Ringraziamo Andy Johnson del Centro di Ricerca Biomedica presso la UBC per l&#39;assistenza con l&#39;analisi FACS. Finanziamento della ricerca sul cancro in laboratorio Wong è fornito dalla Canadian Cancer Society Research Institute (sovvenzione di funzionamento # 019250) e dal reinvestimento dei fondi di ricerca della Facoltà di Scienze Farmaceutiche, UBC. JMYW è supportato da sedie di ricerca del Canada e la Fondazione Michael Smith carriera di ricerca per i programmi di sviluppo della salute.

1. Preparazione cellulare <img src="/files/ftp_upload/4045/4045fig0.jpg" alt="Figura 0" /> <ol><li> Cellule piastra per raggiungere una densità di circa il 60% di confluenza. Le cellule devono essere in fase log al momento della raccolta. Per MCF7, questo viene realizzato semina a 5 x 10 5 cellule / piastra 10 centimetri nei mezzi appropriati. HT29 e LS180 cellule sono seminate a 6 x 10 5 cellule / piastra 6 cm. Abbiamo usato DMEM mezzo supplementato con 10% FBS e 1x penicillina / streptomicina. Assicurati di piastre semi per i controlli corretti positivi e negativi inOltre ai campioni di prova. Essi comprendono i seguenti: </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Io </td><td> controllo positivo </td><td> BrdU solo </td></tr><tr><td> ii </td><td> controllo positivo </td><td> PI solo </td></tr><tr><td> iii </td><td> controllo negativo </td><td> BrdU negativo, PI negativo </td></tr></tbody></table> (Si noti che un esperimento preliminare con vari intervalli di tempo come quello descritto in questo protocollo può essere utilizzato per restringere l&#39;intervallo di tempo durante il quale per effettuare collezioni future.) <ol start="2"><li> Le cellule sono placcati incubate a 37 ° C, 5% CO 2 per 24-48 h, consentendo alle cellule di recuperare e collegare. </li><li> Per pulsare cellule di etichette con bromodeossiuridina (BrdU), è sostituito wi DMEMth mezzo fresco contenente 10 pM BrdU. Le cellule vengono incubate per 1 ora a 37 ° C, 5% CO 2 per consentire l&#39;incorporazione di BrdU nel DNA. Assicurati di lasciare una piastra non trattata per fungere da controllo negativo. </li><li> Gli impulsi di etichettatura supporto viene rimosso e le cellule vengono risciacquate brevemente con 1X PBS. </li><li> Mezzi di crescita fresco è aggiunto (meno il BrdU) e le cellule possono continuare ad incubare a 37 ° C, 5% CO 2 fino timepoint appropriato per la raccolta viene raggiunto. </li></ol> 2. Raccolta e fissaggio <ol><li> Cellule non trattate dal punto 1.3 sono considerati i timepoint zero. Questo esempio può essere raccolto insieme con la h 1 timepoint che viene raccolto subito dopo il trattamento BrdU. </li><li> Per raccogliere le cellule, supporto viene rimosso e le piastre vengono risciacquata con 1X PBS. </li><li> Le cellule vengono tripsinizzate, raccolti in mezzi di coltura e successivamente pelletizzata mediante centrifugazione a 1500 rpm per 5 min Supernatant viene scartato. </li><li> Sciacquare 1-10 x 10 6 cellule in 5 ml di ghiaccio freddo 1X PBS. Centrifugare a 1500 rpm per 5 minuti Il supernatante viene scartato. </li><li> Il pellet cellulare viene quindi risospese in 100 pl di ghiaccio freddo PBS / 1% FBS. L&#39;aggiunta di 1% FBS in PBS aiuta a prevenire aggregazione cellulare. </li><li> Aggiungere queste cellule goccia a goccia a 5 ml di -20 ° C, 70% etanolo per fissare le cellule. </li><li> Incubare in ghiaccio per 30 minuti o conservare a 4 ° C per una notte. Questo è un passo ideale a cui interrompere la raccolta dei campioni delle punti temporali diversi. I campioni possono essere lasciati in etanolo per diversi giorni, consentendo loro di essere trattati simultaneamente attraverso il resto del protocollo. </li></ol> 3. BrdU e PI colorazione <ol><li> Celle a pellet di centrifugazione per 5 min a 1500 rpm. </li><li> Togliere il fissativo, ma lasciare ~ 50 microlitri in cui allentare il pellet nel vortex. </li><li> Snaturare il DNA, lentamente, aggiungere 1 ml di HCL 2N / Triton X-100goccia a goccia mentre il vortex. Incubare campioni a temperatura ambiente per 30 min. </li><li> Celle a pellet di centrifugazione campioni per 5 min a 1500 rpm. Aspirare e scartare il surnatante. </li><li> Risospendere il pellet di cellule in 1 ml di tetraborato di sodio 0,1 M, pH 8,5, per neutralizzare la fase di denaturazione. </li><li> Centrifugare cellule per 5 min a 1500 rpm. Aspirare e scartare il surnatante. </li><li> Risospendere il pellet di cellule in 75 pl di miscela di colorazione BrdU (50 pl 0,5% Tween 20/1% BSA / PBS + 20 pl coniugato con FITC anti-BrdU + 5 pl 10 mg / ml RNasi). </li><li> Incubare a temperatura ambiente per 45 minuti al riparo dalla luce. </li><li> Per cellule pellet, centrifugare i campioni per 5 min a 1500 rpm. Aspirare e scartare il surnatante. </li><li> Risospendere il pellet di