Questo lavoro è stato sostenuto da NSF HRD-0630456, un NSF CREST Programma e NSF è DMR-0934142.

1. Sintesi di α, ω-dihydroxyl Polymer [HO-PEO-P2MS-PEO-OH] <ol><li> Assemblare reattore di polimerizzazione, come mostrato in Figura 1. Il reattore per questo esperimento sono costituiti da un fondo rotondo da 100 ml 2-collo pallone avente un giunto standard cono esterno (Chemglass), due adattatori di controllo del flusso con rubinetti (Chemglass), ed uno stelo Teflon agitazione. Adattatore A (Figura 1) è stato usato per mantenere Ultra High Purity (UHP) Azoto scorre attraverso il sistema per impedire all&#39;aria e all&#39;umidità di penetrare nel sistema inerte. Adattatore B (Figura 1) è stato usato per iniettare il solvente, monomero e iniziatore nel pallone di reazione. </li><li> Asciugare 200 ml di tetraidrofurano (THF) su metallo Na, utilizzando benzofenone come indicatore, per un minimo di 6 ore sotto gas azoto secco. </li><li> Asciugare 10 ml di 2-metossistirene su idruro di calcio per 24 ore. </li><li> Preparare un bagno freddo temperatura mantenuta a -78 ° C usando un impasto di isopropanolo and azoto liquido. </li><li> Aggiungere 25 ml di THF nel pallone di reazione di polimerizzazione (vedi Figura 1) sotto azoto e tenere reattore sotto gas azoto per tutta la polimerizzazione. </li><li> Mettere 100 ml pallone rotondo in slurry. </li><li> Aggiungere 2 ml (0,27 mmol / ml) di soluzione di iniziatore nel pallone di reazione. </li><li> Iniettare il primo monomero, 2-metossistirene (4 ml) nel pallone di reazione. </li><li> Consentono la reazione per 40 min. </li><li> Aggiungere 1 ml del secondo monomero, ossido di etilene. </li><li> Permettere la polimerizzazione di continuare a temperatura ambiente per due giorni. </li><li> Terminare il polimero con HCl (6 M) / metanolo (1/20, vol / vol). </li><li> Purificare il polimero mediante precipitazione in esani e polimero secco in un forno a vuoto. </li><li> Caratterizzare il polimero mediante NMR. </li></ol> 2. Funzionalizzazione di α, ω-dihydroxyl polimero con N-2 ,4-DNP-Ε-amino acido Caproic ottenere il Polym funzionaleer, CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP <ol><li> In un pallone a tre collo, posizionare il α, ω-dihydroxyl polimero (0,05 mmol), l&#39;acido N-2 ,4-DNP-E-ammino caproico (0,25 mmol), DCC (0,15 mmol) e DMAP (0,005 mmoli) e asciugare sulla linea di vuoto per 4 h. </li><li> Distillare diclorometano secco (10 ml) nel pallone. </li><li> Rilasciare il vuoto sotto azoto e mescolare reazione per 12 ore a temperatura ambiente. </li><li> Miscela di reazione filtro e recuperare polimero facendo precipitare due volte in esani e metanolo. </li><li> Asciutto polimero precipitato in un forno sotto vuoto a 40 ° C. </li><li> Determinare la struttura polimerica e funzionalità da FT-IR, 1 H NMR. </li></ol> 3. Preparazione della soluzione per CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP/SWCNT Electrospinning <ol><li> Sciogliere 20% w di CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP in clorobenzene. </li><li> Sciogliere 20% e il 40% w w di polistirene (MW 800.000) in clorobenzene per preparare due soluzioni. Il polistirene molecolare più elevato viene utilizzato per increase polimero a catena a catena entanglement e ottenere la viscosità ottimale necessaria per electrospinning. </li><li> Mescolare le soluzioni polimeriche preparate in 3.1 e 3.2 insieme per formare i rapporti 1:1 e 1:2 dei polimeri e di aggiungere 1 w% nanotubi di carbonio a parete singola (SWCNT) alla miscela e mescolare durante la notte per una distribuzione uniforme di nanotubi di carbonio. </li></ol> 4. Electrospinning di Polymer-Composite CNT <ol><li> Montare il electrospinning montata come mostrato nella Figura 2. Sul lato destro della figura è l&#39;Altissimo Sorgente Tensione Glassman. Accanto ad essa è uno stand replica su cui è collegato il wafer di silicio. A sinistra è un altro stand storta sul quale è montata la siringa e dietro è la lampada per visualizzare la procedura come progredisce. </li><li> Utilizzando una siringa ipodermica, prelevare una piccola quantità della miscela CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP/polystyrene/SWCNT (circa 1 ml) e montare la siringa ipodermica sul cavalletto storta. </li><li> Un wafer di silicio è il monteed attraverso dalla siringa in modo sicuro ad una distanza di 10 cm, e la clip massa della sorgente di alta tensione è collegato ad