Ringraziamo Steffen Koch per il suo supporto tecnico e Shannon Lee Layland (sia IGB Fraunhofer di Stoccarda) per i suoi utili suggerimenti sul manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente dal Attrarre programma del Fraunhofer-Gesellschaft e la BMBF (sia per KS-L.).

1. Preparazione del campione biologico <ol><li> Preparazione delle cellule viventi <ol><li> Preparazione delle cellule aderenti <ol><li> Seme in cellule coltivate in vitro, o isolate di fresco su un piatto di vetro inferiore (Greiner BioOne / Germania) e incubare a 37 ° C e 5% CO 2 fino attaccamento cellulare è completata. </li><li> Togliere terreno di coltura e lavare delicatamente tre volte con PBS misura preventiva. Conservare le cellule coperti sia con PBS o terreno di coltura cellulare durante tutta la procedura di misura. </li></ol></li><li> Preparazione delle cellule in sospensione <ol><li> Staccare in vitro-colture di cellule in base a protocolli comuni (ad esempio, tripsina-EDTA, scraping cella), centrifugare le cellule e risospendere il pellet cellulare ottenuta in PBS o terreno di coltura cellulare. </li><li> Trasferire 100 microlitri della sospensione cellulare (concentrazione: massimo 100.000 cellule / ml) ad un piatto fondo di vetro. </li></ol></li></ol></li><li> Preparazione di native tessuti <ol><li> Dopo la raccolta i tessuti, trasferirli sterile, ghiacciato PBS e tenerli non più di 12 ore a 4 ° C oppure attraverso una misurazione ghiaccio prima. Esperimenti precedenti hanno dimostrato che un tempo prolungato stoccaggio (tempo di ischemia fredda&gt; 12 ore a 4 ° C) determinato cambiamenti spettrali dovute a processi di degradazione naturali. </li><li> Le misurazioni devono essere effettuate con il tessuto rivestito in PBS o mezzo per evitare danneggiamenti delle proteine ​​ECM e le cellule a causa di asciugatura del tessuto. </li></ol></li></ol> 2. Spettrometro Raman Il nostro spettrometro Raman personalizzata combina un microscopio a fluorescenza standard (Olympus IX 71), con uno spettrometro Raman che permette il confronto diretto delle immagini in campo chiaro e fluorescenza con gli spettri Raman. Il set di base è costituito da un diodo laser 784 nm (AG Toptica fotonica / Germania), un filtro notch per la separazione del Raman-luce diffusa dalla luce di eccitazione, un microscopio unond uno spettrografo (Kaiser Optical Systems Inc., Ann Arbor / USA) con un dispositivo ad accoppiamento di carica (CCD) ottimizzato per la rilevazione di informazioni spettrali (F-view from soft Imaging Systems / Germania). 3. Controllo della funzione Laser <ol><li> Avviare il software Andor Solis (Andor / Regno Unito) e impostare la temperatura della camera CCD a -60 ° C per ridurre al minimo il rumore provocato dalle correnti indotte termicamente nella fotocamera. </li><li> Posizionare un wafer di silicio sul palco microscopio per la procedura di calibrazione. </li><li> Accendere il laser e impostare la potenza a 85 mW. </li><li> Utilizzare il software delle cellule B (Olympus / Germania) di focalizzare il laser sul wafer fino XY appare. </li><li> Misurare il wafer di silicio con un unico tempo di integrazione di 1 sec usando un obiettivo 60x aria. </li><li> Modificare l&#39;unità della x-asse da alla variazione del numero di pixel Raman (cm -1) nel software Andor Solis. </li><li> Variare il fuoco del laser al silicio del picco a 520 cm -1 inil raccolto spettro per trovare l&#39;intensità massima possibile per questa banda Raman. La quantità minima di conteggi deve essere maggiore di 11.000 a una riuscita della calibrazione. </li></ol> 4. Raman misure spettroscopiche Tutte le misure sono eseguite a temperatura ambiente. <ol><li> Impostazioni di base <ol><li> Utilizzare un obiettivo ad immersione in acqua 60x (Olympus / Germania) con un&#39;apertura numerica di 1,2 per raccogliere lo spettro dei campioni. </li><li> Modificare le impostazioni di acquisizione integrazioni a 10/10 secondi per un totale di 100 secondi per le misurazioni. </li></ol></li><li> Misurazione di cellule aderenti <ol><li> Prendete il piatto fondo di vetro con le celle e collocarlo sul palco microscopio. </li><li> Per ottenere un segnale migliore e garantire la riproducibilità, focalizzare il laser sul nucleo della cellula, ruotare la luce microscopio e iniziare la raccolta dello spettro. </li><li> Misurare uno spettro di riferimento del fondo emolto 10 spettri spostando il fuoco del laser accanto alla cella. E &#39;importante considerare che quando si cambia la messa a fuoco un nuovo sfondo devono essere raccolti per ogni profondità di messa a fuoco. </li></ol></li><li> Misurazione di cellule in sospensione <ol><li> Trasferire 100 microlitri della sospensione cellulare nel piatto inferiore vetro e posizionarlo sul microscopio scena. </li><li> Fuoco del laser al centro della cella, ruotare la luce microscopio e iniziare la raccolta dello spettro. </li><li> Misurare uno spettro di riferimento dello sfondo ogni 10 spettri spostando il fuoco del laser accanto alla cella. Quando si cambia la messa a fuoco, un nuovo sfondo devono essere rilevati per la profondità nuova attenzione. </li></ol></li><li> Misurazione di tessuti nativi <ol><li> Prendete il campione e trasferirli in un piatto fondo di vetro. La regione di interesse (ROI) dovrebbero essere orientati verso il fondo del recipiente. </li><li> Riempire il piatto con PBS a sufficienza per coprire