cellule in 1 ml di PBS contenente 5 mg / ml di ioduro di propidio. </li></ol> 4. Citometria a Flusso <ol><li> Per analizzare le cellule, un citofluorimetro equipaggiato con un laser 488 nm e laopportuni filtri è necessario. Il software di analisi come CellQuest è necessaria per creare le trame descritte di seguito. </li><li> Quando si esegue il campione attraverso il citofluorimetro, creare un forward scatter (SSC-H) vs lato scatter (FSC-H) piano per garantire la distribuzione corretta dimensione delle cellule (Figura 1A). Entrambi questi parametri vengono tracciate su una scala lineare. </li><li> Contemporaneamente visualizzare un appezzamento di FL3-H (PI macchia) vs FL2-W (Figura 1B). Questo grafico è utilizzata per creare un cancello (R3) per isolare la frazione di cellule che sono all&#39;interno del modello di distribuzione normale del ciclo cellulare. In generale, questo modello di distribuzione è caratterizzato da due gruppi di cellule del contenuto di DNA 2N e 4N di colorazione PI rappresentare fasi G1 e G2 del ciclo cellulare, rispettivamente. Una stringa di cellule situate tra questi 2 gruppi rappresentativa della replicazione del DNA continuo che si verifica nella fase S del ciclo cellulare. </li><li> Creare un grafico displaying le cellule gated (R3) dal punto 4.3, con FL1-H (FITC, plot log) sulla y-asse e PI (trama lineare) sul l&#39;asse x (Figura 1C). Questa trama verrà utilizzato per impostare i parametri rimanenti utilizzando i vari controlli descritti in 1,1, nonché a raccogliere dati per l&#39;analisi. </li><li> Posizionare la PI solo campione colorato sul citometro. Regolare il guadagno di inserire il G1 a ~ 200 sul l&#39;asse x. Questo sarà più facile da visualizzare in un grafico a istogramma della macchia PI. </li><li> Un secondo controllo prevede l&#39;esecuzione di uno BrdU solo campione sul citometro a flusso. Regolare il guadagno in modo che le 2 popolazioni di cellule BrdU (BrdU positive vs negative) appaiono sul terreno. Idealmente, le cellule BrdU negativi sono posizionati a comparire appena sotto 10 -1. </li><li> Il controllo finale è il BrdU / PI campione negativo. Eseguire questa controllo negativo per garantire che le cellule non apparire in qualsiasi dei quadranti superiori mano o destra. </li><li> Una volta che i parametri dei vari appezzamenti sono stati impostati, ilcitometro a flusso è calibrato e pronto per la lavorazione delle cellule BrdU e PI macchiati. Un minimo di 10.000 cellule che sono gated nella frazione corretta PI (vedi punto 4.3) deve essere letta per la raccolta. </li><li> Per analizzare i dati raccolti, software come FlowJo o FacsDiva vengono utilizzati. Ognuno dei lotti di cui sopra può essere ricreato in questi programmi e l&#39;analisi quantitativa e statistica effettuata. </li><li> L&#39;endpoint di analisi coinvolge diverse fasi successive. Creazione di un appezzamento di FITC vs PI con le cellule gated come positivo dalla trama PI FL2-W PI permette di distinguere la popolazione ciclistica. Una seconda porta viene creato da questo grafico, isolando la popolazione BrdU positive. Esprimendo questa popolazione distintivo su un terreno istogramma con PI l&#39;asse x permette di monitorare l&#39;andamento nel tempo della progressione del ciclo cellulare. Questo può essere ulteriormente visualizzati tracciando il numero di BrdU-positive cellule con G1 o G2 contenuto in funzione del tempo. </li></ol> 5. Risultati rappresentativi Normalmente le cellule ciclismo colorate con ioduro di propidio avere picchi distinti a G1 e G2, corrispondenti a celle contenenti contenuto di DNA 2N e 4N, rispettivamente (figura 2). Pulse etichettatura con BrdU consente di etichettatura selettiva di una sotto-popolazione di cellule che sono attivamente sintetizzare DNA (cioè fase S). Poco dopo la rimozione del reagente BrdU, tutte le cellule marcate sono in fase S (Figura 3). Limitando l&#39;etichettatura di un breve impulso si è in grado di seguire questa ora distinti sub-popolazione di cellule in tutta numerosi punti temporali che passano attraverso le successive fasi del ciclo cellulare. Questo può essere visualizzato al punto 1 volta h in figura 3 come una netta mancanza di G1 e G2 picchi. Ulteriori informazioni possono essere derivato dalla fase di marcatura BrdU. Non solo la proporzione di cellule in divisione attivamente essere misurato, ma un ESTiMate di distribuzione stadio del ciclo cellulare tra due campioni possono anche essere determinata. Con la raccolta di cellule equidistante dopo la rimozione del reagente BrdU, le cellule possono essere rintracciati mentre continuano a ciclo, progressi G2 e infine passare attraverso la divisione cellulare delle cellule originali, infine, emerge come BrdU-positive cellule figlie con G1 contenuto di DNA (Figura 4). Un esempio di