Il protocollo aiuta gli studenti a identificare chiaramente le singole infezioni e ad eseguire facilmente il test, rendendo più efficiente quantificare il titolo virale. Questo protocollo incorpora una semplice procedura di fissazione e colorazione che produce risultati affidabili e riproducibili. Questo metodo può fornire informazioni sull'accuratezza e l'efficacia dei trattamenti antivirali contro le malattie.
Gli ostacoli più difficili di questo protocollo di plaquing sono i conteggi delle cellule per le piastre di semina, assicurandosi che le cellule non sovraffollassero, si asciugassero o si graffiassero durante il processo. Si può anche trovare difficoltà nella natura meticolosa generale di questo protocollo. Tuttavia, la pratica è uno dei principali contributori al successo di questo esperimento.
Per iniziare, completare la diluizione del campione con l'aggiunta di virus alle cellule in una sessione di laboratorio. Diluire in serie ogni campione di virus placcato in PBS. In genere utilizzare diluizioni 10 volte superiori per un monitoraggio più preciso.
Mantenere tutte le diluizioni virali sul ghiaccio fino a quando non sono pronti per aggiungere questi campioni di virus diluiti alle cellule. Rimuovere il terreno di coltura cellulare da uno o due pozzetti usando una pipetta. Aggiungere con attenzione il campione di virus diluito a goccia a ciascun monostrato di cellule attraverso il lato di ciascun pozzetto.
Ripetere il processo per ogni uno o due pozzetti fino a quando l'intera piastra non viene riempita con i campioni di virus da placcare. Scuotere delicatamente l'intero piatto a mano. Quindi incubare la piastra a 37 gradi Celsius per un'ora per consentire l'adsorbimento del virus.
Dopo ogni 10 minuti, rimuovere la piastra dall'incubatrice, scuoterla delicatamente di nuovo per diffondere il virus in modo più uniforme su ciascun pozzetto, quindi riposizionarla nell'incubatrice. Per ridurre la possibilità di contare inavvertitamente l'inoculo non assorbito, rimuovere il campione di virus dai pozzetti utilizzando una punta di pipetta da 1000 microlitri e scartare il campione in un becher di scarto. Posizionare 2,5 millilitri di una sovrapposizione di metilcellulosa sulla piastra e riposizionarla nell'incubatrice.
Disinfettare il becher di scarto, in genere con l'aggiunta di candeggina, uno iodoforo o un virucida simile, prima di rimuoverlo dall'armadio di biosicurezza. Dopo l'incubazione di due giorni, rimuovere la sovrapposizione di metilcellulosa da uno o due pozzetti alla volta usando una pipetta e metterla in un becher di scarto. Aggiungere circa due millilitri di viola cristallino all'1% in etanolo al 50% in ciascun pozzetto.
Incubare la piastra con tutti i pozzetti riempiti con la macchia per 30 minuti a 37 gradi Celsius. A questo punto, disinfettare il becher di scarto come dimostrato in precedenza. Lavare vigorosamente i piatti con acqua del rubinetto fino a quando il deflusso è chiaro.
Assicurarsi che ci siano differenze di circa 10 volte nel numero di placche in ogni serie di diluizione. La figura raffigura una diminuzione di 10 volte del conteggio delle placche in cui il numero numerabile di placche è sceso nell'intervallo da 10 a meno quattro per tutte e tre le repliche. Le prime tre immagini nella figura raffigurano placche nella diluizione da 10 a meno tre.
Tuttavia, la riga inferiore mostra i risultati quando un test della placca non viene condotto bene. Ci sono pochissime placche visibili da qualsiasi diluizione nelle aree visibili intorno alla parte superiore dove le cellule Vero si sono completamente sollevate dal substrato. Allo stesso modo, questa figura mostra problemi con le cellule che si asciugano o si maneggiano male durante il test della placca.
Tuttavia, questa cifra mostra criticamente una scarsa semina delle cellule Vero. Ogni pozzo mostra macchie viola più scure, indicative di cellule non ben distribuite attraverso il pozzo e ammucchiate l'una sull'altra in gruppi. Per ottenere i migliori risultati, assicurarsi che il virus sia diffuso uniformemente attraverso la piastra per evitare placche raggruppate I test della placca sono più efficaci di altri metodi quantitativi perché conta solo il virus vivo.
In questo modo, è possibile stabilire la vera efficacia antivirale. Inoltre, questa tecnica ci ha permesso di quantificare la presenza virale sui fomiti ed esplorare l'efficacia della somministrazione di farmaci da nuovi dispositivi medici nel nostro settore di ricerca sul virus dell'herpes.