il campione. </li><li> Posizionare un bicchiere di copertura sul campione per evitare qualsiasi movement del campione durante le misurazioni. </li><li> Impostare il fuoco del laser nella struttura di interesse (risoluzione in profondità è laser e tessuto-dipendente) e iniziare a raccogliere gli spettri. </li><li> Raccogliere uno spettro di riferimento dello sfondo ogni 10 spettri spostando il laser fuoco all&#39;esterno della zona di tessuto intero. Quando si cambia la messa a fuoco, un nuovo sfondo devono essere rilevati per la profondità nuova attenzione. </li></ol></li><li> Misura di immunofluorescenza (IF)-etichettati criosezioni <ol><li> Sezione freschi, congelati snap-campioni di tessuto utilizzando un cryotom standard e li montano su silice rivestite con vetri di copertura. </li><li> Colorare le criosezioni secondo un protocollo di routine per IF, impiegando soltanto un piccolo passo di fissaggio (max 10 minuti con paraformaldeide al 4%) e utilizzando anticorpi appropriati per la rilevazione della proteina di interesse. </li><li> Eseguire misurazioni Raman concentrandosi nella zona in cui si verifica fluorescenza. </li></ol></li><li> Elastina degradazione esperimenti <ol><li> Place la ventricularis dei lembi della valvola aortica dissezionati suina (elastina ricco, sangue afflusso strato di lato del lembo della valvola cardiaca) di fronte al fondo del piatto inferiore vetro. </li><li> Misurare il tessuto nativo come un &#39;non-incubate control&#39; a 30 punti casuali in tutta la superficie del tessuto intera messa a fuoco nelle strutture fibrillari. </li><li> Dividere in 3 sezioni e inserirli in separati 2.5 ml provette Eppendorf contenenti 2 ml di una soluzione elastasi (5 U / ml, Worthington / Germania). </li><li> Incubare il tessuto per 15 o 30 minuti a 37 ° C. </li><li> Dopo incubazione per 15 o 30 minuti, rimuovere i tessuti dalla provetta Eppendorf e lavare accuratamente con PBS al fine di interrompere completamente la reazione enzimatica. </li><li> Misurare ogni campione a 30 punti casuali, concentrandosi nelle strutture fibrillari. </li></ol></li></ol> 5. Elaborazione dati e analisi <ol><li> Spettri Raman di elaborazione Il pre-trattamento deispettri generati è stata eseguita utilizzando il software OPUS (Bruker Optik GmbH / Germania). <ol><li> Al fine di ridurre i segnali interferenti dal vetro e mezzo, nonché per evitare variazioni dovute variazioni del fuoco durante le misure, sottrarre lo spettro corrispondente sfondo dal spettri raccolti. </li><li> Ridurre gli spettri nella regione tra il numero d&#39;onda 400-1800 cm -1, che offre la più alta quantità di informazioni. </li><li> Se necessario, normalizzare gli spettri al picco massimo. Fattori di normalizzazione indica le fluttuazioni di intensità e fallimenti sistematici, semplificando l&#39;individuazione di cambiamenti strutturali nello spettro del campione. </li><li> Eseguire una correzione al basale per aumentare la comparabilità tra i diversi esperimenti. </li></ol></li><li> Analisi di spettri Raman Gli spettri Raman sono stati analizzati utilizzando PCA con la (CAMO / Norvegia) software Unscrambler. L&#39;analisi multivariata rileva le differenze e le somiglianze all&#39;interno dei dati spettraliset. Ogni spettro è tracciata come un unico punto in uno spazio multidimensionale in base ai conteggi raccolti per ogni turno Raman. Ciascun componente principale (PC) descrive una certa quantità di informazioni totale contenute nei dati originali. Il primo PC è quello che contiene la prima fonte di variabilità. Ogni PC che segue contiene, in ordine, meno informazioni rispetto al precedente. Ogni variabile ha un punteggio e un caricamento su ogni PC. Tracciando PC (= punteggi), correlazioni campione importanti possono essere esposti. I caricamenti descrivono il contributo di ciascuna variabile analizzata per la PCA. <ol><li> Etichettare ogni gruppo di misure con la creazione di campi di riga per ogni gruppo di campioni. </li><li> Utilizzare le seguenti impostazioni di base per la PCA: cross di convalida, l&#39;algoritmo NIPALS, nessuna rotazione e avviare l&#39;analisi. Queste impostazioni sono spettri dipendenti. </li><li> Eseguire la PCA. </li></ol></li></ol> 6. Risultati rappresentativi Raman spECTRA generata da cellule aderenti spesso rivelano un basso rapporto segnale-rumore e una bassa intensità di segnale globale (Fig. 1). causa del fatto che il fuoco del laser deve essere impostata in prossimità del fondo di vetro, l&#39;influenza del interferire 11 segnale bicchiere è piuttosto elevata, provocando mascheramento del segnale campione effettivo. Di conseguenza, il segnale campione potrebbe essere ridotta o addirittura eliminato durante una successiva sottrazione del fondo. Così, si preferisce utilizzare cellule in sospensione per la nostra analisi spettroscopica Raman, in quanto consentono il rilevamento di informazioni più dettagliate spettrale. Tuttavia, gli spettri di cellule aderenti e le sospensioni presentano le stesse vette principali che differiscono solo nella loro intensità. Per la caratterizzazione di tipi cellulari diversi all&#39;interno di una sospensione, senza pre-trattamento è richiesto. Gli spettri Raman media e la deviazione standard di fibroblasti umani, cellule staminali mesenchimali (MSC), condrociti e cheratinociti misurato in sospensione sonoillustrato nella figura 2. Tutti gli spettri Raman sono strutturati in modo simile, con picchi provenienti da biomolecole tipici quali proteine, acidi nucleici e lipidi (vedi Tabella 1). 