quantificazione fase del ciclo cellulare e analisi cinetica viene fornita in Figura 5. <img src="/files/ftp_upload/4045/4045fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. (A) rispetto al Forward Scatter Scatter Plot Side di un rappresentante MCF7 popolazione di cellule. (B) PI rispetto Larghezza (FL-W) Plot di un rappresentante MCF7 popolazione di cellule. Gating è mostrato escludere doppietti cellule in ultima analisi (R3). Doppietti cellulari avrà larghezza di impulso maggiore di una singola cella, che prendono più a passare attraverso il raggio laser e therefore può essere escluso dall&#39;analisi. (C) PI rispetto FITC (BrdU) Plot di una popolazione rappresentativa MCF7 cellulare. Gating viene mostrata per includere solo i FITC (BrdU) cellule positive (R4). <img src="/files/ftp_upload/4045/4045fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Istogramma grafico rappresentante di una popolazione totale di cellule normalmente in bicicletta. <img src="/files/ftp_upload/4045/4045fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Trama istogramma di cellule che sono stati raccolti 1h dopo la rimozione del polso BrdU, dopo gating per FITC (BrdU)-cellule positive. BrdU-cellule positive ad un tempo di valutazione precoce dopo la rimozione di etichetta mostrano profili PI che corrispondono a campioni che mostrano contenuti DNA coerente con cellule che sono nella fase S del ciclo cellulare, confermando l&#39;etichettatura di successo di cellule soltanto durante la sintesi del DNA. <img src="/files/ftp_upload/4045/4045fig4.jpg" a<html> lt = &quot;Figura 4&quot; /&gt; Figura 4. Confronto cinetica di progressione del ciclo cellulare tra linee cellulari tumorali, cancri colorettali HT29 (A) e LS180 (B), così come il cancro della mammella MCF7 (C). Le cellule sono state raccolte ogni ora per 8 ore, dopo la rimozione del polso BrdU. In questo esperimento, abbiamo osservato un chiaro profilo di progressione accelerata ciclo cellulare attraverso la fase G2 del ciclo cellulare nella LS180 colorettale linea cellulare. Confrontando la cinetica tra i due profili delle cellule tumorali del colon-retto, l&#39;emergere di un picco G1 è evidente a T = 4 ore post-BrdU nelle cellule LS180, rispetto al punto di tempo corrispondente per la linea cellulare HT-29 che manca di questo picco. Rispetto sia con una delle due linee di cellule del colon-retto, MCF7 cellule sono in bicicletta ad un tasso notevolmente ridotto. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4045/4045fig4large.jpg">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <html> re 5 &quot;/&gt; Figura 5. (A) l&#39;analisi del ciclo cellulare quantitativa fase di BrdU-marcati cellule tumorali. Il Preside / Jett / Fox algoritmo è stato applicato a HT29, LS180 e MCF7 (illustrata in verde). Le cellule risultanti distribuzioni fase del ciclo di ciascun campione sono espressi come% Totale BrdU-cellule positive per ogni fase. Solo selezionare i punti temporali per ciascuna linea cellulare vengono visualizzati, in quanto le analisi per alcuni dei punti temporali precedenti ha prodotto risultati validi. In questi punti temporali precedenti, tutte BrdU-cellule positive sono in fase S e non hanno quindi distinto G1 e G2 picchi, che sono necessari per l&#39;applicazione dell&#39;algoritmo. (B) istogrammi di cellule tumorali che mostra la cinetica di progressione attraverso G2 / M fasi del ciclo cellulare. La progressione attraverso G2 / M è il più veloce le fasi per la LS180 cellule, seguita da HT29 e MCF7. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4045/4045fig5large.jpg">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <html> jpg &quot;alt =&quot; Figura S1 &quot;/&gt; S1 Figura. Citometria a flusso di controllo. MCF7 sono mostrati come (A) controllo negativo in cui le cellule non sono né PI né tinto BrdU. (B) PI solo macchiato. (C) BrdU-FITC campioni. <img src="/files/ftp_upload/4045/4045figS2.jpg" alt="Figura S2" /> Figura S2. Rappresentazione schematica che mostra la relazione tra lo spettro di emissione fluorescente PI rispetto FITC (BrdU). Le finestre di raccolta spettrali fluorescente per il canale 1 (FL1, per FITC) e il canale fluorescente 3 (FL3, per PI) sono mostrati nelle caselle corrispondenti. Non vi è alcuna sovrapposizione tra gli spettri fluorofori FL1 e FL3 rilevamento. Evidentemente, compensazione della fluorescenza non è necessaria quando i dati sperimentali da PI e FITC-BrdU co-cellule marcate vengono raccolte nelle FL1/FL3 canali rispettivamente. Spettri di fluorescenza sono stati ottenuti dal sito BD BioSciences:target = &quot;_blank&quot;&gt; http://www.bdbiosciences.com/research/multicolor/spectrum_viewer. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4045/4045figS2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> .

