L'imaging vibrazionale altamente multiplexato fornisce un approccio ottico one-shot per interrogare più marcatori proteici nei tessuti con risoluzione subcellulare. Questa piattaforma fornisce un quadro completo delle interazioni proteiche dei sistemi biologici. Il vantaggio principale di questa tecnica è la sua multiplexità senza ciclo.
Questa tecnica è particolarmente adatta per applicazioni in cui le strategie ciclistiche non funzionano bene, come nelle sezioni di tessuto spesso. Questo metodo consente la caratterizzazione delle singole cellule in situ per comprendere le strutture del sistema complesso, come l'atlante dei tessuti di costruzione, i micro ambienti tumorali di fenotipizzazione e il circuito cerebrale di profilazione. Per iniziare, preparare circa 0,1 bicarbonato di sodio molare in tampone PBS a PHA 0,3 da utilizzare come tampone di coniugazione e conservarlo a quattro gradi Celsius.
Quindi preparare tre soluzione di sonda MARS millimolare con estere n-idrossisuccinimide in dimetilsolfossido anidro. Sciogliere i solidi anticorpali nel tampone di coniugazione ad una concentrazione di due milligrammi per millilitro. Per gli anticorpi disciolti in altri tamponi, concentrarli in un filtro centrifugo e quindi aggiungere nel tampone di coniugazione ad una concentrazione da uno a due milligrammi per millilitro.
Per eseguire la reazione di coniugazione per gli anticorpi secondari, aggiungere 15 volte l'eccesso molare di soluzione di colorante alla soluzione di anticorpi in un flaconcino di vetro lentamente mescolando e incubare la miscela di reazione a temperatura ambiente mescolando per un'ora. Per eseguire la purificazione, preparare il liquame aggiungendo 10 millilitri di polvere di resina di filtrazione del gel in 40 millilitri di tampone PBS in un tubo da 50 millilitri. Tenere la soluzione a bagnomaria a 90 gradi Celsius per un'ora.
Quindi decantare il surnatante, aggiungere il PBS fino a 40 millilitri e conservare il liquame a quattro gradi Celsius. Imballare la colonna di esclusione delle dimensioni con la soluzione di liquame all'altezza di 10-15 centimetri, quindi risciacquare e lavare la colonna con circa 10 millilitri di PBS per imballare ulteriormente la resina. Successivamente, pipettare la miscela di reazione di coniugazione alla colonna.
Dopo aver caricato la miscela di reazione, aggiungere immediatamente un millilitro di PBS come tampone di eluizione. Successivamente, raccogliere l'eluente della soluzione coniugata osservando il colore sulla colonna o misurando l'assorbanza a 280 nanometri. Utilizzando il filtro centrifugo, concentrare la soluzione raccolta a uno o due milligrammi per millilitro.
Usando una penna idrofoba, disegna un confine attorno alle sezioni di tessuto sul vetrino. Quindi incubare i tessuti con 0,3-0,5% PBST per 10 minuti e un tampone di blocco per 30 minuti. Per preparare la soluzione colorante primaria, aggiungere tutti gli anticorpi primari a 200-500 microlitri di tampone colorante alle concentrazioni desiderate.
Centrifugare la soluzione colorante primaria a 13.000 volte G per cinque minuti e utilizzare il surnatante se appare un precipitato. Quindi incubare il tessuto nella soluzione anticorpale primaria a quattro gradi Celsius per uno o due giorni. Lavare i vetrini tre volte con 0,3-0,5% PBST per cinque minuti a temperatura ambiente in un barattolo in piedi e assicurarsi che i tessuti siano immersi nella soluzione.
Successivamente, incubare il tessuto in 200-500 microlitri di tampone bloccante per 30 minuti. Per preparare la soluzione di colorazione secondaria, aggiungere tutti gli anticorpi secondari a 200-500 millilitri di tampone colorante con le concentrazioni desiderate. Quindi centrifugare la soluzione di colorazione secondaria a 13.000 volte G per cinque minuti e utilizzare il surnatante se appare il precipitato.
Quindi, incubare i tessuti in 200-500 microlitri di soluzione anticorpale secondaria a quattro gradi Celsius per uno o due giorni. Quindi lavare i vetrini due volte con 0,3-0,5% PBST a temperatura ambiente per cinque minuti ciascuno. Inoltre, incubare con 200-500 microlitri di soluzione DAPI per 30 minuti.
Ancora una volta, lavare i vetrini tre volte con PBS a temperatura ambiente per cinque minuti ciascuno e trasferire le sezioni di tessuto galleggiante ai vetrini con la pipetta di vetro che cade. Stendere il tessuto con una spazzola per tessuti e pulire l'ambiente circostante con salviette se necessario. Successivamente, montare il tessuto in una goccia di reagenti anti-dissolvenza con una copertura di vetro e fissarlo con lo smalto per unghie.
Per eseguire l'imaging multicanale-eprSRS, impostare la potenza laser del fascio della pompa su 10-40 milliwatt e il raggio di stokes su 40-80 milliwatt sul pannello di controllo laser. Quindi impostare il tempo di permanenza dei pixel su due o quattro microsecondi e utilizzare più fotogrammi in media in genere da 10 a 20 fotogrammi sul software di microscopia. Inoltre, impostare le costanti temporali dell'amplificatore lock-in su metà del tempo di permanenza dei pixel.
L'imaging del colorante Raman di marcatori proteici distinti e cellule HeLa paraformaldeide fissa corteccia cerebrale di topo e tessuto FFPE renale umido sono stati eseguiti attraverso l'etichettatura immuno. L'imaging immuno-eprSRS di cellule HeLa con alfa-tubulina ha rivelato strutture subcellulari fini come i microtubuli. L'imaging eprSRS degli astrociti colorati mars 2145 e dei neuroni del granulo cerebellare colorato MARS 2228 nel tessuto cerebrale del topo ha dimostrato modelli tridimensionali con risoluzione subcellulare.
È stata eseguita l'imaging tandem a fluorescenza SRS a sette colori di ormoni e fattori di trascrizione sul tessuto insulare di topo congelato. Le immagini ottenute hanno rivelato un buon contrasto e modelli corretti. È stata eseguita l'imaging in tandem a fluorescenza SRS a otto colori di marcatori di tipo cellulare su tessuti cervellici di topo fissati con paraformaldeide.
Sono stati identificati diversi tipi di cellule come i neuroni del granulo cerebellare, i neuroni di Purkinje, gli astrociti, gli oligodendrociti e i neuroni GABAergici. Questa procedura può essere ulteriormente combinata con la pulizia dei tessuti per eseguire l'imaging proteico altamente multiplexato in tessuti intatti spessi. Il nostro gruppo ha sviluppato un protocollo di compensazione dei tessuti su misura per il colorante Raman.
