Gli autori In particolare, desidero ringraziare le seguenti persone per il loro contributo tecnico e intellettuale allo sviluppo di questi metodi nel corso degli anni: Bruce Bagwell (Verity Software House), Nadège Bercovici (IDM), Lizanne Breslin (Zynaxis cellulare Scienza e la ricerca PTI) , Brian Gray (PTI Research), Jan Fisher (Dartmouth Medical School), Alice Givan (Dartmouth Medical School), Betsy Ohlsson-Wilhelm (SciGro, Inc.), e Mary Waugh (Dartmouth Medical School). Avrebbero anche ringraziare la classe Bowdoin del 2006 dai Corsi Annuali di metodi di ricerca e applicazioni della citometria a flusso, che hanno generato i dati mostrati nella Figura 2. La citometria a flusso è stata effettuata presso il Laboratorio di flusso Roswell Park Cancer Institute di Citometria, che è stato istituito in parte da contributi in conto impianti del Programma NIH strumento condiviso, e riceve sostegno da parte del Sussidio Core (5 P30 CA016056-29) dal NazionaleCancer Institute a Roswell Park Cancer Institute, e presso il Centro di Citometria a Flusso Abramson Cancer and Laboratory risorse cella Ordinamento della University of Pennsylvania, che è stato istituito in parte da contributi in conto impianti del Programma NIH strumento condiviso, e riceve il sostegno di NIH # 2P30 CA016520 dal National Cancer Institute. Il lavoro illustrato nelle figure 3 e 5, è stata sostenuta anche in parte da SBIR concessione EB00228 dal National Institute of Biomedical Imaging e Bioingegneria (NIBIB) assegnato a PTI Research, Inc.