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T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclin+B1+expression+in+HeLa+S3+cells+studied+by+flow+cytometry.">Cyclin B1 expression in HeLa S3 cells studied by flow cytometry.</a> Exp. Cell Res. 211, 275-281 (1994).</li></ol>

Non abbiamo nulla da rivelare.

Grazie alla combinazione di citometria a flusso con incorporazione di BrdU, abbiamo gli strumenti necessari per studiare cinetica del ciclo cellulare. La proprietà caratteristica di BrdU per funzionare come un analogo della timidina è ciò che permette di quantificare il contenuto di DNA di una cellula bicicletta. L&#39;incorporazione di BrdU in un filamento figlia crescente DNA durante la fase di sintesi del ciclo cellulare è quello che permette di seguire una sottopopolazione di cellule bicicletta attraverso la rep...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> bromodeossiuridina </td><td> Becton Dickinson </td><td> 55089 </td><td></td></tr><tr><td> propidio ioduro </td><td> Sigma </td><td> 287075 </td><td> 1mg/ml magazzino </td></tr><tr><td> FITC anti-BrdU </td><td> Becton Dickinson </td><td> 347583 </td><td></td></tr><tr><td> di sodio tetraborato </td><td> Pescatore </td><td> S80172 </td><td> 0,1 M, pH 8,5 </td></tr><tr><td> FACS Caliber </td><td> Becton Dickinson </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

measuring cell cycle progression kinetics with metabolic labeling and flow cytometry

Controllo preciso di inizio e la progressione successiva attraverso le varie fasi del ciclo cellulare sono di fondamentale importanza in cellule proliferanti. Ciclo di divisione cellulare è parte integrante della crescita e la riproduzione e deregolamentazione dei componenti chiave del ciclo cellulare sono stati implicati negli eventi scatenanti di 1,2 carcinogenesi. Agenti molecolari in terapie anti-cancro spesso bersaglio vie biologiche responsabili della regolamentazione e il coordinamento della divisione del ciclo cellulare 3. Sebbene cinetica del ciclo cellulare tendono a variare in base al tipo di cellula, la distribuzione delle celle tra le quattro fasi del ciclo cellulare è piuttosto consistente in una linea cellulare particolare grazie al modello di costante mitogeni e espressione di fattore di crescita. Eventi genotossici ed altri fattori di stress cellulare può risultare in un blocco temporaneo di progressione del ciclo cellulare, con conseguente arresto temporaneo o una pausa in una particolare fase del ciclo cellulare per consentire istituzionigazione del meccanismo di risposta adeguata. La capacità di osservare sperimentalmente il comportamento di una popolazione di cellule con riferimento alla fase progressione del ciclo cellulare è un importante progresso in biologia cellulare. Procedure comuni come mitotico scrollarsi di dosso, centrifugazione differenziale o citometria a flusso basato ordinamento vengono utilizzati per isolare le cellule in specifici momenti del ciclo cellulare 4-6. Questi frazionati, ciclo cellulare fase arricchiti popolazioni vengono poi sottoposti a trattamenti sperimentali. Resa, la purezza e la vitalità delle frazioni separate possono spesso essere compromessa usando questi metodi di separazione fisici. Inoltre, l&#39;intervallo di tempo tra la separazione delle popolazioni cellulari e l&#39;inizio del trattamento sperimentale, la quale le cellule frazionati può passare dallo stadio selezionato ciclo cellulare, può creare problemi rilevanti il ​​successo e l&#39;interpretazione di questi esperimenti. Altri approcci alla stUdy fasi del ciclo cellulare includono l&#39;uso di prodotti chimici per sincronizzare le cellule. Il trattamento delle cellule con inibitori chimici di chiave processi metabolici per ogni fase del ciclo cellulare sono utili nel bloccare la progressione del ciclo cellulare alla fase successiva. Ad esempio, i ribonucleotide reduttasi idrossiurea cellule arresta a G1 / S frangente limitando la fornitura di deossinucleotidi, i blocchi di costruzione di DNA. Altre sostanze chimiche importanti includono il trattamento con afidicolina, un inibitore di alfa polimerasi per l&#39;arresto G1, il trattamento con colchicina e nocodazole, entrambi interferire con la formazione mitotica mandrino per arrestare le cellule in fase M e, infine, il trattamento con il DNA catena terminatore 5-fluorodeoxyridine di avviare S arresto di fase 7-9. Il trattamento con queste sostanze è un mezzo efficace di sincronizzazione un&#39;intera popolazione di cellule ad una fase particolare. Con la rimozione della sostanza chimica, le cellule rientrare nel ciclo cellulare all&#39;unisono. Trattamento della seguente comunicato di prova agentedalla chimica ciclo cellulare bloccando assicura che la risposta farmaco sollecitato è da un uniforme, ciclo cellulare stadio-specifico popolazione. Tuttavia, poiché molti dei sincronizzatori chimiche sono noti composti genotossici, prendere in giro a parte la partecipazione di vari percorsi di risposta (per i sincronizzatori contro gli agenti di test) è una sfida. Qui si descrive un metodo metabolico etichettatura per seguire una sottopopolazione di cellule attivamente in bicicletta attraverso la loro progressione dalla fase di replicazione del DNA, attraverso la divisione e la separazione delle loro cellule figlie. Accoppiato con quantificazione citometria a flusso, questo protocollo permette per la misurazione della cinetica progressione del ciclo cellulare in assenza di una meccanicamente o chimicamente cellulare indotta sottolinea comunemente associati con altre metodologie ciclo cellulare di sincronizzazione 10. Nelle sezioni seguenti si discuterà la metodologia, così come alcune delle sue applicazioni nella ricerca biomedica.

