Ringraziamo il professor Brian T. Chait per i suoi preziosi consigli, supporto e accesso alla strumentazione MS, così come la signora Kelly R. Molloy per un eccellente supporto tecnico. Ringraziamo la signora Kelly nudo per il supporto con copy editing. Questo lavoro è stato sostenuto in parte dal NIH sovvenzioni P41GM109824, P41GM103314, e P50GM107632.

The authors declare that they have no competing financial interests.

Questi tre protocolli lavorano in tandem per (1) preparare le cellule per la rottura a stato solido da cryomilling, (2) ottenere la rottura in un mulino a palle planetario, e (3) producono estratti di polvere cellule all&#39;affinità cattura una proteina di interesse in complesso con i suoi interattori fisiologici. Molte diverse tecniche di lisi delle cellule esistono, tra cui approcci meccaniche / fisiche che impiegano schiacciamento impatto, taglio e / o la pressione, così come chimici / approcci enzimatiche, ognuno con diversi pro e contro 49,50. Ogni ricercatore è incoraggiato ad esplorare metodi più adatti per le loro analisi, tenendo presente che qualsiasi approccio scelto per la rottura delle cellule e l&#39;estrazione di proteine rischia di introdurre distorsioni 51,52 che richiedono ottimizzazione empirica (discusso sotto). metodi meccanici possono produrre calore elevato e / o forze di taglio che possono disturbare complessi proteici. Cryomilling evita effetti di riscaldamento in virtù di impiegare LN 2 raffreddamento dei campioni per tDurata lui del processo. Mulini a sfere planetarie si intendono far valere di impatto e di attrito forze, anche sollecitazione di taglio, come componenti di riduzione delle dimensioni delle particelle 53,54. Alle impostazioni riportato non abbiamo osservato la degenerazione di complessi proteici. Infatti abbiamo estratto e recuperato apparentemente intatti ~ 50 MDA complessi dei pori nucleari 11 e enzimaticamente retrotrasposoni attivi che presentano maggiore attività specifica dalle preparazioni che impiegano &#39;dolce&#39; lisi detergente a base di 7. Chimico / metodi enzimatici di lisi cellulare soffrono della limitazione che il contenuto della cella vengono rilasciati in una vitro ambiente in grado di supportare la rottura delle membrane cellulari e macromolecole strutturali ma può non essere adatto per mantenimento dell&#39;integrità del complesso proteico (es ) di interesse. Frequentemente, né i componenti dei complessi formati con la proteina di interesse, né le condizioni necessarie per stabilizzare i complessi di destinazione sonoconosciuto in anticipo. Un notevole vantaggio di fresatura a stato solido è che la rottura e l&#39;estrazione sono disaccoppiati, permettendo materiale di partenza per essere preparati senza liquido aggiunto, conservati (a -80 ° C o al di sotto), accumulato, e convenientemente recuperati per la sperimentazione on-demand; ad esempio, per esplorare ottimizzata in condizioni in vitro per la cattura affinità. Interazioni proteina sono più stabili ad alta concentrazione 55,56, pertanto minimizzando il volume di solvente può essere vantaggioso per preservare interazioni fisiologiche. D&#39;altra parte, ci sono considerazioni pratiche - complessi proteici hanno bisogno di essere diviso su cellule e in una fase acquosa non viscoso, privo di aggregati insolubili, per mescolarsi complessi di destinazione con il mezzo affinità. Inoltre, alcuni standardizzazione e controllo sull&#39;ambiente in vitro (pH, concentrazione salina, ecc) è necessario per sistemazione e riproducibilità. Troviamo che estrae produced nella gamma diluizione di 1: 4-1: 9 (w: v) soddisfare le preoccupazioni teoriche e pratiche, ottenendo risultati di qualità. Inoltre, la percentuale ottimale di estratto cellulare all&#39;affinità esigenze medie da determinare. Questo viene fatto empiricamente per titolazione di estratti con quantità variabili di medie affinità e può avere effetti rilevabili sul rapporto segnale-rumore dell&#39;esperimento, ulteriormente di seguito. Un&#39;eccellente deplezione della proteina bersaglio è tipicamente ≥70% della frazione solubile della proteina bersaglio, ma&gt; 90% è desiderabile e può essere realizzabile con accurata parametrizzazione condizioni di estrazione. Molte di queste considerazioni pratiche sono coperti di riferimento 1. perline paramagnetici sono manipolati con magneti al neodimio in un supporto provetta specializzato, anche se le alternative fatte in casa sono vitali. Quando posizionato all&#39;interno del supporto, perline raccolgono al lato del tubo sotto l&#39;influenza del campo magnetico. Le soluzioni possono poi essere rimossi senza disturbing le perline. Una limitazione del protocollo cryomilling presentato, sviluppato con il mulino a palle planetario qui utilizzato (Vedi Tabella dei Materiali), è che una quantità minima di materiale è necessario per efficacemente mulino e recuperare polvere cella utilizzando questo dispositivo (&gt; 1 g). Tali quantità sono facilmente ottenuti con molti microbi, linee cellulari e organismi modello, e possono spesso essere realizzato con tessuti asportati da animali da laboratorio. Tuttavia, alcune linee cellulari possono essere molto difficili da coltivare nei tessuti abbondanza e animali possono essere scarse. Piccole quantità di materiale può essere paragonabile fresati con altri dispositivi che utilizzano contenitori più piccoli, anche se potenzialmente a sacrificio della finezza della polvere raggiunto. Inoltre, il costo dei dispositivi di fresatura meccanici può essere proibitivo per alcuni laboratori. Cryomilling può essere realizzato utilizzando un numero di configurazioni alternative 14-19, tra cui, più accessibile a mano con un parassitaLe e malta, anche se l&#39;efficienza rottura scende notevolmente. protocolli di cattura Affinità tipicamente obiettivo per una elevata efficienza di lisi cellulare per facilitare l&#39;estrazione massima proteina in soluzione e quindi massimo potenziale per la cattura dei complessi proteina bersaglio. D&#39;altra parte, è stato dimostrato per il lievito in vitro splicing estratti che lisi massimo non può equiparare con massima in vitro attività biochimica 57,58. Non abbiamo osservato questi problemi nei sistemi che abbiamo testato finora, e quindi non volutamente limitare la nostra rottura delle cellule quando cryomilling. Tuttavia, tale possibilità deve essere tenuto presente quando l&#39;ottimizzazione per saggi enzimatici in vitro. Sebbene cryomilling è un metodo molto efficace per rompere le cellule, un numero limitato di sonicazione spesso avvantaggia i omogenee di produzione estratti di cellule intere da tessuti di mammiferi perché aggregati omogenei possono talvolta essere osservate mediante ispezione visiva: tipicamentein condizioni di estrazione con bassa a moderata sale (100-300 mM) e un detergente non ionico (0,1-1% v / v) le concentrazioni. Poiché abbiamo osservato che la presenza di questi aggregati può ridurre il rendimento e / o la qualità della cattura affinità successiva, abbiamo quotidianamente realizziamo sonicazione per disperderli (anche quando non sono osservati ad occhio nudo). Gli aggregati sono coerenti con frammenti di membrana agglomerati, paragonabili a quelli precedentemente riportati in estratti di cellule di lievito fresate 58. Sonicazione è utilizzato anche in alcuni protocolli di taglio del DNA e liberare frammenti cromatina in soluzione, tuttavia il grado di sonicazione applicata in questo protocollo non è così apprezzabile frammento di DNA. La disponibilità limitata (o il costo elevato) di un ottimo legante affinità o di anticorpi contro la proteina di interesse particolare possono essere un altro ostacolo. Una vasta gamma di reagenti per affinità disponibili in commercio può essere sfruttata quando il modello organismo è suscettibile di codifica genomica o TRansfection con vettori di espressione ectopica, che permettono l&#39;espressione di proteine ​​di interesse come fusioni affinità-tag. Tuttavia, la produzione di anticorpi personalizzati è diventato sempre fattibile e sia gli anticorpi policlonali e monoclonali possono prestazioni eccellenti in applicazioni di acquisizione di affinità. Queste molte considerazioni sono coperti anche in maggior dettaglio con riferimento 1. Esempi di come il metodo di lisi cellulare e la scelta del mezzo di affinità possono influenzare risultati sono illustrati in Figura 1. Esempi di effetti esercitati da diversi estraenti può essere visto in riferimenti 1,11,24. Poiché questi ed altri parametri sperimentali influenzano la qualità della cattura affinità, il che rende difficile discriminare PQ, depositari di &quot;proteomi perla&quot; e approcci computazionali per eliminare i contaminanti non specifici sono stati sviluppati per aiutare a identificare PQ 40-43. Tuttavia, tali approcci solo substitute per la preparazione del campione ottimale in misura limitata 59. Osservando le migliori pratiche ed empiricamente ottimizzare l&#39;esperimento di cattura affinità fornirà i campioni più di alta qualità per le analisi a valle, più discussi di seguito. Una pratica facilmente implementato in grado di migliorare la purezza del campione è eluizione nativo. eluizione nativo è più frequentemente usato per ottenere l&#39;isolato complesso proteico affinità, intatto, per un ulteriore sperimentazione; ma migliora spesso la purezza del campione, può essere utilizzato anche solo per questo motivo. Tuttavia, come mostrato nella Figura 1, pannello II, la capacità di eluizione nativa per migliorare la purezza del campione può dipendere da una titolazione accurata della quantità di mezzo affinità per l&#39;abbondanza della proteina bersaglio in estratto cellulare - quando il mezzo è in eccesso , paratopes non occupati possono consentire l&#39;accumulo fuori bersaglio delle proteine ​​FP osservabili nelle frazioni eluite in modo nativo. Utilizzando i reagenti e le procedure descritte qui, hcome la nostra esperienza che il singolo più grande contributore di PQ ai nostri esperimenti è la proteina tag stesso, una volta rimosso dal contesto della cellula vivente. (Fig. 1, parte e Fig. S1). In tali casi, parentali controlli di linea di cellule che producono proteoma irrilevanti in assenza dell&#39;antigene sono di alcun valore pratico; Allo stesso modo per tag-solo o spike nei controlli che sono privi di qualsiasi cosa, ma l&#39;antigene bersaglio. Pertanto, ogni volta che pratico implementiamo I-DIRT 7,38, che misura direttamente l&#39;accumulo di interazioni proteina post-lisi utilizzando MS quantitative. Come detto al punto 3.2.7 del protocollo, le procedure per l&#39;eluizione nativo varieranno con i dettagli del sistema di affinità utilizzato. eluizione nativa è più comunemente ottenuta spostamento competitivo del complesso o proteolitico proteina marcata scissione del tag, rilasciando il complesso dal mezzo affinità. Diversi sistemi di affinità composto da piccoli tag epitopo esistono, for che l&#39;epitopo stessa è disponibile come peptide utili per eluizione competitivo di complessi proteici tag 60. Allo stesso modo, diverse proteasi sono a disposizione per fendere specificamente siti affini strategicamente collocati in affinità taggati proteine di fusione 61. A seconda delle specifiche dei sistemi di affinità scelti, il regime di eluizione appropriata può essere adottata. Generalmente, la qualità dei risultati ottenuti sarà significativamente influenzato dalla qualità della preparazione del campione. È importante lavorare con cura e precisione in ogni fase di questi protocolli, e il più rapidamente possibile, pur mantenendo cura e precisione. Si consiglia di monitorare la compartimentazione della proteina di interesse attraverso ogni passo per capire l&#39;efficienza di ogni manipolazione. Ad esempio: come abbondante è la proteina di interesse nella cellula o tessuto in questione? Forse la proteina in fase di studio (e dei suoi complessi) sarà una sfida di caratterizzare in massaspettrometria a causa della bassa abbondanza. Se i complessi purificati sono rilevabili dalla colorazione della proteina generale (circa nanogrammi gamma), la spettrometria di massa è probabilità di successo. Se la proteina catturato di interesse può essere rilevata solo da sensibili migliorato western blotting chemiluminescenza (range di circa picogrammi), la spettrometria di massa è meno probabilità di essere efficace. Anche se la proteina di interesse è abbondante nella cellula, come abbondante è l&#39;estratto di cellule prodotte? Fa la partizione di proteine ​​alla soluzione o è nel pellet? In quest&#39;ultimo caso, una nuova soluzione di estrazione può essere concepito che possono migliorare il recupero. Una volta che l&#39;estratto cellulare è combinato con il mezzo di affinità, come effettivamente viene catturata proteina? Ha la proteina rimane legato attraverso lavaggi successivi? Che dire di altre proteine ​​copurifying? Salvando un&#39;aliquota di ciascun campione nelle appropriate fasi del protocollo queste domande possono essere facilmente risposta, tipicamente western blotting contro la proteina di interesseo colorazione delle proteine ​​generale, ma altri saggi possono essere idonei. Ottimizzare ogni passo sarà migliorare la resa e la purezza di complessi catturati, anche se ci può essere un trade-off da effettuare nel massimizzare un attributo o l&#39;altro. Una tipica applicazione di cattura affinità per molti ricercatori è identificare candidato interattori vivo per un piccolo numero di proteine di interesse; questi candidati sono comunemente sottoposti a convalida da approcci ortogonali in vivo per dimostrare il significato biologico interattori fisici. Cattura Affinity è impiegato anche da studi high-throughput per generare liste di copurifying proteine osservate su una base (quasi) proteoma-larga, facilitando inferenze computazionali relativi putativo in complessi in vivo. Numerosi esempi di tali studi possono essere trovati in letteratura. Questo approccio rinuncia ottimizzazione delle condizioni di cattura per ogni destinazione a favore dell&#39;uomo esplorareobiettivi y; come tali, i complessi dedurre stessi sono raramente recuperati completamente intatto ed estremamente puro in ogni campione. Piuttosto, le sovrapposizioni parziali in composizioni osservate tra numerosi campioni per affinità catturato distinti sono usati come base delle inferenze 42. Entrambi gli approcci contribuiscono dati importanti per la nostra comprensione del interattoma. Tuttavia, uno dei principali vantaggi di cattura affinità è che spesso offrono la possibilità di ottenere i complessi intatto e altamente purificato, a condizione che gli sforzi sono fatti per ottimizzare la procedura. Noi crediamo che il futuro dell&#39;approccio consiste nell&#39;aumentare la facilità ed efficienza di ottimizzare la cattura di complessi proteici endogeni 11, per una valutazione più accurata della gamma di interattori fisiologici e l&#39;uso più frequente nelle ulteriormente biochimica valle, enzymological, e gli studi strutturali, ad esempio, fa riferimento a 7,9,23.