1. Membrana Etichettatura generale con PKH26 Dye cellulare Tracking (Rif. 25, Figura 1) <ol><li> Utilizzare la tecnica sterile per i passaggi 1,1-1,9. Preparare ~ 10 7 cellule mononucleari del sangue periferico umano o linfociti (hPBMC, HPBL) usando il metodo standard del laboratorio con l&#39;aggiunta di un ultimo giro 300 xg per minimizzare la contaminazione delle piastrine. Risospendere le cellule a 10 7 / ml di BSA in HBSS +1% e posto sul ghiaccio, riservando da 500 microlitri aliquota (5x10 6 cellule) per l&#39;uso nella Fase 2. </li><li> Luogo 5x10 6 celle (500 pl) in una da 12 x 75 millimetri tubo di polipropilene conica. Lavare una volta con 3,5 ml di HBSS. Aspirare accuratamente il supernatante, lasciando non più di 15-25 ml di liquido residuo, ma facendo attenzione a non rimuovere le cellule. La fiala per preparare una sospensione 2x cella nel passo 1,4. </li><li> Durante la fase di lavaggio in cella 1,2, aggiungere 0,5 ml di veicolo diluente etichettatura C (dal kit PKH26GL) per un x 12 75 millimetri tubo di polipropilene conica. La fiala di preparazionesono una soluzione 2x PKH26 nel Passo 1,5. </li><li> Aggiungere 0,5 ml di diluente veicolo etichettatura C al pellet lavato dal punto 1.2 e aspirare e dispensare 3-4 volte per ottenere una sospensione di cellule singole (2x cellule). Evitare la formazione di bolle e miscelazione eccessiva, che può ridurre la vitalità cellulare e di recupero. </li><li> Subito dopo aver preparato la sospensione 2x cellulare al punto 1.4, preparare un 2x (4 mM) soluzione colorante con l&#39;aggiunta di 2,0 ml di 1,0 mM PKH26 magazzino colorante in etanolo (dal kit PKH26GL) al tubo C diluente preparata al punto 1.3 e al vortice disperdere uniformemente. </li><li> Subito dopo la preparazione della soluzione 2x colorante al punto 1.5, rapidamente pipettare la sospensione 2x cella da 1,4 passo nella soluzione colorante 2x e contemporaneamente aspirare e dispensare 3-4 volte per disperdere completamente le cellule nelle tinture Non:. Aggiungere 1,0 mM colorante direttamente alla cellule, versare cellule 2x 2x in colorante, oppure aggiungere celle a 2x 2x colorante mentre vortex. Perché colorazione è quasi istantaneo, tali metodi produrre menointensità uniformi rispetto al metodo consigliato (Figura 2). </li><li> Dopo 1 minuto, aggiungere 1,0 ml di siero inattivato con il calore o BSA HBSS +5% per fermare l&#39;assorbimento colorante all&#39;interno della membrana cellulare. Il mancato utilizzo abbastanza proteine ​​rischia la formazione di aggregati di colorante, che può pellet con cellule durante le fasi di lavaggio e causare etichettatura involontaria di altre cellule presenti in un esperimento. Se medio con calore siero inattivato al 10% (CM) o HBSS 1% BSA deve essere utilizzato come reagente di arresto, eseguire la colorazione in un tubo di polipropilene 15 ml conica e aggiungere almeno 5,0 ml di reagente di arresto per assicurare adsorbimento di tutti prive di personalità giuridica colorante. </li><li> Centrifugare le cellule marcate per 5 min @ ~ 400 x g. Aspirare accuratamente il supernatante senza rimuovere le cellule. Lavare il pellet due volte con 4 ml di HBSS CM o BSA 1%, disperdendo il pellet ben prima recentrifugation. Per minimizzare riporto di colorante adsorbito sulle pareti del tubo e massimizzare l&#39;efficacia del lavaggio, trasferire le cellule a un tubo di polipropilene fresco dopo la fiRST risospensione. Nota: le cellule colorate adeguatamente esporrà una tinta rosa distinto nel pellet. </li><li> Risospendere il pellet di cellule in lavato 1,0% ml HBSS BSA +1. Contare le cellule, determinare il recupero delle cellule, e regolare il volume per dare una concentrazione finale di 10 7 / ml. Con aspirazione attento, il recupero delle cellule dovrebbe essere ≥ 85%. Se il recupero delle cellule è &lt;70%, determinare la causa prima di procedere ulteriormente. Prelevare un&#39;aliquota di 150 microlitri (1.5x10 6 celle) e posto in ghiaccio per l&#39;uso al punto 2. </li></ol> 2. Preparazione dei controlli di configurazione dello strumento e del test (Tabella 1) <ol><li> Aliquotare 50 pl (5x10 5) di cellule non marcate dalla sospensione cellulare salvato nel passaggio 1,1 in ciascuna delle cinque 1,8 ml provette Eppendorf: 1, 3, 4, 5, e 7. Aliquotare 50 pl (5x10 5) di cellule PKH26 POS Passo 1,9 in ciascuna delle tre provette: 2, 6 e 8. </li><li> Aggiungere 10 microlitri IgG blocco (100 mg / tubo di IgG, si veda la tabella dei reagenti) per Tubi 1-8e incubare per 10 min a temperatura ambiente (20-25 ° C). </li><li> Aggiungere una quantità saturante dell&#39;anticorpo (i) indicato nella Tabella 1 nelle provette 4, 5, 7, e 8 e incubare tutti i campioni (Tubi 1-8) per 30 min a temperatura ambiente e al riparo dalla luce. </li><li> Aggiungere 1,5 ml di HBSS BSA 1% di tutti i campioni, il pellet per centrifugazione (5 min @ 400 xg) e lavare una volta con 1,5 ml di HBSS 1% BSA, con aspirazione attenzione per evitare perdita di cellule. </li><li> Risospendere ogni campione in 500 ml di BSA HBSS +1%. Se necessario per i campioni da analizzare sul citometro, trasferire in un tubo da 12 x 75 mm in basso rotondo. Aggiungere 10 microlitri di 100 pg / ml 7-AAD giornaliera stock di lavoro (vedi tabella dei reagenti) Tubi a 3, 6, 7 e 8, come indicato nella tabella 1. Incubare in ghiaccio per 30 minuti prima di utilizzare nella configurazione di flusso citometro e verifica colorazione (Fase 3). </li></ol> 3. Configurazione portata Citometro e verifica colorazione <ol><li> Verificare che il flusso cytometer funziona correttamente, mediante procedure definite dal laboratorio per il controllo di qualità giornaliero. Verificare che i segnali possono essere prontamente individuato in ciascuna finestra spettrale da utilizzare, e che le risposte del rivelatore sono linearmente proporzionale alla intensità del segnale della finestra da utilizzare per il controllo della proliferazione 14. </li><li> Acquisire FSC e SSC dati per tubo 1 utilizzando scale di visualizzazione lineari. Regolare l&#39;amplificazione di ogni rivelatore in modo che la popolazione linfocitaria cade nel quadrante in basso a sinistra del diagramma a punti, non è fuori scala in entrambi i parametri, e non è interrotta a causa di soglia. Raccogliere dati ungated FSC e SSC per tutti i campioni in Piazza di 3,3-3,7. </li><li> Acquisire dati per il tubo 1, senza utilizzare la compensazione del colore e scale di visualizzazione logaritmica per tutti e 4 rivelatori di fluorescenza. Regolare alta tensione ciascun sensore (HV) per posizionare l&#39;autofluorescenza di linfociti non colorati sulla scala con pochi / nessun accumulo di cellule nel primo canale. Impostare un limite di analisi per ogni istogrammacorrispondente al più luminoso del 2% delle cellule non colorati. </li><li> Utilizzo senza la compensazione del colore e le impostazioni HV con sede in Piazza di 3.2 e 3.3, l&#39;acquisizione dei dati per il tubo 2, la raccolta FSC, SSC e segnali in tutti e 4 rivelatori di fluorescenza. Per il rivelatore utilizzato per monitorare PKH26 fluorescenza, verificare che tutte le cellule PKH26 pos appaiono su scala come picco singolo simmetrica nella decade 3 ° -4 °, con poche cellule / no l&#39;ultimo canale. Se ci sono più picchi o la forma del picco è inclinata, ripetere il passaggio 1 con particolare attenzione al sale minimizzazione e la tecnica di miscelazione (Figura 2). Se necessario, regolare concentrazione di colorante. </li><li> Utilizzo delle impostazioni stabilite al punto 3.3, l&#39;acquisizione dei dati per il tubo 3, la raccolta di