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Measuring Cell Cycle Progression Kinetics with Metabolic Labeling and Flow Cytometry

Monitoraggio sottili cambiamenti nella progressione e cinetica di fasi del ciclo cellulare può essere realizzata mediante l&#39;uso di una combinazione di marcatura metabolica di acidi nucleici con BrdU e DNA genomico totale colorazione tramite ioduro di propidio. Questo metodo evita la necessità di sincronizzazione chimica del ciclo cellulare, impedendo l&#39;introduzione di non-specifico danno al DNA, che a sua volta influisce progressione del ciclo cellulare.

Cella di misura Kinetics progressione del ciclo con la marcatura metabolica e citometria a flusso

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating ...

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Research

JoVE Journal

Biology

21.0K Views.  University of British Columbia. Monitoraggio sottili cambiamenti nella progressione e cinetica di fasi del ciclo cellulare può essere realizzata mediante l'uso di una combinazione di marcatura metabolica di acidi nucleici con BrdU e DNA genomico totale colorazione tramite ioduro di propidio. Questo metodo evita la necessità di sincronizzazione chimica del ciclo cellulare, impedendo l'introduzione di non-specifico danno al DNA, che a sua volta influisce progressione del ciclo cellulare.

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Measuring Exocytosis in Neurons Using FM Labeling

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time imaging of vesicles labeled with FM dye to monitor the rate of presynaptic vesicle release.  FM4-64 is a red fluorescent amphiphilic styryl dye that embeds into the membranes of synaptic vesicles as endocytosis is stimulated.  Lipophilic interactions cause the dye to greatly increase in fluorescence, thus emitting a bright signal when associated with vesicles and a nominal one when in the extracellular fluid. After a wash step is used to help remove external dye within the plasma membrane, the remaining FM is concentrated within the vesicles and is then expelled when exocytosis is induced by another round of electrical stimulation. The rate of vesicles release is measured from the resulting decrease in fluorescence.  Since FM dye can be applied external and transiently, it is a useful tool for determining rates of exocytosis in neuronal cultures, especially when comparing the rates between transfected synapses and neighboring control boutons.



The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission. Here we used real-time imaging of vesicles labeled with the red fluorescent dye FM 4-64 to measure the rate of presynaptic vesicle release in hippocampal neuronal cultures.

Misurare esocitosi nei neuroni Utilizzando Etichettatura FM

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time ...

Ricerca

Biologia

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the unique differentiation programs that are manifest during meiosis. Two principal methods have been developed to purify, to varying degrees, various meiotic fractions from both adult and immature animals: elutriation or Staput (sedimentation) using BSA and/or percoll gradients. Both of these methods rely on cell size and density to separate meiotic cells1-5. Overall, except for few cell populations6, these protocols fail to yield sufficient purity of the numerous meiotic cell populations that are necessary for detailed molecular analyses. Moreover, with such methods usually one type of meiotic cells can be purified at a given time, which adds an extra level of complexity regarding the reproducibility and homogeneity when comparing meiotic cell samples.
Here, we describe a refined method that allows one to easily visualize, identify, and purify meiotic cells, from germ cells to round spermatids, using FACS combined with Hoechst 33342 staining7,8. This method provides an overall snapshot of the entire meiotic process and allows one to highly purify viable cells from most stage of meiosis. These purified cells can then be analyzed in detail for molecular changes that accompany progression through meiosis, for example changes in gene expression9,10and the dynamics of nucleosome occupancy at hotspots of meiotic recombination11.

An efficient method to obtain highly purified viable meiotic fractions from mouse testis is described, which combines a refined cell dissociation protocol with fluorescent activated cell sorting (FACS). This method takes advantage of differences in the DNA content and nuclear density of discrete meiotic fractions.