esso. </li><li> Fissare la clip recante l&#39;alta tensione da applicare l&#39;ago della siringa, spingere il pistone leggermente (per sospendere una goccia sulla punta dell&#39;ago) e, a questo punto, elettrofilatura è pronto. </li><li> Alimentazione della sorgente di alta tensione e regolare misuratore di tensione a 10 kV. A seconda della natura dei polimeri nel materiale composito, tensioni superiori può essere necessario, specialmente se nanofibre inferiore a 100 nanometri di diametro sono desiderati. </li><li> Wafer di silicio Smonta e mettere in un essiccatore durante la notte per asciugare completamente. </li></ol> 5. Caratterizzazione di Nanofibre <ol><li> Imaging iniziale di nanofibre è fatto con microscopio ottico per osservare la prospettiva globale delle fibre. </li><li> Utilizzare Microscopio Elettronico a Scansione di osservare i dettagli più fini, come morfologia, diametro, dimensione dei pori medio, ecc </li><li> Portaresu immagini ulteriormente con un microscopio a forza atomica per osservare 3-D topografia delle fibre, ecc </li></ol> 6. Specificità di legame di nanofibre con Anti-IgE DNP Protein <ol><li> Preparare una soluzione di 4 ug / l marcato in modo fluorescente, FITC-IgE (Fluorescein Isothio-cianato-Immunoglobuline E) in PBS-BSA (Soluzione tampone fosfato-albumina di siero bovino) soluzione. </li><li> Mettere un piccolo pezzo di wafer di silicio su cui ci sono nanofibre su un coprioggetto MatTek bene. Incubare le nanofibre in questa soluzione per un hr. Incubazione avviene pipettando gentilmente out, 10 ul soluzione IgE sul wafer di silicio. </li><li> Dopo l&#39;incubazione, rimuovere non legato IgE mediante lavaggio campione tre volte con PBS-BSA soluzione tampone. La soluzione di PBS viene erogato delicatamente sulla parete del piatto MatTek, per evitare spruzzi buffer direttamente sulle nanofibre. Agitare il piatto delicatamente a mano, per distribuire soluzione tampone su nanofibre. Rimuovere con cautela tampone con una pipetta e ritorba questo due volte. </li><li> Per il controllo, incubare a nanofibre IgG marcato in modo fluorescente (non specifico per DNP) nelle stesse condizioni. </li><li> Visualizza le fibre legate con un microscopio confocale a osservare legame con le IgE. Per il nostro studio, è stato utilizzato il microscopio confocale Leica TCS SP2 con lente 63x. </li></ol> 7. Corrente-tensione Comportamento delle nanofibre <ol><li class="jove_content"> Collegare due micro posizionatori ad una sorgente di corrente molto bassa come il SourceMeter 6430 Keithley sensibile. La impostato per determinare il comportamento corrente di tensione è mostrato in Figura 3. Questa figura mostra la stazione di sonda utilizzata per determinare le caratteristiche iniziali IV delle nanofibre. Esso è costituito dalla Bausch and Lomb Microscopio MicroZoom, una fase di vuoto Chuck, e quattro Micropositioners utilizzate delle sonde. In alto a destra è l&#39;Agilent 34405A Multimetro digitale utilizzato nella misurazione della tensione e sotto che è il<html> Keithley 6430 Sub-Femtoamp Meter Fonte remoto utilizzato per rifornirsi di basse correnti che sono stati immessi nelle fibre. </li><li class="jove_content"> Montare i bracci di sonda dei posizionatori micro sul tappeto di fibre da parti opposte con le punte toccano le fibre. </li><li class="jove_content"> Collegare altri due micro posizionatori a un multimetro digitale, montare i bracci di sonda in-tra gli altri due e la terra le punte sul tappeto di fibre. Assicurarsi che le quattro punte sono allineati il ​​più possibile. </li><li class="jove_content"> Ingresso diverse quantità di corrente dalla Keithley (tipicamente nell&#39;intervallo nA). </li><li class="jove_content"> Misurare la caduta di tensione attraverso le punte esterne, per ogni grandezza della corrente erogata. </li><li class="jove_content"> Riportando questi valori indicano il tipo di dispositivo, il feltro di fibre comporta come. </li></ol> 8. Risultati rappresentativi Functional Polymer &quot;&gt; Il metodo per la sintesi di α, ω-bi [2,4-dinitrofenile caproico] [poli (etilene ossido)-b-poli (2-metossistirene)-b-poli (ossido di etilene)] (CDNP-PEO- P2MS-PEO-CDNP) è mostrato in Figura 4. 