12 Per questi tipi di cellule, la regione spettrale fra 600 e 1800 cm -1 contiene più pertinenti informazione spettrale, da chiare differenze che sono individuabili tra i differenti tipi di cellule (Fig. 2A). Esemplare, abbiamo evidenziato una regione spettrale (1280-1350 cm -1) presentano chiari differenze strutturali, che è assegnabile a vibrazioni molecolari di collagene e di lipidi. Al contrario, le analisi morfologiche non sono adatti per l&#39;identificazione e la distinzione delle maggior parte delle cellule (Fig. 2B-I). Mentre la differenza tra condrociti e cellule della pelle è osservabile (Fig. 2D, H contro B, E e F, I), fibroblasti e MSC sono difficili da separare utilizzando esclusivamente in campo chiaro micrsocopia (Fig. 2B, F rispetto a C, G) 13. Raman analisi spettroscopica di tessuto nativo, in particolare di proteine ​​ECM, richiede che una ROI può essere visualizzato in campo chiaro immagini per essere in grado di concentrarsi sulla rispettiva struttura. Per l&#39;assegnazione di una proteina di uno spettro impronta specifica, abbiamo generato spettri Raman di proteine ​​pure disponibili in commercio e criosezioni immunoistologico macchiati. Qui, abbiamo individuato gli spettri delle impronte digitali di fibre elastiche all&#39;interno dei tessuti nativi confronto elastina liofilizzato e immunofluorescenza macchiati criosezioni che impiegano un anticorpo contro l&#39;elastina. Tuttavia, poiché elastina presenta un autofluorescenza alto, che si riflette nella spettri Raman, l&#39;analisi dei dati è impegnativo (Fig. 3A). Per ridurre l&#39;errore sistematico dovuto campione proprietà specifiche, come autofluorescenza, un trattamento adeguato dei set di dati è fondamentale. In uno i nostri datialyses, abbiamo utilizzato la normalizzazione per eliminare l&#39;intensità del segnale significativamente maggiore della proteina pura elastina, e quindi, siamo stati in grado di generare comparabile spettri Raman (fig. 3B). L&#39;elastina è una delle proteine ​​ECM più stabili nel corpo ed è quindi molto difficile da degradare 14. Nel nostro set up sperimentale, abbiamo indotto la degradazione elastina in volantini sani suina della valvola aortica eseguendo una digestione enzimatica. Applicando la analisi multivariata PCA, abbiamo individuato differenze significative tra gli spettri Raman di enzimaticamente trattati con campioni ed i controlli nativi (Fig. 3C). Queste differenze sono state osservate spettrali nello spettro di carico a 861, 1003 e 1664 cm -1. Attesi cambiamenti strutturali nelle fibre a causa di tempi di esposizione prolungati a elastasi elastina contenenti sono stati mostrati mediante colorazione HART (Fig. 4), che sono riflesse anche in più gruppi distinti punteggio separabili (Fig. 3C). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3977/3977fig1.jpg" /> Figura 1. Media spettri Raman dei fibroblasti staccati e aderente. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3977/3977fig2.jpg" /> Figura 2. (A) media spettri Raman e deviazioni standard di quattro differenti tipi principali di cellule isolate (fibroblasti, CSM, condrociti e cheratinociti). Il telaio mette in evidenza la regione spettrale di 1280 - 1350 cm -1 con le differenze strutturali. (BE) in campo chiaro immagini di staccate (B), i fibroblasti (C) MSCS, (D) e condrociti (E) cheratinociti. Barra della scala è uguale a 20 micron. (FI) in campo chiaro immagini di aderenti (F), i fibroblasti (G) MSC, (H) e (i condrociti) cheratinociti. Barra della scala equivale a 200 micron. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3977/3977fig3.jpg" /> Figura 3. (A) spettri Raman senza normalizzazione di lyophiliZed elastina (linea blu), immunofluorescenza (IF)-etichettati criosezioni (linea arancione) e le fibre elastiche (linea rossa) misurati all&#39;interno lembi della valvola aortica nativa. L&#39;intensità di segnale alto liofilizzata elastina è causato da autofluorescenza. (B) spettri Raman dopo la normalizzazione per eliminare guasti sistemici. (C) I punteggi ed i caricamenti del confronto tra i non-trattata di controllo (rosso) e-enzimaticamente degradata (blu e verde) fibre elastiche nel tessuto nativo. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3977/3977fig4.jpg" /> Figura 4. HART&#39;s macchiati suina lembi valvolari aortici. Le fibre elastiche sono visualizzati in nero. (A) e (B) mostrano non trattati e di controllo (C) e (D) rappresentano campioni di tessuto che sono stati esposti alla elastina-enzima degradante elastasi per 30 minuti. <table border="1"><tbody><tr><td> Numero d&#39;onda in cm -1 </strong&gt; </td><td colspan="2"> Assegnazione 12 </td></tr><tr><td> 717-719 </td><td> CN </td><td> Fosfolipidi </td></tr><tr><td> 785-788 </td><td> DNA / RNA basi, OPO backbone </td><td> DNA / RNA </td></tr><tr><td> 1003 - 1005 </td><td> Fenilalanina </td><td> Proteina </td></tr><tr><td> 1220-1280 </td><td> Ammide III </td><td> Proteina </td></tr><tr><td> 1445-1447 </td><td> CH 2 </td><td> Proteine ​​/ lipidi </td></tr><tr><td> 1655-1680 </td><td> Amide IC = C </td><td> Protein lipidi </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Bande Raman che vengono rilevati in spettri di tutti i tipi cellulari (fibroblasti, CSM, condrociti e cheratinociti).