A correction was made to: Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells. The References section has been updated from:
<ol start="29">
	<li>Cristea, I. M., &#38; Chait, B. T. Conjugation of magnetic beads for immunopurification of protein complexes. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (5) (2011).</li>
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	<li>Kalkum, M. Using the Retsch MM301 Ball Mill for Cryogenic Disruption of Yeast Cells. 2 City of Hope, (2003).</li>
	<li>Staley, J. Making Whole Cell Extract of Saccharomyces cerevisiae cells using the Retsch MM301 Ball Mill. Retsch GmbH: (2005).</li>
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	<li>Waugh, D. S. An overview of enzymatic reagents for the removal of affinity tags. 80 (2), 283&#8211;293 (2011).</li>
	<li>Williams, R. J., &#38; Lyman, C. M. A neutral buffered standard for hydrogen ion work and accurate titrations which can be prepared in one minute. J Am Chem Soc. 54 (5), 1911&#8211;1912 (1932).</li>
	<li>Johnson, M. Detergents: Triton X-100, Tween-20, and More. labome.com. 3 (163) (2013).</li>
	<li>Deppert, W. R., &#38; Luka&#265;in, R. Buffers and Additives. Journal of Chromatography Library. 61 (C), 839&#8211;862 (1999).</li>
	<li>Ugwu, S. O., &#38; Apte, S. P. The Effect of Buffers on Protein Conformational Stability. Pharmaceutical Technology. 28 (3), 86&#8211;108 (2004).</li>
	<li>Linke, D. Detergents: an overview. Methods in Enzymology. 463 (34), 603&#8211;617 (2009).</li>
	<li>Zhang, J. Protein-Protein Interactions in Salt Solutions. Protein-Protein Interactions Computational and Experimental Tools. (18), 359&#8211;376 (2012).</li>
</ol>
to:
<ol start="29">
	<li>Ball Mills - Guidelines for sample amount and ball charge. 1&#8211;3at &#60;http://www.retsch.com/products/milling/ball-mills/planetary-ball-mill-pm-100/information-downloads/&#62; Retsch GmbH (2014).</li>
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	<li>Linke, D. Detergents: an overview. Methods in Enzymology. 463 (34), 603&#8211;617 (2009).</li>
	<li>Zhang, J. Protein-Protein Interactions in Salt Solutions. Protein-Protein Interactions Computational and Experimental Tools. (18), 359&#8211;376 (2012).</li>
	<li>Goldberg, S. Mechanical/physical methods of cell disruption and tissue homogenization. Methods in Molecular Biology. 424 (Chapter 1), 3&#8211;22 (2008).</li>
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	<li>Zhao, Q.-Q., Yamada, S., &#38; Jimbo, G. The Mechanism and Grinding Limit of Planetary Ball Milling. KONA. 7, 29&#8211;36 (1989).</li>
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	<li>Waugh, D. S. An overview of enzymatic reagents for the removal of affinity tags. 80 (2), 283&#8211;293 (2011).</li>
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Erratum: Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Una tipica applicazione delle procedure presentate è di stabilizzare ed ottenere un alto rendimento e la purezza di complessi proteici endogeni di interesse per la caratterizzazione interactomic 1. Resta inteso che le reti dinamiche di entrambi i complessi macromolecolari stabilmente e transitoriamente associati, principalmente costituiti da proteine, orchestrano processi cellulari 2,3. Mentre ci sono molti approcci sperimentali per identificare interazioni proteina-proteina, la cattura affinità è tra i metodi più utilizzati per isolare e sezionare complessi proteici fisiologici 4-6. Inoltre, questa tecnica ha il vantaggio di produrre complessi macromolecolari come entità fisiche, non solo come punti di dati in una lettura-out; vantaggiosamente, i complessi ottenuti possono quindi essere utilizzati in una serie di ulteriori biochimica valle, enzimatica e analisi strutturali 7-9. I protocolli presentati sono stati sviluppati in risposta alla necessità di mappare Proteireti di interazione n-proteine ​​e complessi macromolecolari caratterizzano nel loro ruolo di molecole effettrici della biologia cellulare. Essi sono dettagliate rispetto alla loro applicazione alle cellule di mammifero in coltura tissutale, ma sono ugualmente applicabili ad una vasta gamma di campioni biologici di adeguata ritocchi specifici del sistema. La storia della cattura affinità risale ai primi anni del XX secolo, con i primi esperimenti di immunoaffinità cromatografia - simile a quello che viene comunemente definito oggi come immunoprecipitazione (IP) - che figurano nella letteratura dei primi anni 1950. Uso tradizionale della tecnica ulteriormente sviluppato attraverso la fine di questo secolo ad oggi 10-13. Diverse cellule e gli studi di biologia molecolare hanno utilizzato la rottura meccanica delle cellule mediante fresatura a temperature criogeniche per almeno gli ultimi quarant&#39;anni 14-19; e separazioni molecolari che utilizzano (super) perline paramagnetici hanno become sempre più comune nel corso degli ultimi due decenni 20. La combinazione di queste diverse tecnologie è servito per migliorare sinergicamente i risultati che possono essere ottenuti in esperimenti di proteine di cattura affinità complesso 1, come evidenziato da un ampio corpus di lavoro prodotto da noi stessi e la comunità di ricerca più ampia 7,9,11,18,19,21 -23. Risultati di supporto sono presentati in Figura 1. Una raccolta di avvertimenti e considerazioni applicabili all&#39;esecuzione efficaci esperimenti di cattura affinità può essere trovato in riferimento 1. Tipicamente questo approccio è più appropriato per: (I) catalogare i interattori di una proteina di interesse, cioè, usare la spettrometria di massa proteica (MS) per identificare le proteine finora sconosciute copurifying (analisi esplorativa); (II) Test per la presenza di un partner particolare interagente, cioè utilizzare MS o western blot per rilevare una particolare proteina o insieme limitato di proteine sospetta ininteragire con la proteina di interesse (test di ipotesi); o (III) preparare complessi proteici endogeno assemblati contenenti la proteina di interesse per un ulteriore studio di tecniche aggiuntive (iter preparativo). Prima di intraprendere un regime sperimentale di cattura affinità è assolutamente essenziale per avere un reagente affinità di alta qualità che si lega alla proteina bersaglio, in genere un anticorpo IP-competente contro la proteina bersaglio nativo di interesse o contro una etichetta assegnata ad una proteina di fusione. E &#39;anche fondamentale disporre di metodi appropriati di lettura sperimentale in atto: la colorazione delle proteine ​​generale (come Coomassie blu, Sypro Ruby, o argento, a seguito di SDS-PAGE), western blotting, e proteine ​​MS sono tutti comunemente usati in combinazione con la cattura affinità 1. I protocolli presentati utilizzano biglie magnetiche coniugate anticorpi come mezzo affinità. Mentre la funzione del mezzo di affinità può inizialmente essere convalidato in prove che utilizzano alcuni parametri sperimentali, adottenere i migliori risultati di ogni esperimento dovrebbe essere empiricamente ottimizzato 1,11,24. I protocolli sono separati in tre fasi distinte: (1) preparazione di materiale cellulare congelati; (2) la rottura delle cellule mediante fresatura stato solido a temperatura criogenica; e (3) estrazione di proteine ​​e la cattura affinità con perline paramagnetici anticorpi accoppiati.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1304">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Growth media &#38; cell culturing implements</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td style="width:403px;">For producing frozen cells (I)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">500 cm^2 culture dishes</td>
			<td style="width:172px;">Corning</td>
			<td>431110</td>
			<td>For producing frozen cells (I)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Large beaker (1-2L)</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
			<td>For producing frozen cells (I)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rectangular ice pan&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>13-900-747</td>
			<td>For producing frozen cells (I), &#38; cryomilling (II)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For producing frozen cells (I)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Large cell scrapers</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>08-100-242</td>
			<td>For producing frozen cells (I)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Liquid nitrogen&#160;</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For producing frozen cells (I), cryomilling (II), &#38; affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">50 ml conical tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352098</td>
			<td>For producing frozen cells (I), &#38; cryomilling (II)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">20 ml Luer lock syringe</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For producing frozen cells (I)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Leur lock syringe caps</td>
			<td>www.dymax.com</td>
			<td>T11182</td>
			<td>For producing frozen cells (I)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Refrigerated centrifuge</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For producing frozen cells (I)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50 ml tube rack, 4 position</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For producing frozen cells (I), cryomilling (II), &#38; affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Styrofoam box</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For producing frozen cells (I), cryomilling (II), &#38; affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Planetary ball mill, PM 100&#160;</td>
			<td>Retsch</td>
			<td>20.540.0001&#160;</td>
			<td>For cryomilling (II)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stainless steel milling jar, 50 ml&#160;</td>
			<td>Retsch</td>
			<td>01.462.0149</td>
			<td>For cryomilling (II)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stainless steel milling balls, 20 mm &#216;&#160;</td>
			<td>Retsch</td>
			<td>05.368.0062</td>
			<td>For cryomilling (II)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lid gasket: PFA encapsulated spring energized seal, 2.62 mm 44.63 mm&#160;&#160;</td>
			<td style="width:172px;">www.marcorubber.com</td>
			<td>T1044-2.62x44.63</td>
			<td>For cryomilling (II)</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">mini-LN2 decanter</td>
			<td style="width:172px;">homemade</td>
			<td style="width:164px;">see Ref 19</td>
			<td>For cryomilling (II)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">250 ml PTFE jar insulator (optional)</td>
			<td style="width:172px;">Retsch</td>
			<td style="width:164px;">custom order</td>
			<td>For cryomilling (II)</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">PTFE puck insulator (optional)</td>
			<td style="width:172px;">homemade</td>
			<td style="width:164px;">The Rockefeller University</td>
			<td>For cryomilling (II); can be produced by The Rockefeller University High Energy Physics Instrument Shop, or design blueprints provided, upon request.</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">5 bar/500 KPA pressure relief valve (optional)</td>
			<td style="width:172px;">http://www.leeimh.com/</td>
			<td style="width:164px;">558 series check valve</td>
			<td>For cryomilling (II)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">1.5 - 2 ml microfuge tubes</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Extractant</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:567px;">cOmplete EDTA free protease inhibitor cocktail tablets</td>
			<td style="width:172px;">Roche Applied Science</td>
			<td style="width:164px;">11873580001</td>
			<td style="width:403px;">For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Vortex mixer</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Ice bucket</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Microtip sonicator, Q700</td>
			<td style="width:172px;">Qsonica</td>
			<td style="width:164px;">Q700</td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">low intensity 1/16&#8221; microtip probe</td>
			<td style="width:172px;">Qsonica</td>
			<td style="width:164px;">4717</td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Bench-top refrigerated microcentrifuge</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Dynabeads M-270 Epoxy</td>
			<td style="width:172px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:164px;">14302D</td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Antibody or affinity ligand coupled to Dynabeads</td>
			<td style="width:172px;">homemade</td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III); see reference 19</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Sample rotator&#160;</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Neodymium magnet</td>
			<td style="width:172px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:164px;">123-21D&#160;</td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">SDS-PAGE sample buffer (no reducing agent)</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">DTT</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">SDS-PAGE system</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">SDS-polyacrylamide gel</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Protein Stain</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protein complex affinity capture from cryomilled mammalian cells