FSC, SSC e segnali in tutti e 4 rivelatori di fluorescenza. Per il rivelatore utilizzato per monitorare 7-AAD fluorescenza, verificare che 7-AAD cellule pos cadere al di sopra del limite del 2% stabilito al punto 3.3 (vale a dire, che non vitali delle cellule sono ben risoltivitali da 7-AAD cellule neg). </li><li> Utilizzo delle impostazioni stabilite al punto 3.3, l&#39;acquisizione dei dati per il tubo 4, la raccolta di FSC, SSC e segnali in tutti e 4 rivelatori di fluorescenza. Verificare che le cellule CD8 pos sono ben risolti da cellule non marcate (ad esempio, caduta sopra il limite del 2% stabilito al punto 3.3 per il rivelatore FITC). Ripetere con tubo 5 e verificare che le cellule CD8 pos sono ben risolti da cellule non marcate (ad esempio caduta sopra il limite del 2% stabilito al punto 3.3 per il rivelatore APC). </li><li> Impostazioni con sede in Fase 3.3, acquisire dati per i tubi 6, 7 e 8, raccogliendo FSC, SSC e segnali in tutte le quattro rivelatori di fluorescenza. </li><li> Utilizzare i file di elenco in modalità raccolti per le provette 1-5 e il software di compensazione del colore per stabilire un colore si sovrappongono matrice per ogni fluorocromo nei rivelatori utilizzati per monitorare i tre fluorocromi altri. Applicare questa matrice al file di elenco modalità per Campione 6 e verificare che la presenza di PKH26 labEling non altera la capacità di individuare 7-AAD cellule pos. </li><li> Applicare il colore si sovrappongono matrice dal punto 3.8 a il file elenco modalità di Campione 7 e verificare che: a) 3 sottopopolazioni ben risolte (CD3 CD4, CD3 neg neg pos neg CD4 e CD3 CD4 pos pos) possono essere identificati su un FITC vs APC dot plot, e b) la presenza di anticorpi anti-CD3-FITC e anti-CD4-APC non altera la capacità di individuare 7-AAD cellule pos. Se la presenza di anticorpi anti-CD3-FITC altera il limite superiore al 2% per i dati raccolti sul rivelatore PKH26, regolare il confine come richiesto. </li><li> Applicare la matrice colore sovrapposizione dal punto 3.8 a il file elenco modalità di Campione 8. Se la presenza di PKH26 etichettatura altera il limite del 2% per il FITC, 7-AAD o rivelatori di APC da quelle impostate utilizzando il controllo autofluorescenza al punto 3.3, regolare di nuovo il confine (i) in base alle esigenze utilizzando Tube 7 della tabella 1 e verificare che È ancora possibile distinguish CD3 CD4 pos pos, pos CD3 CD4 neg, CD3 e CD4 neg neg cellule utilizzando il limite impostato (i). </li></ol> 4. Proliferazione Selezione del modello per il monitoraggio cellulare Divisione mediante diluizione Dye <ol><li> Determinare la spaziatura tra le generazioni, che dipende dal numero di canali e decenni logaritmiche sul citometro. Per gli strumenti digitali, questo valore, tipicamente 4 o 5 decenni, è determinato dal numero di bidoni nel processore di segnale digitale. Negli strumenti analogici, dove il numero di decenni, è raramente un numero intero, la modellazione accurata richiede il numero preciso di decenni per essere determinati sperimentalmente. Per fare questo, i dati da una miscela di grani calibrati fluorescenti con quelle-assegnate relative intensità viene acquisito le stesse impostazioni del rivelatore ad alta tensione utilizzati nell&#39;esperimento. La posizione dei picchi tallone consente la calibrazione della scala logaritmica in termini di intCampo ensity per decade logaritmica. Specificamente, questo viene fatto disegnando il numero di canale per ogni tipo di tallone contro il registro del produttore-valore assegnato. La pendenza di un best-fit linea retta per i valori dei dati tallone dà il numero di unità di intensità relative per canale. Moltiplicato per il numero di canali, questo valore è quindi il numero di decenni di registro per il fondo scala, da cui il numero dei canali corrispondenti a una duplice riduzione dell&#39;intensità (cioè, la spaziatura generazione figlia) può essere calcolato 14. </li><li> Decidere se utilizzare una distanza fissa tra le generazioni o per consentire la spaziatura di galleggiare. A Standard (fisso) si avrà di utilizzare il valore di spaziatura generazionale determinato al punto 4.5 per assegnare la posizione di ogni generazione, e viene solitamente utilizzato quando l&#39;istogramma manca picchi distinti. Un&#39;impostazione galleggiante permette ad ogni posizione di picco generazionale deve essere determinato dalla forma dell&#39;istogramma e viene in genere utilizzato quando distinguishablpicchi elettronici generazionali sono evidenti. </li><li> Decidere se utilizzare una larghezza fissa di picco per tutte le generazioni o una larghezza variabile. Una larghezza fissa utilizza la SD calcolato per il campione di controllo non stimolato per modellare tutte le generazioni ed è di solito scelto quando il campione non ha distinguibili picchi generazionali. Una larghezza variabile consente al programma di variare indipendentemente l&#39;SD per ogni generazione e viene utilizzato al meglio con distinguibili picchi generazionali. </li><li> Eseguire un programma che contiene un modulo di analisi di proliferazione (qui ModFit LT versione 3.3). Caricare il file di pos PKH26 stimolato dal set di dati da analizzare (ad esempio, un stimolato 96 ore di cultura PKH26 cellule pos di contrasto come per tubo 8 della tabella 1). </li><li> Selezionare i parametri per l&#39;analisi, in questo caso PKH26 (585/42) con gate sui vitali (7-AAD neg) CD3 linfociti pos e FSC e SSC di escludere detriti piccoli e grandi aggregati (Figura 3). Nel definirequeste regioni attenzione per includere l&#39;area ad alta dispersione in avanti, dove esplosioni sono tipicamente presenti e si noti che CD3 espressione può essere down-modulata in colture stimolate. </li><li> Creare un nuovo modello di proliferazione utilizzando la procedura guidata proliferazione. Utilizzo del file Open Data (scheda Start), caricare il file di controllo non stimolato PKH26 pos e definire la posizione del canale di picco nella distribuzione dei genitori corrispondente alle cellule indivisi. </li><li> Analizzare il file per il controllo non stimolato PKH26 pos, rilevando i valori di posizione di picco dei genitori e la larghezza (deviazione standard). Se una larghezza fissa di picco (SD) si desidera, selezionare Blocco SD. </li><li> Caricare il neg PKH26 controllo (ad esempio, a 96 ore di coltura PKH26 cellule neg controcolorate come per Tube 7 in Tabella 1). Regolare il numero di generazioni impostando il canale di picco per la più debole generazione di sopra del neg PKH26 controllo. Questo determina il number delle generazioni figlie del modello può adattarsi con precisione ed è in genere 6-9 generazioni. </li><li> Aprire il file di dati per il campione stimolata (ad esempio, un stimolato 96 ore di cultura PKH26 cellule pos di contrasto come per tubo 8 della tabella 1) e confermare che le regioni per la posizione di picco dei genitori e del SD di cui al punto 4,7 rimangono invariati. Se la spaziatura fissa generazionale si desidera, selezionare l&#39;opzione Modello standard, altrimenti selezionare l&#39;opzione mobile. </li><li> Analizza ogni file sperimentale nel set di dati, utilizzando lo stesso modello definito al punto 4.9. Variare leggermente la posizione di picco dei genitori può essere necessario per la misura meglio definiti sia visivamente che dal ridotto chi quadrato (RCS) valore. </li><li> Registrare i parametri desiderati proliferazione derivanti dal best-fit per ogni file sperimentale nel set di dati. Per una descrizione completa dei parametri possibili, vedere rif. 22. </li></ol>