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Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

Spettroscopia Raman è un attrezzo adatto per analizzare campioni biologici, come in vitro-colture di cellule e proteine ​​ECM così come le cellule all&#39;interno dei tessuti nativi. 11,15,16 Qui, abbiamo dimostrato che questo non-contatto, privo di etichetta tecnica permette discriminazione di differenti tipi di cellule e la rilevazione della degradazione proteica ECM esclusivamente in base alla composizione biomolecolare intrinseca di questi campioni biologici. Il principale vantaggio della spettroscopia Raman è la capacità di non-invasivo quantificare l&#39;impronta digitale biochimica di un campione dalla sua spettri Raman risultante. In contrasto con spettroscopia infrarossa, che produce informazioni simili, spettri Raman può essere raccolto da campioni acquosi, come la dispersione Raman dall&#39;acqua è debole. Inoltre, spettroscopia Raman si basa unicamente sulla rilevazione di backscattering di luce monocromatica, pertanto, non è richiesta l&#39;elaborazione del campione precedente misura. Questi attributi rendono Raspettroscopia uomo una promettente alternativa per il potenziale in applicazioni di imaging in vivo. A questo proposito, coerente anti-Stokes spettroscopia Raman (CARS) è una tecnica molto interessante in quanto permette l&#39;acquisizione veloce e più sensibile dei dati in base ai segnali vibrazionali stessi utilizzati nei nostri esperimenti. 15,16 Altri metodi alternativi tra cui multiphoton indotta autofluorescenza e seconda immagini generazione armonica sono stati precedentemente dimostrato di essere adatto per il monitoraggio di campioni biologici non invasivo o minima. 17 Tuttavia, queste modalità di imaging sono associati con costi molto elevati e sono limitati a autofluorescenza generatrici molecole. Inoltre, spettrometro Raman è facile da abbinare con tradizionali microscopi ottici. Queste caratteristiche rendono la spettroscopia Raman uno strumento prezioso per studiare campioni biologici in ambienti fisiologici. Uno dei limiti attuali della nostra spettroscopia Raman è istituitoil fuoco del laser relativamente piccola (250 nm intero massimo metà larghezza (FWHM) laterale e 700 nm FWHM assiale) che viene creato da un obiettivo ad alta apertura numerica (NA = 1,2). Sebbene un elevato apertura numerica permette di coprire una buona quantità di luce emessa Raman cedere in un alto rapporto segnale-a-rumore, l&#39;elevata NA produce solo un piccolo fuoco raccolta all&#39;interno del campione che è in genere molto più piccola di una cella. Per confrontare gli spettri Raman di cellule differenti, la raccolta di uno spettro rappresentativo è essenziale, che è difficile da ottenere con una piccola area di messa. Per risolvere questo problema, stiamo lavorando su un processo per automatizzare la raccolta del segnale in diversi punti all&#39;interno della cellula (= mappatura spettroscopica Raman), con un conseguente spettrale media e cedere ad uno spettro rappresentativo. Inoltre, questa tecnica fornisce una panoramica della distribuzione delle specifiche bande Raman, ad esempio della distribuzione proteina all&#39;interno di una cellula. BiolI campioni ogical sono estremamente complessi e costituiti da una miscela eterogenea di biomolecole che contribuiscono alla raccolta spettri Raman. Pertanto, il modello spettrale è molto complessa e il controllo di un singolo tipo di una molecola all&#39;interno di uno spettro Raman è difficile da realizzare con la sovrapposizione di segnali molecolari diversi. Inoltre, fluorescenza intrinseca del campione può mascherare preziose informazioni di deboli segnali Raman. È interessante notare che in alcuni dei nostri studi precedenti, abbiamo individuato in autofluorescenza gli spettri Raman come il principale fattore di differenziazione tra i tipi di cellule (fibroblasti e MSC) utilizzando uno strumento adeguato di analisi 13. Abbiamo anche individuato che i cambiamenti di intensità complessiva del segnale Raman può servire come un indicatore per lo stato di collagene e le fibre di collagene all&#39;interno della ECM di lembi valvolari aortici. 9 Tuttavia, quando si analizza lo stato di elastina in questi tessuti, non siamo stati in grado di rilevare risultati simili. Come indicato nel risultatosezione s, si è invece in grado di rilevare alterazioni specifiche bande Raman elastasi nei campioni trattati rispetto ai controlli nativi. Non abbiamo visto una diminuzione complessiva del segnale Raman nei enzimaticamente trattati con campioni come previsto. Queste osservazioni portato in una trama punteggio che non ha rivelato una formazione di cluster chiaro come si vede nello studio precedente. 9 Al contrario, l&#39;influenza del trattamento enzimatico è rilevabile nei risultati PCA. Partiamo dal presupposto che queste differenze tra i due proteine ​​ECM, elastina e il collagene, si basano sulle differenze morfologiche e diversi processi di degradazione enzimatica: all&#39;interno del lembo della valvola aortica, il collagene ricco di zone (fibrosa) è uno strato continuo che viene allentato a causa della trattamento enzimatico, per cui la zona contenente elastina (ventricularis) ha una configurazione di rete che appare frammentato dopo l&#39;esposizione a elastasi (Fig. 4). Le misurazioni in loco singoli stati, pertanto, non approprimangiava per rilevare tali rotture piccoli all&#39;interno della rete elastina. Qui, una mappatura Raman del tessuto aiuterebbe a identificare i guasti nelle reti. Un&#39;ulteriore sfida in spettroscopia Raman di campioni biologici è quello di ridurre i tempi di misura. Una soluzione è quella di aumentare la potenza del laser, che è adatto finché i campioni biologici non sono interessati da foto-danni. Tutti i nostri esperimenti in corso sono la prova di principio studi incentrati sulla ricerca di base, tuttavia, il nostro obiettivo generale è quello di implementare la spettroscopia Raman per applicazioni cliniche compresa la medicina rigenerativa (ad esempio: controllo della qualità dei prodotti dell&#39;ingegneria tissutale), pre-trapianto e trapianto di monitoraggio la diagnostica del cancro.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> elastasi </td><td> Worthington </td><td> LS006363 </td><td></td></tr><tr><td> anticorpi anti-elastina </td><td> Sigma </td><td> HPA018111 </td><td> 1:75; tampone citrato </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Lonza </td><td> 17-512F </td><td></td></tr><tr><td> fondo di vetro piatti </td><td> Greiner BioOne </td><td> 627860 </td><td></td></tr><tr><td> Il Unscrambler </td><td> CAMO </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Opus </td><td> Bruker </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