cattura Affinity è una tecnica efficace per isolare i complessi proteici endogeni per ulteriori studi. Quando utilizzato in combinazione con un anticorpo, questa tecnica viene spesso indicato come immunoprecipitazione. cattura affinità può essere applicato in un banco scala e in un contesto ad alta produttività. Quando accoppiata alla spettrometria di massa proteica, cattura affinità ha dimostrato di essere un cavallo di lavoro di analisi interattoma. Anche se ci sono potenzialmente molti modi per eseguire le numerose fasi, i seguenti protocolli di implementare i nostri metodi favorite. Due caratteristiche sono distintive: l&#39;uso di polvere cellule cryomilled per produrre estratti cellulari e perline paramagnetici anticorpi accoppiati come mezzo affinità. In molti casi, abbiamo ottenuto risultati superiori a quelli ottenuti con altre pratiche cattura affinità convenzionali. Cryomilling evita numerosi problemi associati con altre forme di rottura delle cellule. Esso fornisce efficiente rottura del materiale, evitando denatproblemi confi- connessi con il riscaldamento o la formazione di schiuma. Si mantiene il nativo proteina concentrazione fino al punto di estrazione, mitigare la dissociazione macromolecolare. Si riduce il tempo di proteine ​​estratte passano in soluzione, limitando le attività enzimatiche deleteri, e può ridurre l&#39;adsorbimento non specifico di proteine ​​dal mezzo affinità. Micron scala supporti magnetici affinità sono diventati più comuni negli ultimi anni, sempre più sostituendo la agarose- tradizionale e multimediale Sepharose-based. I vantaggi principali di supporti magnetici includono tipicamente inferiore adsorbimento di proteine ​​non specifico; nessun limite di dimensione di esclusione a causa di legame complesso proteico avviene sulla superficie tallone piuttosto che all&#39;interno i pori; e facilità di manipolazione e movimentazione con magneti.