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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+flow+cytometric+assays+for+monitoring+cell-mediated+cytotoxicity.">New flow cytometric assays for monitoring cell-mediated cytotoxicity.</a> Expert Rev. Vaccines. 9, 601-616 (2010).</li><li>Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interpretation+of+cellular+proliferation+data:+Avoid+the+panglossian.">Interpretation of cellular proliferation data: Avoid the panglossian.</a> Cytometry. 79A, 95-101 (2011).</li><li>Quah, B. J. C., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Use+of+Carboxyfluorescein+Diacetate+Succinimidyl+Ester+(CFSE)+to+Monitor+Lymphocyte+Proliferation.">The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) to Monitor Lymphocyte Proliferation.</a> J. Vis. Exp. (44), e2259 (2010).</li><li>Houlihan, D. D., Newsome, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+Review+of+Clinical+Trials+of+Bone+Marrow+Stem+Cells+in+Liver+Disease.">Critical Review of Clinical Trials of Bone Marrow Stem Cells in Liver Disease.</a> Gastroenterology. 135, 438-450 (2008).</li><li>Brusko, T. M., Hulme, M. A., Myhr, C. B., Haller, M. J., Atkinson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+In+Vitro+Suppressive+Capacity+of+Regulatory.">Assessing the In Vitro Suppressive Capacity of Regulatory.</a> T Cells. Immunol. Invest. 36, 607-628 (2007).</li></ol>