non-contact, label-free monitoring of cells and extracellular matrix using raman spectroscopy

Non distruttivo, non-contatto e label-free tecnologie per monitorare colture cellulari e tissutali sono necessari nel campo della ricerca biomedica. 1-5 metodi di routine, tuttavia, attualmente disponibili richiedono fasi di elaborazione e alterare l&#39;integrità del campione. Spettroscopia Raman è un metodo rapido che permette la misurazione di campioni biologici senza necessità di ulteriori fasi di lavorazione. . Questo laser-tecnologia basata rileva la diffusione anelastica di luce monocromatica 6 In ogni vibrazione chimica è assegnato ad una specifica banda Raman (numero d&#39;onda in cm -1), ciascun campione biologico presenta un tipico andamento spettrale a causa della loro intrinseca composizione biochimica 7. - 9 Entro spettri Raman, l&#39;intensità dei picchi in correlazione con l&#39;ammontare delle obbligazioni presenti molecolari. 1 Analogie e differenze dei set di dati spettrali possono essere rilevati utilizzando un&#39;analisi multivariata (es. analisi delle componenti principali (PCA)) 10. </sup&gt; Qui, noi dobbiamo fare spettroscopia Raman di cellule e tessuti viventi native. Le cellule sono seminate o sulle antenne fondo di vetro o mantenuto in sospensione in condizioni normali colture cellulari (37 ° C, 5% CO 2) prima della misurazione. Tessuti nativi sono sezionati e memorizzati in salina tamponata con fosfato (PBS) a 4 ° C misurazioni precedenti. A seconda del nostro set up sperimentale, abbiamo quindi sia focalizzata sul nucleo della cellula o della matrice extracellulare (ECM) proteine, quali il collagene e l&#39;elastina. Per tutti gli studi, un minimo di 30 celle o 30 punti casuali di interesse all&#39;interno del ECM vengono misurate. Fasi di elaborazione dei dati inclusi sottrazione del fondo e la normalizzazione.

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Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Spettroscopia Raman è una tecnica adatta per il non-contatto, label-free analisi di cellule viventi, dell&#39;ingegneria tissutale costrutti e tessuti nativi. Fonte specifici per le impronte digitali spettrali possono essere generati ed analizzati utilizzando l&#39;analisi multivariata.