Figura 1, pannello I dimostra che cryomilling e sfere magnetiche possono lavorare insieme per migliorare la qualità del campione. Pannelli IA-C dimostrano che il materiale comprendente il mezzo insolubile utilizzato per la cattura affinità può influenzare proteoma recuperato 19. La proteina di interesse, purificato fosfatasi alcalina batterica FLAG-tag (BAP), è stata aggiunta in estratti di cellule umane. BAP non si prevede che interagisca specificamente e copurify proteine ​​umane. La firma di proteine ​​copurifying, giudicati da SDS-PAGE e colorazione Coomassie, varia a seconda del mezzo utilizzato. sfere magnetiche Micron scala mostrato il profilo pulito, indicando un livello relativamente basso di non-specifica adsorbimento di proteine. Pannelli ID e IE illustrano che il metodo di lisi cellulare può anche influire sulla proteoma recuperato. Nell&#39;esempio fornito, un complesso proteina endogena (NEXT complesso 37), è stato sottoposto a captu affinitàre da cellule cyromilled o sonicato estratti 19. Sono stati osservati Meno contaminanti di massa ad alta quando l&#39;estratto di cellule è stato prodotto da polvere di cellule cryomilled. Una sfida quando si utilizza cattura affinità per studiare complessi proteici endogeni è che può essere difficile discriminare bona fide interattori fisiologiche della proteina di interesse da falsi positivi (PQ). PQ può derivare da molte fonti, tra adsorbimento non specifico per tubi e navi, il mezzo affinità, l&#39;anticorpo o di affinità ligando, e / o per la proteina di interesse in sé. Di conseguenza, sforzo significativo deve essere dedicata ad ottimizzare il processo di cattura. La rilevazione dei PQ rimane una sfida centrale per il quale sono stati sviluppati un gran numero di strumenti diversi, tra cui sperimentale 38-40 e computazionale si avvicina 41-43, ciascuno con diversi pro e contro. Nei nostri esperimenti abbiamo già notato un modello di Fproteine ​​P legame, ottenuto dopo incubazione di α-FLAG supporto magnetico con estratti di cellule di controllo, che è stato distinto dal modello ottenuto in presenza di proteine ​​3xFLAG-tag. Inoltre, questi PQ potrebbe essere rilasciato dal mezzo da incubazione con 3xFLAG peptide 7. Questa osservazione è coerente con opportunistica legame PQ al paratope α-FLAG in assenza dell&#39;epitopo cognate. Comprendere la natura di questo fondo FP è importante in quanto molti studi utilizzano un senza tag &#39;linea cellulare dei genitori&#39; come controllo finto per la cattura affinità; questi controlli possono quindi essere inadeguato per determinare la specificità di interazione con la proteina codificata. Per determinare lo sfondo legame forniti dai nostri media affinità quando paratopes anticorpi sono occupati o no, abbiamo condotto esperimenti di cattura affinità finte utilizzando α-FLAG supporto magnetico e estratti di cellule HEK 293T (nessuna proteina tag espresso) in presenza o in assenza di un 3xFLAGpeptide spike-in. I risultati sono mostrati in Figura 1, pannello II. Brevemente, α-FLAG mezzo magnetico è stata incubata in estratti cellulari (di ≳10 mg / proteine ​​totali ml) contenente 500 mM NaCl e 1% v / v Triton X-100 in 20 mM HEPES-Na pH 7,4 per 30 min. Il mezzo è stato poi incubato con 1 mg / ml 3xFLAG peptide spostare competitivamente eventuali proteine ​​legate alla paratope α-FLAG nativo o con tampone campione SDS-PAGE per ottenere una eluizione denaturazione. Inoltre, lo stesso esperimento è stata effettuata quando le estratti cellulari sono stati addizionati con 1 mg / ml e 10 ug / ml di 3xFLAG peptide. Tutte le frazioni eluite sono stati sottoposti a SDS-PAGE e colorazione argento. Abbiamo osservato che in assenza del suo epitopo cognate, medio α-FLAG non acquisire un livello rilevabile di proteine di fondo che possono essere eluite con 3xFLAG peptide - nell&#39;esempio fornito da Figura 1-II, una specie dominante è stata osservata tra il 37 e 50 kDa. Il pattern eluita contampone campione SDS-PAGE era paragonabile, con specie importanti supplementari. Tuttavia, in presenza di 1 mg / ml 3xFLAG peptide, FP vincolante al mezzo affinità è stata eliminata al di sotto del livello di rilevamento e non è stato osservato sia nei frazioni di eluizione native o denaturanti. Questo risultato suggerisce che non occupate paratopes anticorpo può essere promiscua in assenza del loro epitopo cognate e contribuiscono significativamente proteoma ottenuto durante la cattura affinità anche per gli anticorpi che si legano loro epitopo ad alta affinità, come è il caso per la 3xFLAG / α-FLAG M2 accoppiamento. Inoltre suggestd che condizioni molto severe utilizzando sale alto, spesso scelta per mitigare legame non specifico, possono essere inefficaci in assenza di interazione antigene / anticorpo. Per il follow-up abbiamo effettuato un simile esperimento compresa l&#39;analisi mediante SDS-PAGE e quantitativa MS (Fig. S1). Dei 347 proteine ​​quantificati, abbiamo osservato che ogni proteina salva per un (falso discotecamolto rate = 1%; Tabella S1) è stato associato con la proteina esca 3xFLAG-etichettato rispetto a un peptide 3xFLAG spillo campione di controllo. Questi risultati indicano che nei nostri esperimenti la stragrande maggioranza delle proteine ​​osservate sono suscettibili di co-purificare con la proteina tag o sono fuori bersaglio sottoprodotti di non occupati paratopes α-FLAG. Nella nostra esperienza, i risultati alti segnale-rumore di cattura affinità sono esemplificate in SDS-PAGE e colorazione delle proteine ​​da un modello discreto di bande taglienti, abbondanti e circa stechiometrico, nonché una scarsità di colorazione di fondo da altri gruppi più deboli; numerosi esempio di questo principio può essere visto in riferimento 11. Il motivo per l&#39;utilizzo di un isolante in PTFE (che è consigliato) quando cryomilling è quello di ridurre il tasso di riscaldamento del vaso durante la fresatura, ridurre l&#39;onere di ripetute LN 2 raffreddamento durante il processo di fresatura, e ridurre il grado di ghiaccioformazione nel vaso. Questo facilita prestazioni di fresatura coerenti e facilita la manipolazione della polvere cella. Isolatori Esempi possono essere trovati in riferimento 27 (puck) e descritte nella Figura 2, sotto (manicotto-e-puck). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54518/54518fig1.jpg" /> Figura 1: Selezionare Rappresentante dei risultati. (I) Questo pannello è stato modificato dal riferimento 19. Coomassie blu macchiato gel di SDS-poliacrilammide. (SINISTRA) Micron scala magnetica perline mostrano inferiore off-obiettivo vincolante di supporti agarosio-based. (A) sfere magnetiche; (B) agarosio tradizionale; (C) di ferro impregnato (magnetica) agarosio; ogni accoppiato ad anticorpi anti-FLAG M2 e utilizzati per catturare fosfatasi alcalina batterica FLAG-tag (BAP; etichettati) spillo in estratti di prodotti a partire da cryomilled cellule HEK-293. purificazioni agarosio-basedhanno mostrato livelli elevati di adsorbimento non specifico (bande senza etichetta). (a destra) Estratti derivati ​​da cellule HeLa cryomilled mostrano minore adsorbimento fuori bersaglio su sfere magnetiche anticorpi accoppiato rispetto a quelle prodotte mediante ultrasuoni quando viene utilizzato per purificare un complesso proteina endogena. LAP-tagged 44 RBM7 stata affinità catturato utilizzando sfere magnetiche accoppiate ad anticorpi anti-GFP policlonali per purificare NEXT complesso 19,37 (D) estratto prodotto da polvere cryomilled; (E) estratti prodotte mediante ultrasuoni delle cellule intatte. La barra nera verticale evidenzia una regione del gel in cui sono stati osservati alti interattori di massa non specifici ad arricchirsi nel campione preparato mediante ultrasuoni. Le frecce nere indicano i interattori specifici previsti (etichettati). Bande osservati ~ 50 kDa in corsia D ed E sono attribuibili a lama IgG catene pesanti. (II) Argento macchiato gel di SDS-poliacrilammide. (Std.) Una cattura affinità finto effettuata su HEK-293cellule T estratti in modo standard. Dopo la cattura, eluizione del materiale legato è stato ottenuto tramite (N) non denaturazione-eluizione con 1 mg / ml 3xFLAG peptide o (D) denaturazione eluizione in tampone campione SDS-PAGE; (PB 1) Std. ma il peptide 3xFLAG è stato incluso nella soluzione di estrazione a 1 mg / ml per bloccare i paratopes α-bandiera sul mezzo di affinità; (PB 10) come PB 1 ma in presenza di 10 ug / ml 3xFLAG peptide. bande IgG-correlate e 3xFLAG peptide sono etichettati. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54518/54518fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54518/54518fig2.jpg" /> Figura 2: maniche-e-puck PTFE isolante. Viene mostrato un vaso PTFE 250 ml (1). A stainless vaso fresatura di acciaio 50 ml (2) si inserisce all&#39;interno del vaso PTFE (3) e forniscepossibilità di lasciare il barattolo fresatura installato all&#39;interno del mulino tra i cicli. Un puck PTFE isolante superiore (2) viene utilizzato tra il gruppo pinze e il coperchio vaso. Per raffreddare il vaso e isolante quadro installato (3), LN 2 viene aggiunto direttamente nel corpo dell&#39;isolatore, circonda il vaso. Il successivo ciclo di fresatura può quindi essere avviata. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54518/54518fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Reagente </td><td> Concentrazione consigliata </td><td> Note </td></tr><tr><td> Cloruro di sodio </td><td> 0,1-0,5 M </td><td> Concentrazioni elevate (&gt; 300 mm) tendono a migliorare l&#39;estrazione di proteine ​​totali e mantenere sfondo bassa, ma può spogliare un po &#39;, tra l&#39;altro stabileattori. Concentrazioni inferiori a 150 mm, non sono in genere efficaci nel ridurre sfondo non specifico. </td></tr><tr><td> acetato di ammonio </td><td> 0,2-2 M </td><td> Un sale, composto di due buffer, che produce una soluzione pH neutro 57. Concentrazioni più elevate stabilizzare alcuni complessi proteici. soluzioni acide possono derivare da vecchie scorte cristallini non correttamente conservati in seguito a perdita di ammoniaca. N tampone pH aggiuntivo o sali sono necessari estraenti contenenti acetato di ammonio. Può essere combinato con NaCl per modulare i risultati ottenuti. </td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> 0,1% v / v </td><td> Un detergente non ionico 58; tipicamente combinato con NaCl. </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> 0.5-1% v / v </td><td> Un detergente non ionico 58; tipicamente combinato con NaCl o NH 4 CH 3 CO 2 H </td></tr><tr><td> CHAPS </td><td> 5 mM </td><td> Un detergente zwitterionico 58 &lt;/ Sup&gt;; tipicamente combinato con NaCl. </td></tr><tr><td> Sarkosyl </td><td> 1 mM </td><td> Un detergente anionico 58 che riduce i background e può togliere componenti complessi stabili, potenzialmente rivelando connettività binario; tipicamente combinato con NaCl. </td></tr><tr><td rowspan="2"> Tris-Cl </td><td> 20 mm </td><td rowspan="2"> pK a di 8,8 a 4 ° C, 8,1 a 25 ° C. </td></tr><tr><td> (PH 8,0) </td></tr><tr><td rowspan="2"> HEPES-Na </td><td> 20 mm </td><td rowspan="2"> pK a di 7,8 a 4 ° C, 7,5 a 25 ° C. NaOH o KOH usata per pH equilibrazione seconda del sale (per esempio, NaCl, KCl, o CH 3 CO 2 K) utilizzato nel solvente. </td></tr><tr><td> (PH 7.4) </td></tr></tbody></table> Tabella 1: Alcuni suggerito reagenti utile per purificare complessi proteici. Questa tabella lTSI alcuni reagenti che abbiamo trovato utile per purificare complessi proteici da linee cellulari umane, con concentrazioni di lavoro suggerite. Una tipica formulazione solvente contiene un tampone di pH, un sale, e un detergente 1,11,24,45-48. Le migliori pratiche è quello di individuare la combinazione meno complesso di reagenti che produce il risultato desiderato. <img alt="Figura S1" src="/files/ftp_upload/54518/54518figS1.jpg" /> Figura S1: Mescolare Dopo l&#39;analisi Purificazione (MAP-) SILAC di falsi positivi. I. Schema: In questo esperimento 3xFLAG-tagged complessi proteici ORF2p (espresse da pLD401) sono stati purificati da cellule heavy e light-etichettati HEK-293T 7, rispettivamente. L&#39;estratto cellulare luce etichettata è stata aggiunta una 3xFLAG peptide per evitare affinità cattura del ORF2p 3xFLAG-tag per inibizione competitiva; questo non è previsto per bloccare il legame di proteine ​​che possono verificarsi non specificamente con il mezzo magnetico o le strutture non paratopic dell&#39;anticorpo. Dopo l&#39;eluizione dalle sfere magnetiche, i campioni pesanti e leggeri sono stati misti post-purificazione e analizzato da MS quantitativa (MAP-SILAC 39) per determinare la frazione di proteine associate con entrambi campione; ulteriori dettagli metodologici situato nella Tabella S1. II. Argento macchiato gel illustra che i materiali leggeri e pesanti marcati forniscano risultati comparabili (confrontare L con H), e che la purificazione condotta in presenza del 3xFLAG picco-a (LI) era competitivamente inibita. Sotto, un G-250 spina Coomassie Blu gel colorato costituito dalla H misto e frazioni LI, prima dell&#39;analisi proteomica a base di gel, come descritto nella Tabella S1. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54518/54518figS1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per scaricare una versione più grande di questa figura.</a> Tabella S1:MAP-SILAC. Questa scheda contiene i dati ottenuti al momento dell&#39;esecuzione dell&#39;esperimento MAP-SILAC descritto nella figura S1. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54518/Table_S1.xlsx" target="_blank">Clicca qui per scaricare questa tabella.</a>