1 La struttura del polimero funzionale è stata confermata da FT-IR (Figura 5) e 500 MHz 1 H NMR (Figura 6). La FT-IR mostra la totale scomparsa dei la-OH assorbimento ampia circa 3.500 cm -1 indicano funzionalizzazione quantitativa con il gruppo CDNP. Ciò è confermato anche dallo spettro NMR mostrato in Figura 6. Uso l&#39;integrazione dei picchi dello spettro NMR, è stato determinato che il CDNP-PEO polimeri-P2MS-PEO-CDNP sono quantitativamente funzionalizzati. Nanofibre In figura 7, una stuoia di nanofibre conduttivi ottenuti elettrofilatura CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP / polistirene / SWCNT da clorobenzene è shproprio. Immagini confocali ottenuti hanno dimostrato che la proteina si lega con l&#39;IgE DNP sulla superficie della fibra. 3 Questa è un&#39;indicazione della specificità di legame di elettrofilati DNP-polimeri verso anticorpi IgE. L&#39;intensità della luce è un indicatore della presenza di IgE sulle nanofibre come la proteina fluorescente viene etichetta. Figura 8a è un (Atomic Force Microscope) immagine AFM di una delle nanofibre ottenute da questo processo e figura 8b mostra la dimensione di questo nanofibre particolare è di circa 150 nm di diametro. Da questo processo fibre tra 100-700 nm vengono ottenute. In questo momento attuale è difficile da preparare fibre con una dimensione specifica. Questo è coerente con quanto osservato da altri gruppi. 4 Figura 9 mostra le immagini SEM di CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP / polistirene / SWCNT nanofibre e il diametro delle nanofibre sono tra 200 nm a 300 nm. Ci sono tre SEM immagini di nanofibers mostrato a diversi ingrandimenti. Studio delle tre immagini mostra le morfologie delle fibre sono lineari e perline. L&#39;obiettivo generale è quello di preparare le fibre che sono per lo più lineare. Figura 10 mostra il grafico IV di tappeti di nanofibre preparate da CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP / polistirolo / SWCNT. Il grafico mostra il comportamento di un resistore (ohmico). Quando l&#39;antigene è legata alle nanofibre, ci aspettiamo di vedere un cambiamento nel comportamento IV del tappeto di fibre come questa variazione di resistenza è una caratteristica che suggerisce che le fibre funzionali hanno potenziali applicazioni come il componente attivo in sensori per il rilevamento singola molecola . <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4135/4135fig1.jpg" /> Figura 1. Reattore di polimerizzazione per sintetizzare il α, ω-dihydroxyl polimero. A) Il punto di iniezione per il flusso di azoto gassoso UHP. B.) il punto di iniezione per il solvente, monomero, e iniziatore. C) Il recipiente di reazione. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4135/4135fig2.jpg" /> Figura 2. Configurazione utilizzata per electrospinning utilizzando una sorgente di tensione ad alta Glassman. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4135/4135fig3.jpg" /> Figura 3. Installazione utilizzato per misurare appezzamenti IV, per una sub-femtoamp Remote SourceMeter (Keithley). <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/4135/4135fig4.jpg" /> Figura 4. A). Approccio sintetico per la preparazione OH-PEO-P2MS-PEO-OH polimeri. B) Funzionalizzazione di α, ω-diidrossi [poli (etilenossido)-b-poli (2-metossistirene)-b-poli (ossido di etilene)]. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/4135/4135fig5.jpg" /> Figura 5. Spettri FT-IR di (A) OH-PEO-P2MS-PEO-OH, precursore CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP e (B) CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP. <img alt="Figura 6"src = &quot;/ files/ftp_upload/4135/4135fig6.jpg&quot; /&gt; Figura 6. 500 MHz NMR del protone di CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/4135/4135fig7.jpg" /> Figura 7. A) immagine legame di FITC-IgE con CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP fibre elettrofilate da clorobenzene. B) Immagine al microscopio confocale del controllo (nanofibre con IgG). <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/4135/4135fig8.jpg" /> Figura 8. A) immagine AFM di CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP Fibre elettrofilate da clorobenzene e B) AFM profilo dimensione cioè di una fibra illustrato nella figura 5a. <img alt="Figura 9" src="/files/ftp_upload/4135/4135fig9.jpg" /> Figura 9. Immagini SEM di CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP / polistirolo / SWCNT nanofibre. <img alt="Figura 10" src="/files/ftp_upload/4135/4135fig10.jpg"/&gt; Figura 10. Trama IV di stuoie di nanofibre preparate da CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP / polistirolo / SWCNT.