Senza contatto, Label-free monitoraggio delle cellule e matrice extracellulare mediante Spettroscopia Raman

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

16.8K Views.  Eberhard Karls University, Tübingen. Spettroscopia Raman è una tecnica adatta per il non-contatto, label-free analisi di cellule viventi, dell'ingegneria tissutale costrutti e tessuti nativi. Fonte specifici per le impronte digitali spettrali possono essere generati ed analizzati utilizzando l'analisi multivariata.

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Longitudinal Measurement of Extracellular Matrix Rigidity in 3D Tumor Models Using Particle-tracking Microrheology

The mechanical microenvironment has been shown to act as a crucial regulator of tumor growth behavior and signaling, which is itself remodeled and modified as part of a set of complex, two-way mechanosensitive interactions. While the development of biologically-relevant 3D tumor models have facilitated mechanistic studies on the impact of matrix rheology on tumor growth, the inverse problem of mapping changes in the mechanical environment induced by tumors remains challenging. Here, we describe the implementation of particle-tracking microrheology (PTM) in conjunction with 3D models of pancreatic cancer as part of a robust and viable approach for longitudinally monitoring physical changes in the tumor microenvironment, in situ. The methodology described here integrates a system of preparing in vitro 3D models embedded in a model extracellular matrix (ECM) scaffold of Type I collagen with fluorescently labeled probes uniformly distributed for position- and time-dependent microrheology measurements throughout the specimen. In vitro tumors are plated and probed in parallel conditions using multiwell imaging plates. Drawing on established methods, videos of tracer probe movements are transformed via the Generalized Stokes Einstein Relation (GSER) to report the complex frequency-dependent viscoelastic shear modulus, G*(&#969;). Because this approach is imaging-based, mechanical characterization is also mapped onto large transmitted-light spatial fields to simultaneously report qualitative changes in 3D tumor size and phenotype. Representative results showing contrasting mechanical response in sub-regions associated with localized invasion-induced matrix degradation as well as system calibration, validation data are presented. Undesirable outcomes from common experimental errors and troubleshooting of these issues are also presented. The 96-well 3D culture plating format implemented in this protocol is conducive to correlation of microrheology measurements with therapeutic screening assays or molecular imaging to gain new insights into impact of treatments or biochemical stimuli on the mechanical microenvironment.

Particle-tracking microrheology can be used to non-destructively quantify and spatially map changes in extracellular matrix mechanical properties in 3D tumor models.

Misurazione longitudinale di matrice extracellulare rigidità in 3D Tumore modelli utilizzando-particelle inseguimento Microrheology

The mechanical microenvironment has been shown to act as a crucial regulator of tumor growth behavior and signaling, which is itself remodeled and ...

Ricerca

Bioingegneria

A Microfluidic-based Electrochemical Biochip for Label-free DNA Hybridization Analysis

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration of pre-processing steps. Utilizing these devices towards the analysis of DNA hybridization events is important because it offers a technology for real time assessment of biomarkers at the point-of-care for various diseases. However, when the device footprint decreases the dominance of various physical phenomena increases. These phenomena influence the fabrication precision and operation reliability of the device. Therefore, there is a great need to accurately fabricate and operate these devices in a reproducible manner in order to improve the overall performance. Here, we describe the protocols and the methods used for the fabrication and the operation of a microfluidic-based electrochemical biochip for accurate analysis of DNA hybridization events. The biochip is composed of two parts: a microfluidic chip with three parallel micro-channels made of polydimethylsiloxane (PDMS), and a 3 x 3 arrayed electrochemical micro-chip. The DNA hybridization events are detected using electrochemical impedance spectroscopy (EIS) analysis. The EIS analysis enables monitoring variations of the properties of the electrochemical system that are dominant at these length scales. With the ability to monitor changes of both charge transfer and diffusional resistance with the biosensor, we demonstrate the selectivity to complementary ssDNA targets, a calculated detection limit of 3.8 nM, and a 13% cross-reactivity with other non-complementary ssDNA following 20 min&#160;of incubation. This methodology can improve the performance of miniaturized devices by elucidating on the behavior of diffusion at the micro-scale regime and by enabling the study of DNA hybridization events.

We present a microfluidic-based electrochemical biochip for DNA hybridization detection. Following ssDNA probe functionalization, the specificity, sensitivity, and detection limit are studied with complementary and non-complementary ssDNA targets. Results illustrate the influence of the DNA hybridization events on the electrochemical system, with a detection limit of 3.8 nM.

Un Biochip elettrochimica Microfluidic-based per la libera-Label Ibridazione DNA Analysis

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration ...

A Label-free Technique for the Spatio-temporal Imaging of Single Cell Secretions

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning of such signaling can lead to many disorders. To understand cell-to-cell signaling, it is essential to study the spatial and temporal nature of the secreted molecules from the cell without disturbing the local environment. Various assays have been developed to study protein secretion, however, these methods are typically based on fluorescent probes which disrupt the relevant signaling pathways. To overcome this limitation, a label-free technique is required.
In this paper, we describe the fabrication and application of a label-free localized surface plasmon resonance imaging (LSPRi) technology capable of detecting protein secretions from a single cell. The plasmonic nanostructures are lithographically patterned onto a standard glass coverslip and can be excited using visible light on commercially available light microscopes. Only a small fraction of the coverslip is covered by the nanostructures and hence this technique is well suited for combining common techniques such as fluorescence and bright-field imaging.
A multidisciplinary approach is used in this protocol which incorporates sensor nanofabrication and subsequent biofunctionalization, binding kinetics characterization of ligand and analyte, the integration of the chip and live cells, and the analysis of the measured signal. As a whole, this technology enables a general label-free approach towards mapping cellular secretions and correlating them with the responses of nearby cells.