K. Humphrey, JD Tario, Jr. e PK Wallace hanno ricevuto pre-commerciali reagenti cellulari di monitoraggio per la valutazione da Life Technologies, Inc. e BD Biosciences. AD Bantly e JS Moore hanno ricevuto pre-commerciali di monitoraggio cella reagenti per la valutazione da Life Technologies, Inc. e il finanziamento da PTI Research, Inc. per la pre-commerciale caratterizzazione di cellule CellVue vari monitoraggio coloranti. K. Muirhead è impiegato da SciGro, Inc., che fornisce servizi di consulenza per Phanos Technologies, Inc. (proprietario del PKH e coloranti CellVue) e fornisce il sostegno supporto tecnico per Sigma-Aldrich e molecolari tecnologie di targeting, Inc. (distributori di questi coloranti). Produzione e l&#39;accesso gratuito a questo articolo è sponsorizzato da Sigma-Aldrich.

I metodi descritti qui sono quelli che si trovano nei nostri laboratori combinati per dare più affidabile risultati ottimali per l&#39;etichettatura hPBMC utilizzando coloranti membrana 13,16,18 e per fenotipizzazione sottoinsieme dei linfociti e la proliferazione di monitoraggio utilizzando membrana o proteine ​​coloranti 2,11,13,16, 18. Come illustrato nelle figure 1 e 2, luminoso un&#39;etichettatura uniforme è più facilmente ottenuta limitando la presenza di sali fisiologiche e utilizzando una tecnica di miscelazione che si traduce in un rapido, omogeneo esposizione delle cellule alla stessa concentrazione di colorante. Perché colorazione con coloranti membrana avviene suddividendo nel doppio strato lipidico, altre variabili che alterano libera concentrazione di colorante può anche avere un impatto efficienza etichettatura. Per esempio, l&#39;etichettatura rotonde risultati polistirolo fondo tubi in lavaggio meno efficiente di sali prima di risospensione in Diluente C e anche in ridotta concentrazione libera colorante per tingere adsorbimento sulle pareti del tubo, in particolarea basse concentrazioni di colorante. Entrambi i fattori tendono a dare distribuzioni colorazione più ampi rispetto a quando l&#39;etichettatura sono realizzate utilizzando tubi di polipropilene coniche inferiori (figure 3, 4 e risultati non pubblicati). Età del campione e il tipo può colpire anche ampiezza del picco, anche quando le procedure di colorazione ottimizzati vengono utilizzati. Ad esempio, il curriculum vitae PKH26 pos linfociti isolati dal campo di sangue appena prelevato 14-20% (Figura 3, rif. 13 e dati non pubblicati), mentre il curriculum vitae linfociti isolati da 24 campioni di sangue ore vecchi o TRIMA gamma pheresis filtri 25-30 % (Figura 4 e cod. 18). Colorazione uniformità e la misura in cui cellule non vitali possono essere esclusi dall&#39;analisi sia influenzare il fatto picchi distinguibili figlia sono evidenti nel profilo diluizione colorante, che a sua volta influenza la scelta di un modello di proliferazione per adattare i dati osservati (figure 5 e 6 </strong&gt;). Anche se ModFit (Verity Software House, Topsham, ME) viene qui utilizzato come esempio di software utilizzato per generare metriche come indice di proliferazione e frequenza Precursore (figure 3, 5 e 6, Tabella 3), altri pacchetti contengono anche i moduli per l&#39;analisi dati proliferazione. Questi includono FCSExpress (De Novo Software, Los Angeles, CA) e FlowJo (Albero Star, Inc., Ashland, OR). Tutti questi programmi utilizzano una non-lineare dei minimi quadrati per trovare iterativamente la soluzione migliore per i dati grezzi modificando la posizione, l&#39;altezza e SD (o larghezza) di picchi gaussiani che rappresentano generazioni figlia sequenziali. Indice di proliferazione (PI) e frequenza Precursore (PF) sono le misure più comunemente usati di estensione della proliferazione. PI, come definito da ModFit, è una misura di aumento del numero di cellule nel corso del saggio, analogo al &#39;indice di stimolazione&#39; di un saggio di timidina. PF restituisce la frazione di cellule nel popolate inizialeioni che hanno risposto allo stimolo alla proliferazione. Si consiglia cautela, tuttavia, quando leggendo la letteratura a partire dal terminologia varia un po &#39;tra i pacchetti software (ad esempio, FlowJo e ModFit utilizzare definizioni e calcoli diversi per ciò che si intende per &quot;indice di proliferazione&quot;) 22. Le criticità discusse qui per l&#39;etichettatura e l&#39;analisi proliferazione con coloranti membrana sono anche incontrato quando si utilizza coloranti proteine. Per esempio, attenzione alla tecnica di miscelazione deve anche osservare, con esclusione delle cellule morte / morenti, per ottenere distribuzioni uniformi e picchi distinguibili figlia utilizzando CFSE (Figura 6) 2-4,13,18,24. Scelta appropriata di fluorocromi per fenotipizzazione e valutazione della redditività è importante anche al fine di evitare eccessive sovrapposizioni spettrali e l&#39;incapacità di riconoscere le cellule anticorpi positivi, in particolare con coloranti visibili proteine ​​che emettono come CFSE 2-4,11,13,16,18 </sup&gt;. La riduzione della concentrazione di colorante inseguimento diminuisce i problemi di compensazione in adiacenti canali spettrali, ma limita anche il numero di divisioni cellulari che possono essere monitorati prima di intensità cellula figlia iniziano a sovrapporsi con autofluorescenza. In alternativa, l&#39;uso di coloranti cellule più recenti di monitoraggio come il Claret emettitore rosso lontano CellVue (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) o viola emissione CellTrace Violet (Life Technologies, Grand Island, NY) possono ridurre i problemi di compensazione (Figura 6). Infine, sebbene coloranti membrana generalmente tendono a mostrare una minore tossicità 11,26, è possibile sovra-label cellule con o classe di colorante. È quindi sempre necessario verificare che la concentrazione del colorante tracciamento utilizzato non ha modificato la funzionalità delle cellule che devono essere monitorati (Figura 6) 3,13,16,18.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagente o attrezzature </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Acquistabile </td></tr><tr><td> 7-D Aminoactinomycin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A9400 </td><td></td></tr><tr><td> Albumina di siero bovino (BSA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A4503 </td><td></td></tr><tr><td> Siero bovino fetale (FBS) </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S11150 </td><td></td></tr><tr><td> Hanks soluzione salina bilanciata (HBSS) </td><td> Life Technologies </td><td> 14175-079 </td><td> Calcio e magnesio libero, senza rosso fenolo </td></tr><tr><td> IgG umane Cohn frazione II e III globuline </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G-4386 </td><td></td></tr><tr><td> Topo anti-CD3 umana-FITC </td><td> BD Biosciences </td><td> 349201 </td><td> Saturazione concentrazione determinata mediante titolazione di laboratorio </td></tr><tr><td> Mouse anti-umani CD4-APC </td><td> BD Biosciences </td><td> 340672 </td><td> Saturazione concentrazione determinata mediante titolazione di laboratorio </td></tr><tr><td> Mouse anti-umani CD4-PECy7 </td><td> BD Biosciences </td><td> 348799 </td><td> Saturazione concentrazione determinata mediante titolazione di laboratorio </td></tr><tr><td> Topo anti-CD8 umana-FITC </td><td> BD Biosciences </td><td> 347313 </td><td> Saturazione concentrazione determinata mediante titolazione di laboratorio </td></tr><tr><td> Topo anti-umano CD8-APC </td><td> Caltag (Life Technologies) </td><td> MHCD0805 </td><td> Saturazione concentrazione determinata mediante titolazione di laboratorio </td></tr><tr><td> Mouse Anti-Human CD19-APC </td><td> Caltag (Life Technologies) </td><td> MHCD1905 </td><td&gt; concentrazione di saturazione, come determinato mediante titolazione di laboratorio </td></tr><tr><td> Topo anti-CD25-APC umana </td><td> BD Biosciences </td><td> 340938 </td><td> Saturazione concentrazione determinata mediante titolazione di laboratorio </td></tr><tr><td> Topo anti-umano CD127-PE </td><td> BD Biosciences </td><td> 557938 </td><td> Saturazione concentrazione determinata mediante titolazione di laboratorio </td></tr><tr><td> Topo anti-CD3 umano </td><td> eBiosciences </td><td> 16-0037-85 </td><td> 1,0 mg / ml; azide libero </td></tr><tr><td> Topo anti-CD28 umano </td><td> eBiosciences </td><td> 16-0289-85 </td><td> 1,0 mg / ml; azide libero </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Gibco </td><td> 21300-058 </td><td></td></tr><tr><td> PKH26 rosso fluorescente linker kit cella contenente 10-3M PKH26 in EtOH e Diluente C </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> PKH26GL-1KT o MINI26-1KT </td><td> Procedure in Fase 1 si applicano anchedi kit contenenti PKH67 o coloranti CellVue altri </td></tr><tr><td> CellVue Claret lontano rosso fluorescente linker kit cella contenente 10 3M Claret CellVue in EtOH e Diluente C </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> MINCLARET-1KT o MIDCLARET-1KT </td><td></td></tr><tr><td> 5 - (e-6)-carbossifluoresceina diacetato, succinimmidil estere (CFDA-SE) </td><td> Invitrogen (Life Technologies) </td><td> C34554 </td><td> Non fluorescente; spaccati dalle esterasi membrana per formare fluorescente ammino-reattiva carbossifluoresceina succinimidyl estere (CFSE) </td></tr><tr><td> LIVE / DEAD Viola fissabile </td><td> Invitrogen (Life Technologies) </td><td> L34955 </td><td></td></tr><tr><td> Sterile 12 x 75 mm conica tubi di polipropilene &amp; berretti </td><td> VWR </td><td> 60818-102 </td><td> Fornisce una migliore efficienza della membrana colorante colorazione (tintura ridotto assorbimento, meno perdita di cellule durante l&#39;aspirazione supernatante) </td></tr><tr><td> 12 x 75 mm round fondo polistirolo tubi </td><td> Becton Dickinson </td><td> 21008-936 </td><td></td></tr><tr><td> Citometro di flusso </td><td> BD Bioscience </td><td> FACSCalibur LSRFortessa </td><td> Qualsiasi citometro grado di rilevare FITC, PKH26, e 7-AAD (es. 488 nm;. Em 520 nm, 567 nm e 655 nm, rispettivamente) e APC ex. 633-640 nm; em. 660 nm) </td></tr><tr><td> Citometro di flusso </td><td> Beckman Coulter </td><td> LSRII CIANO </td><td> Qualsiasi citometro grado di rilevare FITC, PKH26, e 7-AAD (es. 488 nm;. Em 520 nm, 567 nm e 655 nm, rispettivamente) e APC ex. 633-640 nm; em. 660 nm) </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Preparati in laboratorio, </td></tr><tr><td> 7-Aminoactinomycin D, madre alla concentrazione </td><td> NA </td><td> NA </td><td> 1 mg / ml in PBS. Congelare in aliquote e conservare a -20 ° C. </td></tr><tr><td> 7-Aminoactinomycin D, worre magazzino </td><td> NA </td><td> NA </td><td> 100 pg / ml in PBS; preparare tutti i giorni da 1 mg / ml di brodo congelato. </td></tr><tr><td> IgG blocco </td><td> NA </td><td> NA </td><td> HBSS + 10 mg / ml di IgG umano Cohn frazione II e III globuline + 10 mg / ml di BSA. </td></tr></tbody></table>

