemolymph is collected through the leg cutting, the hemolymph takes time to accumulate at the leg opening, favoring the clotting process. In addition, fewer hemocytes are obtained in the collection through the leg compared to the dorsal collection, even though the first method is considered easier to be performed. Understanding the immune response in ticks mediated by entomopathogenic agents helps to unveil their pathogenesis and develop new targets for tick control. The inoculation processes described here require very low technological resources and can be used not only to expose ticks to pathogenic microorganisms. Similarly, the collection of tick hemolymph may represent the first step for many physiological studies.

Disclosing Hemolymph Collection and Inoculation of Metarhizium Blastospores into Rhipicephalus Microplus Ticks Towards Invertebrate Pathology Studies

Analysis of tick hemolymph represents an important source of information on how some pathogens cause disease and how ticks immunologically respond to this infection. The present study demonstrates how to inoculate fungal propagules and collect hemolymph from Rhipicephalus microplus engorged females.

Rivelare la raccolta di hemolymph e l'inoculo di Metarhizium blastospores in Rhipicephalus MicroPlus zecche verso gli studi di patologia degli invertebrati

Ticks are obligate hematophagous ectoparasites and Rhipicephalus microplus has great importance in veterinary medicine because it causes anemia, weight ...

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine the rate of infection, disseminated infection, and potential transmission of the virus in the mosquito population in question. These procedures are widely utilized with various modifications in vector competence evaluations globally. They are important in determining the potential role that a given mosquito (i.e., species, population, individual) may play in the transmission of a given agent.

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

The presented protocol can determine the vector competence of Aedes aegypti mosquito populations for a given virus, such as Zika, in a containment setting.

Analisi di competenza vettoriale sulle zanzare Aedes aegypti utilizzando il virus Zika

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine ...

Propagation of the Microsporidian Parasite Edhazardia aedis in Aedes aegypti Mosquitoes

Edhazardia aedis is a microsporidian parasite of Aedes aegypti mosquitoes, a disease vector that transmits multiple arboviruses which cause millions of disease cases each year. E. aedis causes mortality and reduced reproductive fitness in the mosquito vector and has been explored for its potential as a biocontrol agent. The protocol we present for culturing E. aedis is based on its natural infection cycle, which involves both horizontal and vertical transmission at different life stages of the mosquito host. Ae. aegypti mosquitoes are exposed to spores in the larval stage. These infected larvae then mature into adults and transmit the parasite vertically to their offspring. Infected offspring are then used as a source of spores for future horizontal transmission. Culturing E. aedis can be challenging to the uninitiated given the complexities of the parasite&#8217;s life cycle, and this protocol provides detailed guidance and visual aids for clarification.

Propagation of the Microsporidian Parasite Edhazardia aedis in Aedes aegypti Mosquitoes

A protocol to culture the microsporidian parasite Edhazardia aedis. The parasite is passaged from one generation of Aedes aegypti mosquitoes to the next via horizontal transfer at the larval stage followed by vertical transmission at the adult stage. Live sporoplasms survive long-term in infected eggs.

Propagazione del parassita microsporidiano Edhazardia aedis nelle zanzare Aedes aegypti

Edhazardia aedis is a microsporidian parasite of Aedes aegypti mosquitoes, a disease vector that transmits multiple arboviruses which cause millions of ...

Feeding and Quantifying Animal-Derived Blood and Artificial Meals in Aedes aegypti Mosquitoes

Females of certain mosquito species can spread diseases while biting vertebrate hosts to obtain protein-rich blood meals required for egg development. In the laboratory, researchers can deliver animal-derived and artificial blood meals to mosquitoes via membrane feeders, which allow for manipulation of meal composition. Here, we present methods for feeding blood and artificial blood meals to Aedes aegypti mosquitoes and quantifying the volume consumed by individual females.
Targeted feeding and quantification of artificial/blood meals have broad uses, including testing the effects of meal components on mosquito behavior and physiology, delivering pharmacological compounds without injection, and infecting mosquitoes with specific pathogens. Adding fluorescein dye to the meal prior to feeding allows for subsequent meal size quantification. The meal volume consumed by mosquitoes can be measured either by weight, if the females are to be used later for behavioral experiments, or by homogenizing individual females in 96-well plates and measuring fluorescence levels using a plate reader as an endpoint assay. Meal size quantification can be used to determine whether changing the meal components alters the meal volume ingested or if meal consumption differs between mosquito strains. Precise meal size quantification is also critical for downstream assays, such as those measuring effects on host attraction or fecundity. The methods presented here can be further adapted to track meal digestion over the course of days or to include multiple distinguishable markers added to different meals (like nectar and blood) to quantify the consumption of each meal by a single mosquito.
These methods allow researchers to singlehandedly perform high-throughput measurements to compare the meal volume consumed by hundreds of individual mosquitoes. These tools will therefore be broadly useful to the community of mosquito researchers for answering diverse biological questions.

Feeding and Quantifying Animal-Derived Blood and Artificial Meals in Aedes aegypti Mosquitoes

The goal of this protocol is to deliver animal-derived and artificial blood meals to Aedes aegypti mosquitoes through an artificial membrane feeder and precisely quantify the volume of meal ingested.

Alimentazione e quantificazione del sangue di origine animale e dei pasti artificiali nelle zanzare Aedes aegypti

Females of certain mosquito species can spread diseases while biting vertebrate hosts to obtain protein-rich blood meals required for egg development. In ...

Standard Membrane Feeding Assay for the Detection of Plasmodium falciparum Infection in Anopheles Mosquito Vectors

Malaria remains one of the most devastating diseases worldwide and, to date, the African region is still responsible for 94% of all cases worldwide. This parasitic disease requires a protozoan parasite, an Anopheles mosquito vector, and a vertebrate host. The Anopheles genus comprises more than 500 species, of which 60 are known as vectors of the parasite. The Plasmodium parasite genus consists of 250 species, and 48 of these are involved in disease transmission. Furthermore, the Plasmodium falciparum parasite has contributed toward an estimated 99.7% of malaria cases in sub-Saharan Africa in recent years. 
Gametocytes form part of the sexual stage of the parasite and are ingested by the female mosquito upon feeding on an infected human host. Further development of the parasite within the mosquito is enhanced by favorable environmental conditions in the midgut of the mosquito. Here, the fusion of the female and male gametes takes place, and the motile ookinetes originate. The ookinetes enter the midgut epithelium of the mosquito, and mature ookinetes form oocysts, which, in turn, produce motile sporozoites. These sporozoites migrate to the mosquito's salivary glands and are injected as a mosquito takes a blood meal. 
For drug discovery purposes, mosquitoes were artificially infected with gametocyte-infected blood in the standard membrane feeding assay (SMFA). To detect infection within the mosquito and/or to assess the efficacy of antimalarial compounds, the midguts of the female mosquitoes were removed post infection and were stained with mercurochrome. This method was used to enhance the visual detection of oocysts under the microscope for the accurate determination of oocyst prevalence and intensity.

Standard Membrane Feeding Assay for the Detection of Plasmodium falciparum Infection in Anopheles Mosquito Vectors

The standard membrane feeding assay (SMFA) is regarded as the gold standard for the assessment and identification of potential antimalarial compounds. This artificial feeding system is used to infect mosquitoes to further evaluate the effects of such compounds on the intensity and prevalence of the Plasmodium falciparum parasite.

Test standard di alimentazione a membrana per la rilevazione dell'infezione da Plasmodium falciparum in vettori di zanzare Anopheles

Malaria remains one of the most devastating diseases worldwide and, to date, the African region is still responsible for 94% of all cases worldwide. This ...