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	<li>Sannigrahi, B., Sil, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+Characterization+of+&#945;,&#969;-bi[2,4-dinitrophenyl+(DNP)]+poly(2-methoxystyrene)+Functional+Polymers.+Preliminary+Evaluation+of+the+Interaction+of+the+Functional+Polymers+with+RBL+Mast+Cells.">Synthesis and Characterization of &#945;,&#969;-bi[2,4-dinitrophenyl (DNP)] poly(2-methoxystyrene) Functional Polymers. Preliminary Evaluation of the Interaction of the Functional Polymers with RBL Mast Cells.</a> Journal of Macromolecular Science, Part A. 45, 664-671 (2008).</li><li>Gordon, K., Sannigrahi, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+Optically+Active+Helical+Poly(2-methoxystyrene).+Enhancement+of+HeLa+and+Osteoblast+Cell+Growth+on+Optically+Active+Helical+Poly(2-methoxystyrene)+Surfaces.">Synthesis of Optically Active Helical Poly(2-methoxystyrene). Enhancement of HeLa and Osteoblast Cell Growth on Optically Active Helical Poly(2-methoxystyrene) Surfaces.</a> Journal of Biomaterials Science. 2, 2055-2072 (2009).</li><li>Baird, E. J., Holowka, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Effective+Poly(Ethylene+Glycol)+Architectures+for+Specific+Inhibition+of+Immune+Receptor+Activation.">Highly Effective Poly(Ethylene Glycol) Architectures for Specific Inhibition of Immune Receptor Activation.</a> Biochemistry. 2, 12739-12748 (2003).</li><li>Ramakrisna, S., Fugihara, K., Lim, W. -. E., Ma, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Introductions to Electrospinning and Nanofibers. , (2005).</li><li>Kameoka, J., Craighead, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+Oriented+Polymeric+Nanofibers+on+Planar+Surfaces+by+Electrospinning.">Fabrication of Oriented Polymeric Nanofibers on Planar Surfaces by Electrospinning.</a> Applied Physics Letters. 83, 371-3773 (2003).</li><li>Ramakrishna, S., Lala, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymer+Nanofibers+for+Biosensor+Applications.">Polymer Nanofibers for Biosensor Applications.</a> Topics in Applied Physics. 109, 377-392 (2007).</li><li>Reuven, D., Sil, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Archetypical+Conductive+Polymer+Structure+for+Specific+Interaction+with+Proteins.">Archetypical Conductive Polymer Structure for Specific Interaction with Proteins.</a> Journal of Macromolecular Science Part A: Pure and Applied Chemistry. , (2012).</li><li>Ogunro, O., Karunwi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chiral+Asymmetry+of+Helical+Polymer+Nanowire.">Chiral Asymmetry of Helical Polymer Nanowire.</a> The Journal of Physical Chemistry Letters. 1, 704-707 (2010).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