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Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Qui si descrivono i protocolli di perturbare le cellule di mammifero mediante fresatura a stato solido ad una temperatura criogenica, la produzione di un estratto cellulare dalla polvere di cellule risultante, e isolare complessi proteici di interesse per cattura affinità su perline paramagnetici micron scala anticorpi accoppiati.

Proteine ​​Complesso affinità Acquisizione da cellule di mammifero Cryomilled

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

protein-complex-affinity-capture-from-cryomilled-mammalian-cells

Research

JoVE Journal

Biochemistry

14.8K Views.  The Rockefeller University.  Qui si descrivono i protocolli di perturbare le cellule di mammifero mediante fresatura a stato solido ad una temperatura criogenica, la produzione di un estratto cellulare dalla polvere di cellule risultante, e isolare complessi proteici di interesse per cattura affinità su perline paramagnetici micron scala anticorpi accoppiati. 

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Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo identification of novel subunits and post-translational modifications. Bacterial systems allow for the expression and purification of a wide variety of single polypeptides and protein complexes. However, this system does not enable the purification of protein subunits that contain post-translational modifications (e.g., phosphorylation and acetylation), and the identification of novel regulatory subunits that are only present/expressed in the eukaryotic system. Here, we provide a detailed description of a novel, robust, and efficient tandem affinity purification (TAP) method using STREP- and FLAG-tagged proteins that facilitates the purification of protein complexes with transiently or stably expressed epitope-tagged proteins from eukaryotic cells. This protocol can be applied to characterize protein complex functionality, to discover post-translational modifications on complex subunits, and to identify novel regulatory complex components by mass spectrometry. Notably, this TAP method can be applied to study protein complexes formed by eukaryotic or pathogenic (viral and bacterial) components, thus yielding a wide array of downstream experimental opportunities. We propose that researchers working with protein complexes could utilize this approach in many different ways.