Inter-cellular communication is critical for controlling various physiological activities within and outside the cell. This paper describes a protocol for measuring the spatio-temporal nature of single cell secretions. To achieve this, a multidisciplinary approach is used which integrates label-free nanoplasmonic sensing with live cell imaging.

Una tecnica senza etichetta per l&#39;Imaging spazio-temporale delle secrezioni monocellulari

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental studies on the behavior of molecules. Single molecule detection techniques commonly utilize labels such as fluorescent tags or quantum dots, however, labels are not always available, increase cost and complexity, and can perturb the events being studied. Optical resonators have emerged as a promising means to detect single molecules without the use of labels. Currently the smallest particle detected by a non-plasmonically-enhanced bare optical resonator system in solution is a 25 nm polystyrene sphere1. We have developed a technique known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that can surpass this limit and achieve label-free single molecule detection in aqueous solution2. As signal strength scales with particle volume, our work represents a &#62; 100x improvement in the signal to noise ratio (SNR) over the current state of the art. Here the procedures behind FLOWER are presented in an effort to increase its usage in the field.

We have developed a label-free biosensing system based on optical resonator technology known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that is capable of detecting single molecules in solution. Here the procedures behind this work are described and presented.

Singola molecola di rilevamento senza etichetta di testo usando Microtoroid ottici Risonatori

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, which is regulated by a variety of soluble and physical signals in the microenvironment. Described here is a method created to study the process of branching morphogenesis by forming engineered three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined shape and size that are completely embedded within an extracellular matrix (ECM). This method enables the formation of arrays of identical tissues and enables the control of a variety of environmental factors, including tissue geometry, spacing, and ECM composition. This method can also be combined with widely used techniques such as traction force microscopy (TFM) to gain more information about the interactions between cells and their surrounding ECM. The protocol can be used to investigate a variety of cell and tissue processes beyond branching morphogenesis, including cancer invasion.

This manuscript describes a soft lithography-based technique to engineer uniform arrays of three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined geometry surrounded by extracellular matrix. This method is amenable to a wide variety of cell types and experimental contexts and allows for high-throughput screening of identical replicates.

Tessuti epiteliali Ingegneria tridimensionali integrati all&#39;interno di matrice extracellulare

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

Preparation of Extracellular Matrix Protein Fibers for Brillouin Spectroscopy

Brillouin spectroscopy is an emerging technique in the biomedical field. It probes the mechanical properties of a sample through the interaction of visible light with thermally induced acoustic waves or phonons propagating at a speed of a few km/sec. Information on the elasticity and structure of the material is obtained in a nondestructive contactless manner, hence opening the way to in vivo applications and potential diagnosis of pathology. This work describes the application of Brillouin spectroscopy to the study of biomechanics in elastin and trypsin-digested type I collagen fibers of the extracellular matrix. Fibrous proteins of the extracellular matrix are the building blocks of biological tissues and investigating their mechanical and physical behavior is key to establishing structure-function relationships in normal tissues and the changes which occur in disease. The procedures of sample preparation followed by measurement of Brillouin spectra using a reflective substrate are presented together with details of the optical system and methods of spectral data analysis.

We present a protocol for the application of Brillouin light scattering spectroscopy to elastin and trypsin-purified type I collagen fibers of the extracellular matrix to extract their full elastic properties.

Preparazione della matrice extracellulare fibre proteiche per Brillouin Spettroscopia

Brillouin spectroscopy is an emerging technique in the biomedical field. It probes the mechanical properties of a sample through the interaction of ...

PIP-on-a-chip: A Label-free Study of Protein-phosphoinositide Interactions

Numerous cellular proteins interact with membrane surfaces to affect essential cellular processes. These interactions can be directed towards a specific lipid component within a membrane, as in the case of phosphoinositides (PIPs), to ensure specific subcellular localization and/or activation. PIPs and cellular PIP-binding domains have been studied extensively to better understand their role in cellular physiology. We applied a pH modulation assay on supported lipid bilayers (SLBs) as a tool to study protein-PIP interactions. In these studies, pH sensitive ortho-Sulforhodamine B conjugated phosphatidylethanolamine is used to detect protein-PIP interactions. Upon binding of a protein to a PIP-containing membrane surface, the interfacial potential is modulated (i.e. change in local pH), shifting the protonation state of the probe. A case study of the successful usage of the pH modulation assay is presented by using phospholipase C delta1 Pleckstrin Homology (PLC-&#948;1 PH) domain and phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) interaction as an example. The apparent dissociation constant (Kd,app) for this interaction was 0.39 &#177; 0.05 &#181;M, similar to Kd,app values obtained by others. As previously observed, the PLC-&#948;1 PH domain is PI(4,5)P2 specific, shows weaker binding towards phosphatidylinositol 4-phosphate, and no binding to pure phosphatidylcholine SLBs. The PIP-on-a-chip assay is advantageous over traditional PIP-binding assays, including but not limited to low sample volume and no ligand/receptor labeling requirements, the ability to test high- and low-affinity membrane interactions with both small and large molecules, and improved signal to noise ratio. Accordingly, the usage of the PIP-on-a-chip approach will facilitate the elucidation of mechanisms of a wide range of membrane interactions. Furthermore, this method could potentially be used in identifying therapeutics that modulate protein&#39;s capacity to interact with membranes.