In questa relazione, abbiamo presentato un approccio efficace per la preparazione di nanofibre biofunzionali. Le nanofibre sono decorate ad un gruppo funzionale che è specifico di una proteina modello. Il procedimento e l&#39;approccio contenute in questa comunicazione sono di natura generale e può essere utilizzato per preparare nanofibre decorati con qualsiasi gruppo funzionale desiderato. La polimerizzazione anionica vivente è potente metodo per sintetizzare strutture polimeriche controllati covalentemente legati ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> Sodio metallico </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 282065 </td></tr><tr><td> Benzophenone </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 239852 </td></tr><tr><td> 2-metossistirene </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 563064 </td></tr><tr><td> Tetraidrofurano </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 178810 </td></tr><tr><td> Clorobenzene </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 319996 </td></tr><tr><td> CNT a parete singola </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 704113 </td></tr><tr><td> Polistirolo </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 81416 </td></tr><tr><td> Silicon Wafer </td><td> Silicon Quest Int&#39;l </td><td> 720200 </td></tr><tr><td> Zeiss FESEM </td><td> Carl Zeiss Inc. </td><td> Ultra 60 </td></tr><tr><td> Probestation con Bausch &amp; Lomb MicroZoom II microscopio ad alte prestazioni </td><td> Bausch e Lomb </td><td></td></tr><tr><td> Leica Confocal scansione del sistema </td><td> Leica Microsystems </td><td> TCS SP2 </td></tr><tr><td> Sub-femtoamp SourceMeter remoto </td><td> Keithley Instruments </td><td> 6430 </td></tr><tr><td> Selezione automatica Multimetro digitale </td><td> Keithley Instruments </td><td> 175A </td></tr><tr><td> Pompa a siringa </td><td> Chemyx Inc. </td><td> Fusion 200 </td></tr><tr><td> Microscopio ottico Zeiss </td><td> Carl Zeiss Inc. </td><td> Zeiss / AxioTECH </td></tr></tbody></table>