optimized staining and proliferation modeling methods for cell division monitoring using cell tracking dyes

Coloranti fluorescenti tracciamento cellulari, in combinazione con flusso e citometria immagine, sono potenti strumenti con cui studiare le interazioni ei destini di diversi tipi di cellule in vitro e in vivo. 1-5 Anche se ci sono letteralmente migliaia di pubblicazioni utilizzando questi coloranti, alcuni dei più comunemente riscontrate delle applicazioni di tracciamento cellulari include il monitoraggio di: <ol><li> stelo e cellule progenitrici quiescenza, la proliferazione e / o differenziazione 6-8 </li><li> antigen-driven trasferimento membrana 9 e / o la proliferazione di cellule precursori 3,4,10-18 e </li><li> funzione immunitaria delle cellule di regolamentazione e effettore 1,18-21. </li></ol> Disponibili in commercio coloranti tracciamento cellulari variano ampiamente nella loro composizione chimica e proprietà di fluorescenza, ma la caduta grande maggioranza in una delle due classi base al loro meccanismo di marcatura delle cellule. &quot;Coloranti membrana&quot;, caratterizzato da PKH26, sono coloranti altamente lipofile tcappello partizione stabilmente ma non covalente nelle membrane cellulari 1,2,11. &quot;Coloranti proteine&quot;, caratterizzata da CFSE, sono amino-reattivi coloranti che formano legami covalenti stabili con le proteine ​​cellulari 4,16,18. Ogni classe ha i suoi vantaggi e limitazioni. La chiave per la loro corretta applicazione, in particolare negli studi multicolor in cui vengono utilizzati coloranti diversi per monitorare diversi tipi di cellule, è quindi quello di comprendere le criticità che consentono un uso ottimale di ogni classe 2-4,16,18,24. I protocolli inclusi qui sottolineare tre cause più comuni di risultati mediocri o variabile durante l&#39;uso delle cellule-tracking coloranti. Questi sono: <ol><li> Il mancato raggiungimento luminoso, uniforme, etichettatura riproducibile. Questo è un punto di partenza indispensabile per qualsiasi studio di monitoraggio delle cellule, ma richiede attenzione a diverse variabili quando si utilizza coloranti membrana di quando si usa coloranti proteine ​​o reagenti equilibrio vincolanti come gli anticorpi. </li><li> Ottimali combinazioni di fluorocromind / o mancata includere controlli di compensazione critici. Monitoraggio fluorescenza colorante è tipicamente 10 Febbraio - 10 marzo volte più luminoso di fluorescenza degli anticorpi. È pertanto indispensabile per verificare che la presenza di colorante tracciamento non compromette la possibilità di rilevare altre sonde utilizzate. </li><li> Il mancato ottenimento di una buona misura con software di modellazione di picco. Tale software consente di confronto quantitativo delle risposte proliferative in diverse popolazioni o stimoli in base al numero precursore o altre metriche. Ottenere una buona misura, tuttavia, richiede l&#39;esclusione di morti / cellule morenti che possono distorcere i profili di diluizione colorante e la congruenza delle ipotesi alla base del modello con le caratteristiche del profilo osservato diluizione colorante. </li></ol> Esempi qui riportati illustrano come queste variabili possono influenzare risultati usando membrane e / o coloranti proteiche per monitorare la proliferazione cellulare.

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Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Il successo delle tinture di tracciamento cellulari per monitorare la funzione immunitaria e la proliferazione cellulare coinvolge diversi passaggi critici. Si descrivono metodi per: 1) ottenendo luminoso, uniforme, riproducibile etichetta-re con coloranti membrana; 2) selezionando fluorocromi e condizioni di acquisizione dati, e 3) la scelta di un modello per quantificare la proliferazione cellulare basata sulla diluizione colorante.

Ottimizzato Metodi di modellazione e colorazione proliferazione per il monitoraggio divisione cellulare utilizzando coloranti Tracking Cellulari

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

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Research

JoVE Journal

Biology

35.3K Views.  Roswell Park Cancer Institute. Il successo delle tinture di tracciamento cellulari per monitorare la funzione immunitaria e la proliferazione cellulare coinvolge diversi passaggi critici. Si descrivono metodi per: 1) ottenendo luminoso, uniforme, riproducibile etichetta-re con coloranti membrana; 2) selezionando fluorocromi e condizioni di acquisizione dati, e 3) la scelta di un modello per quantificare la proliferazione cellulare basata sulla diluizione colorante.

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Selective Labelling of Cell-surface Proteins using CyDye DIGE Fluor Minimal Dyes

Surface  proteins are central to the cell's ability to react to its environment and to interact with neighboring cells. They are known to be inducers of almost all intracellular signaling. Moreover, they play an important role in environmental adaptation and drug treatment, and are often involved in disease pathogenesis and pathology (1). Protein-protein interactions are intrinsic to signaling pathways, and to gain more insight in these complex biological processes, sensitive and reliable methods are needed for studying cell surface proteins. Two-dimensional (2-D) electrophoresis is used extensively for detection of biomarkers and other targets in complex protein samples to study differential changes. Cell surface proteins, partly due to their low abundance (1 2% of cellular proteins), are difficult to detect in a 2-D gel without fractionation or some other type of enrichment. They are also often poorly represented in 2-D gels due to their hydrophobic nature and high molecular weight (2). In this study, we present a new protocol for intact cells using CyDye  DIGE Fluor minimal dyes for specific labeling and detection of this important group of proteins. The results showed specific labeling of a large number of cell surface proteins with minimal labeling of intracellular proteins. This protocol is rapid, simple to use, and all three CyDye DIGE Fluor minimal dyes (Cy 2, Cy 3 and Cy 5) can be used to label cell-surface proteins. These features allow for multiplexing using the 2-D Fluorescence Difference Gel Electrophoresis (2-D DIGE) with Ettan  DIGE technology and analysis of protein expression changes using DeCyder  2-D Differential Analysis Software. The level of cell-surface proteins was followed during serum starvation of CHO cells for various lengths of time (see Table 1). Small changes in abundance were detected with high accuracy, and results are supported by defined statistical methods.

A simple and specific method was demonstrated for fluorescent labeling and enhanced detection of cell surface proteins without a fractionation step. Differential abundance in cell surface proteins was analyzed using two-dimensional (2-D) electrophoresis and Ettan&#x2122; DIGE technology.

Etichettatura selettiva di proteine ​​della superficie cellulare utilizzando CyDye DIGE Coloranti Fluor Minimal

Surface  proteins are central to the cell's ability to react to its environment and to interact with neighboring cells. They are known to be inducers of ...

Ricerca

Biologia

Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of genetically-encoded fluorescent proteins has proven a valuable strategy for elucidating dynamic morphogenetic processes as they occur in the intact organism. During the past decade, the development of photoactivatable and photoconvertible fluorescent proteins has opened the possibility to investigate the fate of discrete subpopulations of tagged proteins1. Unlike photoactivatable proteins, photoconvertible fluorescent proteins (PCFPs) are readily tracked and imaged in their native emission state prior to photoconversion, making it easier to identify and select regions by optical inspection. PCFPs, such as Kaede2, KikGR3, Dendra4 and EosFP5, can be shifted from green to red upon exposure to UV or blue light due to a His-Tyr-Gly tripeptide sequence which forms a green chromophore that can be photoconverted to a red one by a light-catalyzed &beta;-elimination and subsequent extension of a &pi;-conjugated system3. PCFPs and their monomeric variants are useful tools for tracking cells6-10 and studying protein dynamics11-14, respectively. During recent years, PCFPs have been expressed in different animal model, such as zebrafish6, chicken7,8 and mouse9,10 for cell fate tracking. Here we report a protocol for cell-specific photoconversion of PCFPs in the living zebrafish embryo and further tracking of photoconverted proteins at later developmental stages. This methodology allows studying, in a tissue-specific manner, cell biological events underlying morphogenesis in the zebrafish animal model.