Purificazione Citometria a flusso di cellule di topo Meiotic

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae zygotes result from the fusion of haploid cells of distinct mating type (MATa, MATalpha) and give rise to corresponding stable diploids that successively generate as many as 20 diploid progeny as a result of their strikingly asymmetric mitotic divisions 2. Zygote formation is orchestrated by a complex sequence of events: In this process, soluble mating factors bind to cognate receptors, triggering receptor-mediated signaling cascades that facilitate interruption of the cell cycle and culminate in cell-cell fusion. Zygotes may be considered a model for progenitor or stem cell function.
Although much has been learned about the formation of zygotes and although zygotes have been used to investigate cell-molecular questions of general significance, almost all studies have made use of mating mixtures in which zygotes are intermixed with a majority population of haploid cells 3-8. Many aspects of the biochemistry of zygote formation and the continuing life of the zygote therefore remain uninvestigated.
Reports of purification of yeast zygotes describe protocols based on their sedimentation properties 9; however, this sedimentation-based procedure did not yield nearly 90% purity in our hands. Moreover, it has the disadvantage that cells are exposed to hypertonic sorbitol. We therefore have developed a versatile purification procedure. For this purpose, pairs of haploid cells expressing red or green fluorescent proteins were co-incubated to allow zygote formation, harvested at various times, and the resulting zygotes were purified using a flow cytometry-based sorting protocol. This technique provides a convenient visual assessment of purity and maturation. The average purity of the fraction is approximately 90%. According to the timing of harvest, zygotes of varying degrees of maturity can be recovered. The purified samples provide a convenient point of departure for "-omic" studies, for recovery of initial progeny, and for systematic investigation of this progenitor cell.

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

To purify zygotes of S. cerevisiae, haploid cells of opposite mating type were engineered to express red or green fluorescent proteins, co-incubated to allow zygote formation, and fractionated using a flow cytometry-based protocol. The highly-enriched fraction enables subsequent "-omic" studies, recovery of initial progeny, and systematic investigation of zygote morphogenesis.

Flusso Cytometry basata Purificazione<em&gt; S. cerevisiae</em&gt; Zigoti

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of different cell types in vitro and in vivo.1-5 Although there are literally thousands of publications using such dyes, some of the most commonly encountered cell tracking applications include monitoring of:
<ol>
	<li>stem and progenitor cell quiescence, proliferation and/or differentiation6-8</li>
	<li>antigen-driven membrane transfer9 and/or precursor cell proliferation3,4,10-18 and</li>
	<li>immune regulatory and effector cell function1,18-21.</li>
</ol>
Commercially available cell tracking dyes vary widely in their chemistries and fluorescence properties but the great majority fall into one of two classes based on their mechanism of cell labeling. "Membrane dyes", typified by PKH26, are highly lipophilic dyes that partition stably but non-covalently into cell membranes1,2,11. "Protein dyes", typified by CFSE, are amino-reactive dyes that form stable covalent bonds with cell proteins4,16,18. Each class has its own advantages and limitations. The key to their successful use, particularly in multicolor studies where multiple dyes are used to track different cell types, is therefore to understand the critical issues enabling optimal use of each class2-4,16,18,24.
The protocols included here highlight three common causes of poor or variable results when using cell-tracking dyes. These are:
<ol>
	<li>Failure to achieve bright, uniform, reproducible labeling. This is a necessary starting point for any cell tracking study but requires attention to different variables when using membrane dyes than when using protein dyes or equilibrium binding reagents such as antibodies.</li>
	<li>Suboptimal fluorochrome combinations and/or failure to include critical compensation controls. Tracking dye fluorescence is typically 102 - 103 times brighter than antibody fluorescence. It is therefore essential to verify that the presence of tracking dye does not compromise the ability to detect other probes being used.</li>
	<li>Failure to obtain a good fit with peak modeling software. Such software allows quantitative comparison of proliferative responses across different populations or stimuli based on precursor frequency or other metrics. Obtaining a good fit, however, requires exclusion of dead/dying cells that can distort dye dilution profiles and matching of the assumptions underlying the model with characteristics of the observed dye dilution profile.</li>
</ol>
Examples given here illustrate how these variables can affect results when using membrane and/or protein dyes to monitor cell proliferation.

Successful use of cell tracking dyes to monitor immune cell function and proliferation involves several critical steps. We describe methods for: 1) obtaining bright, uniform, reproducible label-ing with membrane dyes; 2) selecting fluorochromes and data acquisition conditions; and 3) choosing a model to quantify cell proliferation based on dye dilution.