Here we present a supported lipid bilayer in the context of a microfluidic platform to study protein-phosphoinositide interactions using a label-free method based on pH modulation.

PIP-on-a-chip: Uno studio privo di etichette delle interazioni proteine-fosfoinositide

Numerous cellular proteins interact with membrane surfaces to affect essential cellular processes. These interactions can be directed towards a specific ...

Fabricating a Kidney Cortex Extracellular Matrix-Derived Hydrogel

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust mechanical support for in vitro cell culture but lack the necessary protein and ligand composition to elicit physiological behavior from cells. This manuscript describes a fabrication method for a kidney cortex ECM-derived hydrogel with proper mechanical robustness and supportive biochemical composition. The hydrogel is fabricated by mechanically homogenizing and solubilizing decellularized human kidney cortex ECM. The matrix preserves native kidney cortex ECM protein ratios while also enabling gelation to physiological mechanical stiffnesses. The hydrogel serves as a substrate upon which kidney cortex-derived cells can be maintained under physiological conditions. Furthermore, the hydrogel composition can be manipulated to model a diseased environment which enables the future study of kidney diseases.

Here we present a protocol to fabricate a kidney cortex extracellular matrix-derived hydrogel to retain the native kidney extracellular matrix (ECM) structural and biochemical composition. The fabrication process and its applications are described. Finally, a perspective on using this hydrogel to support kidney-specific cellular and tissue regeneration and bioengineering is discussed.

Fabbricando un rene corteccia extracellulare Matrix-derivato idrogel

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust ...

Implementation of Interference Reflection Microscopy for Label-free, High-speed Imaging of Microtubules

There are several methods for visualizing purified biomolecules near surfaces. Total-internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy is a commonly used method, but has the drawback that it requires fluorescent labeling, which can interfere with the activity of the molecules. Also, photobleaching and photodamage are concerns. In the case of microtubules, we have found that images of similar quality to TIRF can be obtained using interference reflection microscopy (IRM). This suggests that IRM might be a general technique for visualizing the dynamics of large biomolecules and oligomers in vitro. In this paper, we show how a fluorescence microscope can be modified simply to obtain IRM images. IRM is easier and considerably cheaper to implement than other contrast techniques such as differential interference contrast microcopy or interferometric scattering microscopy. It is also less susceptible to surface defects and solution impurities than darkfield microscopy. Using IRM, together with the image analysis software described in this paper, the field of view and the frame rate is limited only by the camera; with a sCMOS camera and&#160;wide-field&#160;illumination&#160;microtubule length can be measured with precision up to 20 nm with a bandwidth of 10 Hz.&#160;

This protocol is a guide for implementing interference reflection microscopy on a standard fluorescence microscope for label-free, high-contrast, high-speed imaging of microtubules using in vitro surfaces assays.

Implementazione della microscopia di riflessione delle interferenze per l'imaging ad alta velocità e senza etichetta dei microtubuli

There are several methods for visualizing purified biomolecules near surfaces. Total-internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy is a commonly used ...

Optical Trapping of Plasmonic Nanoparticles for In Situ Surface-Enhanced Raman Spectroscopy Characterizations

Surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS) enables the ultrasensitive detection of analyte molecules in various applications due to the enhanced electric field of metallic nanostructures. Salt-induced silver nanoparticle aggregation is the most popular method for generating SERS-active substrates; however, it is limited by poor reproducibility, stability, and biocompatibility. The present protocol integrates optical manipulation and SERS detection to develop an efficient analytical platform to address this. A 1064 nm trapping laser and a 532 nm Raman probe laser are combined in a microscope to assemble silver nanoparticles, which generate plasmonic hotspots for in situ SERS measurements in aqueous environments. Without aggregating agents, this dynamic plasmonic silver nanoparticle assembly enables an approximately 50-fold enhancement of the analyte molecule signal. Moreover, it provides spatial and temporal control to form the SERS-active assembly in as low as 0.05 nM analyte-coated silver nanoparticle solution, which minimizes the potential perturbation for in vivo analysis. Hence, this optical trapping-integrated SERS platform holds great potential for efficient, reproducible, and stable molecular analyses in liquids, especially in aqueous physiological environments.

Optical Trapping of Plasmonic Nanoparticles for In Situ Surface-Enhanced Raman Spectroscopy Characterizations

The present protocol describes a convenient approach to integrating optical trapping and surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS) to manipulate plasmonic nanoparticles for sensitive molecular detection. Without aggregating agents, the trapping laser assembles plasmonic nanoparticles to enhance the SERS signals of target analytes for in situ spectroscopic measurements.

Intrappolamento ottico di nanoparticelle plasmoniche per la caratterizzazione della spettroscopia Raman potenziata dalla superficie in situ

Surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS) enables the ultrasensitive detection of analyte molecules in various applications due to the enhanced electric ...