We describe here a novel, robust, and efficient tandem affinity purification (TAP) method for the expression, isolation, and characterization of protein complexes from eukaryotic cells. This protocol could be utilized for the biochemical characterization of discrete complexes as well as the identification of novel interactors and post-translational modifications that regulate their function.

Tandem Affinity Purification di complessi proteici da cellule eucariotiche

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Ricerca

Biochimica

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological processes. Affinity purification coupled to mass spectrometry (AP-MS) has become the method of choice for identifying protein-protein interactions. However, conventional AP-MS studies provide information on protein interactions, but the organizational information is lost. To address this issue, we developed a strategy to unravel the distinct functional assemblies a protein might be involved in, by resolving affinity-purified protein complexes prior to their characterization by mass spectrometry. Protein complexes isolated through affinity purification of a bait protein using an epitope tag and competitive elution are separated through blue native electrophoresis. Comparison of protein migration profiles through correlation profiling using quantitative mass spectrometry allows assignment of interacting proteins to distinct molecular entities. This method is able to resolve protein complexes of close molecular weights that might not be resolved by traditional chromatographic techniques such as gel filtration. With little more work than conventional AP-geLC-MS/MS, we demonstrate this strategy may in many cases be adequate for obtaining protein complex topological information concomitantly to identifying protein interactions.

Here we present protocols for affinity purification of protein complexes and their separation by blue native PAGE, followed by protein correlation profiling using label free quantitative mass spectrometry. This method is useful to resolve interactomes into distinct protein complexes.

Risoluzione purificato per affinità complessi proteici di Blue Native PAGE e proteine ​​correlazione Profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional gene regulation (PTGR) of messenger RNAs (mRNAs). In the past few years, a number of mRNA-bound proteomes from yeast and mammalian cell lines have been successfully isolated through the use of a novel method called &#34;mRNA interactome capture,&#34; which allows for the identification of mRNA-binding proteins (mRBPs) directly from a physiological environment. The method is composed of in vivo ultraviolet (UV) crosslinking, pull-down and purification of messenger ribonucleoprotein complexes (mRNPs) by oligo(dT) beads, and the subsequent identification of the crosslinked proteins by mass spectrometry (MS). Very recently, by applying the same method, several plant mRNA-bound proteomes have been reported simultaneously from different Arabidopsis tissue sources: etiolated seedlings, leaf tissue, leaf mesophyll protoplasts, and cultured root cells. Here, we present the optimized mRNA interactome capture method for Arabidopsis thaliana leaf mesophyll protoplasts, a cell type that serves as a versatile tool for experiments that include various cellular assays. The conditions for optimal protein yield include the amount of starting tissue and the duration of UV irradiation. In the mRNA-bound proteome obtained from a medium-scale experiment (107 cells), RBPs noted to have RNA-binding capacity were found to be overrepresented, and many novel RBPs were identified. The experiment can be scaled up (109 cells), and the optimized method can be applied to other plant cell types and species to broadly isolate, catalog, and compare mRNA-bound proteomes in plants.

Here, we present an interactome capture protocol applied to Arabidopsis thaliana leaf mesophyll protoplasts. This method critically relies on in vivo UV crosslinking and allows for the isolation and identification of plant mRNA-binding proteins from a physiological environment.

Cattura di Interactome mRNA da protoplasti vegetali

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant strains. Carbohydrate substrate binding proteins (SBPs) represent viable targets for the development of protein-based vaccines and new antimicrobials because of their extracellular localization and the centrality of carbohydrate import for pneumococcal metabolism, respectively. Described here is a rationalized integrated protocol to carry out a comprehensive characterization of SP0092, which can be extended to other carbohydrate SBPs from the pneumococcus and other bacteria. This procedure can aid the structure-based design of inhibitors for this class of proteins. Presented in the first part of this manuscript are protocols for biochemical analysis by thermal shift assay, multi angle light scattering (MALS), and size exclusion chromatography (SEC), which optimize the stability and homogeneity of the sample directed to crystallization trials and so enhance the probability of success. The second part of this procedure describes the characterization of the SBP crystals using a tunable wavelength anomalous diffraction synchrotron beamline, and data collection protocols for measuring data that can be used to resolve the crystallized protein structure.

A streamlined protocol for performing an extensive biochemical and structural characterization of a carbohydrate substrate binding protein from Streptococcus pneumoniae is presented.

Caratterizzazione biochimica e strutturale del carboidrato trasporto substrato-proteina-SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Toeprinting Analysis of Translation Initiation Complex Formation on Mammalian mRNAs

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation of protein synthesis is the key to cellular stress-response, and dysregulation is central to many disease states, such as cancer. For instance, although cellular stress leads to the inhibition of global translation by attenuating cap-dependent initiation, certain stress-response proteins are selectively translated in a cap-independent manner. Discreet RNA regulatory elements, such as cellular internal ribosome entry sites (IRESes), allow for the translation of these specific mRNAs. Identification of such mRNAs, and the characterization of their regulatory mechanisms, have been a key area in molecular biology. Toeprinting is a method for the study of RNA structure and function as it pertains to translation initiation. The goal of toeprinting is to assess the ability of in vitro transcribed RNA to form stable complexes with ribosomes under a variety of conditions, in order to determine which sequences, structural elements, or accessory factors are involved in ribosome binding&#8212;a pre-cursor for efficient translation initiation. Alongside other techniques, such as western analysis and polysome profiling, toeprinting allows for a robust characterization of mechanisms for the regulation of translation initiation.

Toeprinting aims to measure the ability of in vitro transcribed RNA to form translation initiation complexes with ribosomes under a variety of conditions. This protocol describes a method for toeprinting mammalian RNA and can be used to study both cap-dependent and IRES-driven translation.

Toeprinting analisi di traduzione Iniziazione formazione complessa su mRNAs mammiferi

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of protein-protein interactions (PPI) is no novelty, experimental approaches aiming to characterize endogenous protein-metabolite interactions (PMI) constitute a rather recent development. Herein, we present a protocol that allows simultaneous characterization of the PPI and PMI of a protein of choice, referred to as bait. Our protocol was optimized for Arabidopsis cell cultures and combines affinity purification (AP) with mass spectrometry (MS)-based protein and metabolite detection. In short, transgenic Arabidopsis lines, expressing bait protein fused to an affinity tag, are first lysed to obtain a native cellular extract. Anti-tag antibodies are used to pull down protein and metabolite partners of the bait protein. The affinity-purified complexes are extracted using a one-step methyl tert-butyl ether (MTBE)/methanol/water method. Whilst metabolites separate into either the polar or the hydrophobic phase, proteins can be found in the pellet. Both metabolites and proteins are then analyzed by ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry (UPLC-MS or UPLC-MS/MS). Empty-vector (EV) control lines are used to exclude false positives. The major advantage of our protocol is that it enables identification of protein and metabolite partners of a target protein in parallel in near-physiological conditions (cellular lysate). The presented method is straightforward, fast, and can be easily adapted to biological systems other than plant cell cultures.