Ottimizzato Metodi di modellazione e colorazione proliferazione per il monitoraggio divisione cellulare utilizzando coloranti Tracking Cellulari

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Spermatozoa are male reproductive cells especially designed to reach, recognize and fuse with the egg. To perform these tasks, sperm cells must be prepared to face a constantly changing environment and to overcome several physical barriers. Being in essence transcriptionally and translationally silent, these motile cells rely profoundly on diverse signaling mechanisms to orient themselves and swim in a directed fashion, and to contend with challenging environmental conditions during their journey to find the egg. In particular, Ca2+-mediated signaling is pivotal for several sperm functions: activation of motility, capacitation (a complex process that prepares sperm for the acrosome reaction) and the acrosome reaction (an exocytotic event that allows sperm-egg fusion). The use of fluorescent dyes to track intracellular fluctuations of this ion is of remarkable importance due to their ease of application, sensitivity, and versatility of detection. Using one single dye-loading protocol we utilize four different fluorometric techniques to monitor sperm Ca2+ dynamics. Each technique provides distinct information that enables spatial and/or temporal resolution, generating data both at single cell and cell population levels.

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Intracellular Ca2+ dynamics are very important in sperm physiology and Ca2+-sensitive fluorescent dyes constitute a versatile tool to study them. Population experiments (fluorometry and stopped flow fluorometry) and single cell experiments (flow cytometry and single cell imaging) are used to track spatio-temporal [Ca2+] changes in human sperm cells.

Misurare intracellulare Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Modifiche di sperma umano utilizzando quattro tecniche: fluorometria convenzionale, si fermò fluorometria Flow, Citometria a flusso singolo e l&#39;imaging cellulare

Spermatozoa  are male reproductive cells especially designed to reach, recognize and fuse  with the egg. To perform these tasks, sperm cells must be ...

Metabolic Labeling of Leucine Rich Repeat Kinases 1 and 2 with Radioactive Phosphate

Leucine rich repeat kinases 1 and 2 (LRRK1 and LRRK2) are paralogs which share a similar domain organization, including a serine-threonine kinase domain, a Ras of complex proteins domain (ROC), a C-terminal of ROC domain (COR), and leucine-rich and ankyrin-like repeats at the N-terminus. The precise cellular roles of LRRK1 and LRRK2 have yet to be elucidated, however LRRK1 has been implicated in tyrosine kinase receptor signaling1,2, while LRRK2 is implicated in the pathogenesis of Parkinson's disease3,4. In this report, we present a protocol to label the LRRK1 and LRRK2 proteins in cells with 32P orthophosphate, thereby providing a means to measure the overall phosphorylation levels of these 2 proteins in cells. In brief, affinity tagged LRRK proteins are expressed in HEK293T cells which are exposed to medium containing 32P-orthophosphate. The 32P-orthophosphate is assimilated by the cells after only a few hours of incubation and all molecules in the cell containing phosphates are thereby radioactively labeled. Via the affinity tag (3xflag) the LRRK proteins are isolated from other cellular components by immunoprecipitation. Immunoprecipitates are then separated via SDS-PAGE, blotted to PVDF membranes and analysis of the incorporated phosphates is performed by autoradiography (32P signal) and western detection (protein signal) of the proteins on the blots. The protocol can readily be adapted to monitor phosphorylation of any other protein that can be expressed in cells and isolated by immunoprecipitation.

Leucine rich repeat kinases 1 and 2 (LRRK1 and LRRK2) are multidomain proteins which encode both GTPase and kinase domains and which are phosphorylated in cells. Here, we present a protocol to label LRRK1 and LRRK2 in cells with 32P orthophosphate, thereby providing a means to measure their overall cellular phophorylation levels.

Metabolica Etichettatura di leucina Rich Repeat chinasi 1 e 2 con Radioactive fosfato

Leucine rich repeat kinases 1 and 2 (LRRK1 and LRRK2) are paralogs which share a similar domain organization, including a serine-threonine kinase domain, ...

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling processes. Extracting sterol-enriched membrane microdomains from plant cells for proteomic analysis is a difficult task mainly due to multiple preparation steps and sources for contaminations from other cellular compartments. The plasma membrane constitutes only about 5-20% of all the membranes in a plant cell, and therefore isolation of highly purified plasma membrane fraction is challenging. A frequently used method involves aqueous two-phase partitioning in polyethylene glycol and dextran, which yields plasma membrane vesicles with a purity of 95% 1. Sterol-rich membrane microdomains within the plasma membrane are insoluble upon treatment with cold nonionic detergents at alkaline pH. This detergent-resistant membrane fraction can be separated from the bulk plasma membrane by ultracentrifugation in a sucrose gradient 2. Subsequently, proteins can be extracted from the low density band of the sucrose gradient by methanol/chloroform precipitation. Extracted protein will then be trypsin digested, desalted and finally analyzed by LC-MS/MS. Our extraction protocol for sterol-rich microdomains is optimized for the preparation of clean detergent-resistant membrane fractions from Arabidopsis thaliana cell cultures.
We use full metabolic labeling of Arabidopsis thaliana suspension cell cultures with K15NO3 as the only nitrogen source for quantitative comparative proteomic studies following biological treatment of interest 3. By mixing equal ratios of labeled and unlabeled cell cultures for joint protein extraction the influence of preparation steps on final quantitative result is kept at a minimum. Also loss of material during extraction will affect both control and treatment samples in the same way, and therefore the ratio of light and heave peptide will remain constant. In the proposed method either labeled or unlabeled cell culture undergoes a biological treatment, while the other serves as control 4.