Here, we present a method for the photoactivated switch of photoconvertible fluorescent proteins (PCFPs) in the living zebrafish embryo and further tracking of photoconverted protein at specific time points during development. This methodology allows monitoring of cell biological events underlying different developmental processes in a live vertebrate organism.

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In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

Here, we present methods for the development of assays to query potentially clinically significant nonsynonymous changes using in vivo complementation in zebrafish. Zebrafish (Danio rerio) are a useful animal system due to their experimental tractability; embryos are transparent to enable facile viewing, undergo rapid development ex vivo, and can be genetically manipulated.1 These aspects have allowed for significant advances in the analysis of embryogenesis, molecular processes, and morphogenetic signaling. Taken together, the advantages of this vertebrate model make zebrafish highly amenable to modeling the developmental defects in pediatric disease, and in some cases, adult-onset disorders. Because the zebrafish genome is highly conserved with that of humans (~70% orthologous), it is possible to recapitulate human disease states in zebrafish. This is accomplished either through the injection of mutant human mRNA to induce dominant negative or gain of function alleles, or utilization of morpholino (MO) antisense oligonucleotides to suppress genes to mimic loss of function variants. Through complementation of MO-induced phenotypes with capped human mRNA, our approach enables the interpretation of the deleterious effect of mutations on human protein sequence based on the ability of mutant mRNA to rescue a measurable, physiologically relevant phenotype. Modeling of the human disease alleles occurs through microinjection of zebrafish embryos with MO and/or human mRNA at the 1-4 cell stage, and phenotyping up to seven days post fertilization (dpf). This general strategy can be extended to a wide range of disease phenotypes, as demonstrated in the following protocol. We present our established models for morphogenetic signaling, craniofacial, cardiac, vascular integrity, renal function, and skeletal muscle disorder phenotypes, as well as others.

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

Here, we present a systematic approach for developing physiologically relevant, sensitive and specific in vivo assays for interpreting variation in human pathology. Transient genetic manipulation via microinjection of WT and mutant human mRNA and morpholino (MO) antisense oligonucleotides harness the tractability of the developing zebrafish embryo to rapidly assay pathogenic mutations, especially, but not exclusively, in the context of human developmental disorders.

In Vivo Modellazione del genoma umano Morbid utilizzando Danio rerio

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Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively in the study of secondary cell wall formation. Secondary cell wall deposition occurs after the primary cell wall is laid down, a process carried out exclusively by specialized cells such as those forming vessel and fiber tissues. Most secondary cell walls are composed of cellulose (40&#8211;50%), hemicellulose (25&#8211;30%), and lignin (20&#8211;30%). Several mutations affecting secondary cell wall biosynthesis have been isolated, and the corresponding mutants may or may not exhibit obvious biochemical composition changes or visual phenotypes since these mutations could be masked by compensatory responses. Staining procedures have historically been used to show differences on a cellular basis. These methods are exclusively visual means of analysis; nevertheless their role in rapid and critical analysis is of great importance. Congo red and calcofluor white are stains used to detect polysaccharides, whereas M&#228;ule and phloroglucinol are commonly used to determine differences in lignin, and toluidine blue O is used to differentially stain polysaccharides and lignin. The seemingly simple techniques of sectioning, staining, and imaging can be a challenge for beginners. Starting with sample preparation using the A. thaliana model, this study details the protocols of a variety of staining methodologies that can be easily implemented for observation of cell and tissue organization in secondary cell walls of plants.

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Plant cell wall composition varies between tissue types and can include lignin, cellulose, hemicelluloses, and pectin. Various staining techniques have been developed to visualize differences at the cell-type level. This paper is a compilation of commonly used cell wall staining techniques.

Colorazione istochimica di<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Cellula secondaria Elementi da parete

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Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound responses and repair in this model have illuminated our understanding of the cytoskeletal and genomic responses to tissue damage. The two most commonly used methods to wound the C. elegans adult skin are pricks with microinjection needles, and local laser irradiation. Needle wounding locally disrupts the cuticle, epidermis, and associated extracellular matrix, and may also damage internal tissues. Laser irradiation results in more localized damage. Wounding triggers a succession of readily assayed responses including elevated epidermal Ca2+ (seconds-minutes), formation and closure of an actin-containing ring at the wound site (1-2 hr), elevated transcription of antimicrobial peptide genes (2-24 hr), and scar formation. Essentially all wild type adult animals survive wounding, whereas mutants defective in wound repair or other responses show decreased survival. Detailed protocols for needle and laser wounding, and assays for quantitation and visualization of wound responses and repair processes (Ca dynamics, actin dynamics, antimicrobial peptide induction, and survival) are presented.

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The adult C. elegans skin is a tractable model for studies of epithelial wound responses, including wound closure, scar formation, and innate immunity.

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Temporal Tracking of Cell Cycle Progression Using Flow Cytometry without the Need for Synchronization

This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell synchronization can be difficult for many cell systems. Standard practice is to block cell cycle progression at a specific stage and then release the accumulated cells producing a wave of cells progressing through the cycle in unison. However, some cell types find this block toxic resulting in abnormal cell cycling, or even mass death. Bromodeoxyuridine (BrdU) uptake can be used to track the cell cycle stage of individual cells. Cells incorporate this synthetic thymidine analog, while synthesizing new DNA during S phase. By providing BrdU for a brief period it is possible to mark a pool of cells that were in S phase while the BrdU was present. These cells can then be tracked through the remainder of the cell cycle and into the next round of replication, permitting the duration of the cell cycle phases to be determined without the need to induce a potentially toxic cell cycle block. It is also possible to determine and correlate the expression of both internal and external proteins during subsequent stages of the cell cycle. These can be used to further refine the assignment of cell cycle stage or assess effects on other cellular functions such as checkpoint activation or cell death.

This protocol describes the use of bromodeoxyuridine (BrdU) uptake to permit the temporal tracking of cells that were in S phase at a specific point in time. Addition of DNA dyes and antibody labeling facilitates detailed analysis of the fate of the S phase cells at later times.

Monitoraggio temporale del ciclo cellulare progressione citometria a flusso, senza la necessità di sincronizzazione

This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell ...