Protein-protein and protein-metabolite interactions are crucial for all cellular functions. Herein, we describe a protocol that allows parallel analysis of these interactions with a protein of choice. Our protocol was optimized for plant cell cultures and combines affinity purification with mass spectrometry-based protein and metabolite detection.

2 in 1: purificazione di affinità per l'analisi parallela di proteina-proteina e proteina-metabolita complessi in un unico passaggio

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Affinity Purification of Chloroplast Translocon Protein Complexes Using the TAP Tag

Chloroplast biogenesis requires the import of thousands of nucleus-encoded proteins into the plastid. The import of these proteins depends on the translocon at the outer (TOC) and inner (TIC) chloroplast membranes. The TOC and TIC complexes are multimeric and probably contain yet unknown components. One of the main goals in the field is to establish the complete inventory of TOC and TIC components. For the isolation of TOC-TIC complexes and the identification of new components, the preprotein receptor TOC159 has been modified N-terminally by the addition of the tandem affinity purification (TAP) tag resulting in TAP-TOC159. The TAP-tag is designed for two sequential affinity purification steps (hence "tandem affinity"). The TAP-tag used in these studies consists of a N-terminal IgG-binding domain derived from Staphylococcus aureus Protein A (ProtA) followed by a calmodulin-binding peptide (CBP). Between these two affinity tags, a tobacco etch virus (TEV) protease cleavage site has been included. Therefore, TEV protease can be used for gentle elution of TOC159-containing complexes after binding to IgG beads. In the protocol presented here, the second Calmodulin-affinity purification step was omitted. The purification protocol starts with the preparation and solubilization of total cellular membranes. After the detergent-treatment, the solubilized membrane proteins are incubated with IgG beads for the immunoisolation of TAP-TOC159-containing complexes. Upon binding and extensive washing, TAP-TOC159 containing complexes are cleaved and released from the IgG beads using the TEV protease whereby the S. aureus IgG-binding domain is removed. Western blotting of the isolated TOC159-containing complexes can be used to confirm the presence of known or suspected TOC and TIC proteins. More importantly, the TOC159-containing complexes have been used successfully to identify new components of the TOC and TIC complexes by mass spectrometry. The protocol that we present potentially allows the efficient isolation of any membrane-bound protein complex to be used for the identification of yet unknown components by mass spectrometry.

We here present a proven and tested protocol for the purification of chloroplast protein import complexes (TOC-TIC complex) using the TAP-tag. The one-step affinity-isolation protocol can potentially be applied to any protein and be used to identify new interaction partners by mass spectrometry.

Purificazione di affinità del cloroplasto Translocon proteina complessi usando il Tag di rubinetto

Chloroplast biogenesis requires the import of thousands of nucleus-encoded proteins into the plastid. The import of these proteins depends on the ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis of transcriptome and gene expression by qPCR and RNA sequencing. Comprehensive transcriptome and gene expression analysis of specific cell types in complex tissues and organs will be critical to understand cellular and molecular mechanisms by which genes are regulated and their association with tissue homeostasis and organ functions. In this article, we demonstrate the methodology for isolation of ribosome-bound RNA directly in vivo in the vascular endothelia of animal lungs as an example. The specific materials and procedures for tissue processing and RNA purification will be described, including the assessment of RNA quality and yield as well as real time qPCR for arteriogenic gene assays. This approach, known as translating ribosome affinity purification (TRAP) technique, can be utilized for characterization of gene expression and transcriptome analysis of certain cell types directly in vivo in any specific type in complex tissues.

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

We present an approach to purify ribosome-bound mRNA from vascular endothelial cells (ECs) directly in mouse brain, lung and heart tissues via EC-specific genetic tag of enhanced green fluorescence protein (EGFP)in ribosomes in combination with RNA purification.

Traduzione della purificazione dell'affinità del ribosoma (TRAP) per l'isolamento dell'RNA dalle cellule endoteliali In vivo

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

Activated Cross-linked Agarose for the Rapid Development of Affinity Chromatography Resins - Antibody Capture as a Case Study

The purification of monoclonal antibodies (mAbs) is commonly achieved by Protein A affinity chromatography, which can account for up to 25% of the overall process costs. Alternative, cost-effective capture steps are therefore valuable for industrial-scale manufacturing, where large quantities of a single mAb are produced. Here we present a method for the immobilization of a DsRed-based epitope ligand to a cross-linked agarose resin allowing the selective capture of the HIV-neutralizing antibody 2F5 from crude plant extracts without using Protein A. The linear epitope ELDKWA was first genetically fused to the fluorescent protein DsRed and the fusion protein was expressed in transgenic tobacco (Nicotiana tabacum) plants before purification by immobilized metal-ion affinity chromatography. Furthermore, a method based on activated cross-linked agarose was optimized for high ligand density, efficient coupling and low costs. The pH and buffer composition and the soluble ligand concentration were the most important parameters during the coupling procedure, which was improved using a design-of-experiments approach. The resulting affinity resin was tested for its ability to selectively bind the target mAb in a crude plant extract and the elution buffer was optimized for high mAb recovery, product activity and affinity resin stability. The method can easily be adapted to other antibodies with linear epitopes. The new resins allow gentler elution conditions than Protein A and could also reduce the costs of an initial capture step for mAb production.

In this procedure, a DsRed-based epitope ligand is immobilized to produce a highly selective affinity resin for the capture of monoclonal antibodies from crude plant extracts or cell culture supernatants, as an alternative to Protein A.

Agarose cross-linked attivata per lo sviluppo rapido delle resine di maromtagrafia di affinità - Cattura anticorpale come caso di studio

The purification of monoclonal antibodies (mAbs) is commonly achieved by Protein A affinity chromatography, which can account for up to 25% of the overall ...

Detection of Protein S-Acylation using Acyl-Resin Assisted Capture

Protein S-acylation, also referred to as S-palmitoylation, is a reversible post-translational modification of cysteine residues with long-chain fatty acids via a labile thioester bond. S-acylation, which is emerging as a widespread regulatory mechanism, can modulate almost all aspects of the biological activity of proteins, from complex formation to protein trafficking and protein stability. The recent progress in understanding of the biological function of protein S-acylation was achieved largely due to the development of novel biochemical tools allowing robust and sensitive detection of protein S-acylation in a variety of biological samples. Here, we describe acyl resin-assisted capture (Acyl-RAC), a recently developed method based on selective capture of endogenously S-acylated proteins by thiol-reactive Sepharose beads. Compared to existing approaches, Acyl-RAC requires fewer steps and can yield more reliable results when coupled with mass spectrometry for identification of novel S-acylation targets. A major limitation in this technique is the lack of ability to discriminate between fatty acid species attached to cysteines via the same thioester bond.

Acyl-RAC (Acyl-Resin Assisted Capture) is a highly sensitive, reliable and easy to perform method to detect reversible lipid modification of cysteine residues (S-acylation) in a variety of biological samples.

Rilevamento di Protein S-Acylation utilizzando Acyl-Resin Assisted Capture

Protein S-acylation, also referred to as S-palmitoylation, is a reversible post-translational modification of cysteine residues with long-chain fatty ...

Proteine ​​Complesso affinità Acquisizione da cellule di mammifero Cryomilled

Proteine Complesso affinità Acquisizione da cellule di mammifero Cryomilled