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Here we describe a robust method for the fractionation of plant plasma membranes into detergent resistant and detergent soluble membranes based on a mixture of unlabeled and in vivo fully 15N labeled Arabidopsis thaliana cell cultures. The procedure is applied for comparative proteomic studies to understand signaling processes.

Metabolic Etichettatura e con membrana frazionamento per proteomica comparativa Analisi del<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Culture sospensione cellulare

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

Temporal Tracking of Cell Cycle Progression Using Flow Cytometry without the Need for Synchronization

This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell synchronization can be difficult for many cell systems. Standard practice is to block cell cycle progression at a specific stage and then release the accumulated cells producing a wave of cells progressing through the cycle in unison. However, some cell types find this block toxic resulting in abnormal cell cycling, or even mass death. Bromodeoxyuridine (BrdU) uptake can be used to track the cell cycle stage of individual cells. Cells incorporate this synthetic thymidine analog, while synthesizing new DNA during S phase. By providing BrdU for a brief period it is possible to mark a pool of cells that were in S phase while the BrdU was present. These cells can then be tracked through the remainder of the cell cycle and into the next round of replication, permitting the duration of the cell cycle phases to be determined without the need to induce a potentially toxic cell cycle block. It is also possible to determine and correlate the expression of both internal and external proteins during subsequent stages of the cell cycle. These can be used to further refine the assignment of cell cycle stage or assess effects on other cellular functions such as checkpoint activation or cell death.

This protocol describes the use of bromodeoxyuridine (BrdU) uptake to permit the temporal tracking of cells that were in S phase at a specific point in time. Addition of DNA dyes and antibody labeling facilitates detailed analysis of the fate of the S phase cells at later times.

Monitoraggio temporale del ciclo cellulare progressione citometria a flusso, senza la necessità di sincronizzazione

This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell ...

LED Thermo Flow &#8212; Combining Optogenetics with Flow Cytometry

Optogenetic tools allow isolated, functional investigations of almost any signaling molecule within complex signaling pathways. A major obstacle is the controlled delivery of light to the cell sample and hence the most popular tools for optogenetic studies are microscopy-based cell analyses and in vitro experiments. The flow cytometer has major advantages over a microscope, including the ability to rapidly measure thousands of cells at single cell resolution. However, it is not yet widely used in optogenetics. Here, we present a device that combines the power of optogenetics and flow cytometry: the LED Thermo Flow. This device illuminates cells at specific wavelengths, light intensities and temperatures during flow cytometric measurements. It can be built at low cost and be used with most common flow cytometers. To demonstrate its utility, we characterized the photoswitching kinetics of Dronpa proteins in vivo and in real time. This protocol can be adapted to almost all optically controlled substances and substantially expands the set of possible experiments. More importantly, it will greatly simplify the discovery and development of new optogenetic tools.

LED Thermo Flow &amp;#8212; Combining Optogenetics with Flow Cytometry

Optically controlled substances are powerful tools to study signaling pathways. To expand the spectrum of possible experiments, we developed a device for studying optically controlled substances in real time using flow cytometry: the LED Thermo Flow.

Thermo flusso LED - La combinazione Optogenetics con citometria a flusso

Optogenetic tools allow isolated, functional investigations of almost any signaling molecule within complex signaling pathways. A major obstacle is the ...

Measuring Endoreduplication by Flow Cytometry of Isolated Tuber Protoplasts

Endoreduplication, the replication of a cell's nuclear genome without subsequent cytokinesis, yields cells with increased DNA content and is associated with specialization, development and increase in cellular size. In plants, endoreduplication seems to facilitate the growth and expansion of certain tissues and organs. Among them is the tuber of potato (Solanum tuberosum), which undergoes considerable cellular expansion in fulfilling its function of carbohydrate storage. Thus, endoreduplication may play an important role in how tubers are able to accommodate this abundance of carbon. However, the cellular debris resulting from crude nuclear isolation methods of tubers, methods that can be used effectively with leaves, precludes the estimation of the tuber endoreduplication index (EI). This article presents a technique for assessing tuber endoreduplication through the isolation of protoplasts while demonstrating representative results obtained from different genotypes and compartmentalized tuber tissues. The major limitations of the protocol are the time and reagent costs required for sample preparation as well as relatively short lifespan of samples after lysis of protoplasts. While the protocol is sensitive to technical variation, it represents an improvement over traditional methods of nuclear isolation from these large specialized cells. Possibilities for improvements to the protocol such as recycling enzyme, the use of fixatives, and other alterations are proposed.

The protocol described herein is a method for measuring endoreduplication within tubers of potato (Solanum tuberosum). It includes plasmolysis and protoplast extraction steps to decrease the noise and debris in downstream flow cytometric analysis.

Endoreduplicazione tramite flusso Cytometry di tubero isolato protoplasti di misura

Endoreduplication, the replication of a cell's nuclear genome without subsequent cytokinesis, yields cells with increased DNA content and is associated ...