Comparison of Three Different Methods for Determining Cell Proliferation in Breast Cancer Cell Lines

Measuring cell proliferation can be performed by a number of different methods, each with varying levels of sensitivity, reproducibility and compatibility with high-throughput formatting. This protocol describes the use of three different methods for measuring cell proliferation in vitro including conventional hemocytometer counting chamber, a luminescence-based assay that utilizes the change in the metabolic activity of viable cells as a measure of the relative number of cells, and a multi-mode cell imager that measures cell number using a counting algorithm. Each method presents its own advantages and disadvantages for the measurement of cell proliferation, including time, cost and high-throughput compatibility. This protocol demonstrates that each method could accurately measure cell proliferation over time, and was sensitive to detect growth at differing cellular densities. Additionally, measurement of cell proliferation using a cell imager was able to provide further information such as morphology, confluence and allowed for a continual monitoring of cell proliferation over time. In conclusion, each method is capable of measuring cell proliferation, but the chosen method is user-dependent.

This protocol describes the use of three different methods for analyzing cell proliferation in breast cancer cell lines. This includes the use of conventional cell counting, luminescence-based cell viability, and cell counting through the use of a cell imager. Each offers advantages for the reproducible measurement of cell proliferation.

Confronto di tre diversi metodi per la determinazione proliferazione cellulare in Breast Cancer linee cellulari

Measuring cell proliferation can be performed by a number of different methods, each with varying levels of sensitivity, reproducibility and compatibility ...

Xenopus Oocytes: Optimized Methods for Microinjection, Removal of Follicular Cell Layers, and Fast Solution Changes in Electrophysiological Experiments

The Xenopus oocyte as a heterologous expression system for proteins, was first described by Gurdon et al.1 and has been widely used since its discovery (References 2 - 3, and references therein). A characteristic that makes the oocyte attractive for foreign channel expression is the poor abundance of endogenous ion channels4. This expression system has proven useful for the characterization of many proteins, among them ligand-gated ion channels.
The expression of GABAA receptors in Xenopus oocytes and their functional characterization is described here, including the isolation of oocytes, microinjections with cRNA, the removal of follicular cell layers, and fast solution changes in electrophysiological experiments. The procedures were optimized in this laboratory5,6 and deviate from the ones routinely used7-9. Traditionally, denuded oocytes are prepared with a prolonged collagenase treatment of ovary lobes at RT, and these denuded oocytes are microinjected with mRNA. Using the optimized methods, diverse membrane proteins have been expressed and studied with this system, such as recombinant GABAA receptors10-12, human recombinant chloride channels13, Trypanosome potassium channels14, and a myo-inositol transporter15, 16.
The methods detailed here may be applied to the expression of any protein of choice in Xenopus oocytes, and the rapid solution change can be used to study other ligand-gated ion channels.

Xenopus Oocytes: Optimized Methods for Microinjection, Removal of Follicular Cell Layers, and Fast Solution Changes in Electrophysiological Experiments

Optimized procedures for the isolation of single follicles, cytoplasmic RNA microinjections, the removal of surrounding cell layers, and protein expression in Xenopus oocytes are described. In addition, a simple method for fast solution changes in electrophysiological experiments with ligand-gated ion channels is presented.

Xenopus ovociti: Metodi ottimizzate per microiniezione, la rimozione di strati di cellule follicolari e cambiamenti soluzione veloce in esperimenti di elettrofisiologia

The Xenopus oocyte as a heterologous expression system for proteins, was first described by Gurdon et al.1 and has been widely used since its discovery ...

LDL Cholesterol Uptake Assay Using Live Cell Imaging Analysis with Cell Health Monitoring

The regulation of LDL cholesterol uptake through LDLR-mediated endocytosis is an important area of study in various major pathologies including metabolic disorder, cardiovascular disease, and kidney disease. Currently, there is no available method to assess LDL uptake while simultaneously monitoring for health of the cells. The current study presents a protocol, using a live cell imaging analysis system, to acquire serial measurements of LDL influx with concurrent monitoring for cell health. This novel technique is tested in three human cell lines (hepatic, renal tubular epithelial, and coronary artery endothelial cells) over a four-hour time course. Moreover, the sensitivity of this technique is validated with well-known LDL uptake inhibitors, Dynasore and recombinant PCSK9 protein, as well as by an LDL uptake promoter, Simvastatin. Taken together, this method provides a medium-to-high throughput platform for simultaneously screening pharmacological activity as well as monitoring of cell morphology, hence cytotoxicity of compounds regulating LDL influx. The analysis can be used with different imaging systems and analytical software.

This protocol provides an efficient approach to measuring LDL cholesterol uptake with real time influx rates using a live cell imaging system in various cell types. This technique provides a platform to screen the pharmacological activity of compounds affecting LDL influx while monitoring for cell morphology and hence potential cytotoxicity.

Analisi di assorbimento di colesterolo LDL utilizzando Live Cell Imaging analisi con cella di monitoraggio dello stato

The regulation of LDL cholesterol uptake through LDLR-mediated endocytosis is an important area of study in various major pathologies including metabolic ...

Measuring Proliferation of Vascular Smooth Muscle Cells Using Click Chemistry

The ability of a cell to proliferate is integral to the normal function of most cells, and dysregulation of proliferation is at the heart of many disease processes. For these reasons, measuring proliferation is a common tool used to assess cell function. Cell proliferation can be measured simply by counting; however, this is an indirect means of measuring proliferation. One common means of directly detecting cells preparing to divide is by incorporation of labeled nucleoside analogs. These include the radioactive nucleoside analog 3H-thymidine plus non-radioactive nucleoside analogs such as 5-bromo-2&#8217; deoxyuridine (BrdU) and 5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine (EdU). Incorporation of EdU is detected by click chemistry, which has several advantages when compared to BrdU. In this report, we provide a protocol for measuring proliferation by the incorporation of EdU. This protocol includes options for various readouts, along with the advantages and disadvantages of each. We also discuss places where the protocol can be optimized or altered to meet the specific needs of the experiment planned. Finally, we touch on the ways that this basic protocol can be modified for measuring other cell metabolites.

Proliferation is a critical part of cellular function, and a common readout used to assess potential toxicity of new drugs. Measuring proliferation is, therefore, a frequently used assay in cell biology. Here we present a simple, versatile method of measuring proliferation that can be used in adherent and non-adherent cells.

Misurazione della proliferazione delle cellule muscolari lustiche vascolari utilizzando la chimica dei clic

The ability of a cell to proliferate is integral to the normal function of most cells, and dysregulation of proliferation is at the heart of many disease ...