procedure for fabricating biofunctional nanofibers

Elettrofilatura è un metodo di trattamento efficace per la preparazione di nanofibre decorate con gruppi funzionali. Nanofibre decorati con gruppi funzionali possono essere utilizzati per studiare le interazioni materiale-biomarker cioè agire come biosensori con potenziale come rivelatori di singola molecola. Abbiamo sviluppato un approccio efficace per la preparazione di polimeri funzionali dove la funzionalità è la capacità di legarsi specificamente con una proteina modello. Nel nostro sistema modello, il gruppo funzionale è 2,4-dinitrofenil (DNP) e la proteina è anti-DNP IgE (immunoglobuline E). Il polimero funzionale, α, ω-bi [2,4-dinitrofenile caproico] [poli (etilene ossido)-b-poli (2-metossistirene)-b-poli (ossido di etilene)] (CDNP-PEO-P2MS-PEO- CDNP), viene preparato mediante polimerizzazione anionica vivente. L&#39;iniziatore difunzionale utilizzato nella polimerizzazione è stato preparato mediante reazione di trasferimento di elettroni di α-metilstirene e potassio (specchio) metallo. Il 2-metossistirene monomero è stato aggiuntoprima l&#39;iniziatore, seguita dalla aggiunta del secondo monomero, ossido di etilene, e infine il polimero vivente è stato terminato da metanolo. L&#39;α, ω-dihydroxyl polimero [HO-PEO-P2MS-PEO-OH] è stato fatto reagire con N-2 ,4-DNP-∈-ammino caproico, mediante accoppiamento DCC, causando la formazione di α, ω-bi [ 2,4-dinitrophenylcaproic] [poli (etilenossido)-b-poli (2-metossistirene)-b-poli (ossido di etilene)] (CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP). I polimeri sono stati caratterizzati da FT-IR, 1 H NMR e Gel Permeation Chromatography (GPC). Le distribuzioni di peso molecolare dei polimeri erano strette (1,1-1,2) e polimeri con peso molecolare maggiore di 50.000 è stato utilizzato in questo studio. I polimeri sono stati polveri giallo e solubile in tetraidrofurano. Un solubile in acqua CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP / DMEG (glicole dimethoxyethylene) si lega e raggiunge vincolante stato stazionario con la soluzione di IgE nel giro di pochi secondi. Alto peso molecolare (cioè acqua insolubile circa 50.000) CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP polimeri, contenente 1% di nanotubi di carbonio a parete (SWCNT) sono stati trasformati in nanofibre elettroattivi (100 nm a 500 nm di diametro) sul substrato di silicio. Spettroscopia di fluorescenza mostra che anti-DNP IgE interagisce con le nanofibre legandosi con i gruppi funzionali DNP decorare le fibre. Queste osservazioni suggeriscono che nanofibre opportunamente funzionalizzati promettenti per lo sviluppo di rilevamento del dispositivo biomarker.

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Procedure for Fabricating Biofunctional Nanofibers

Un approccio efficace per la preparazione di nanofibre decorate con gruppi funzionali in grado di interagire specificamente con proteine ​​è descritto. Il primo approccio richiede la preparazione di un polimero funzionalizzato con gruppo funzionale adeguata. Il polimero funzionale è realizzato in nanofibre da electrospinning. L&#39;efficacia del legame delle nanofibre con una proteina viene studiata tramite microscopia confocale.

Procedimento per la realizzazione di nanofibre Biofunzionali

Electrospinning is an effective processing method for preparing nanofibers decorated with functional groups. Nanofibers decorated with functional groups ...

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Research

JoVE Journal

Biology

12.5K Views.  Clark Atlanta University. Un approccio efficace per la preparazione di nanofibre decorate con gruppi funzionali in grado di interagire specificamente con proteine ​​è descritto. Il primo approccio richiede la preparazione di un polimero funzionalizzato con gruppo funzionale adeguata. Il polimero funzionale è realizzato in nanofibre da electrospinning. L'efficacia del legame delle nanofibre con una proteina viene studiata tramite microscopia confocale.

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A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging

Imaging techniques are becoming increasingly important in the study brain function. Among them, two-photon laser scanning microscopy has emerged as an extremely useful method, because it allows the study of the live intact brain. With appropriate preparations, this technique allows the observation of the same cortical area chronically, from minutes to months. In this video, we show a preparation for chronic in vivo imaging of the brain using two-photon microscopy. This technique was initially pioneered by Dr. Karel Svoboda, who is now a Howard Hughes Medical Institute Investigator at Janelia Farm. Preparations like the one shown here can be used for imaging of neocortical structure (e.g., dendritic and axonal dynamics),  to record neuronal activity using calcium-sensitive dyes, to image cortical blood flow dynamics, or for intrinsic optical imaging studies. Deep imaging of the neocortex is possible with optimal cranial window surgeries. Operating under the most sterile conditions possible to avoid infections, together with using extreme care to do not damage the dura mater during the surgery, will result in successful and long-lasting glass-covered cranial windows.


This video and protocol demonstrate how to implant a glass-covered cranial window in rodents. These preparations can be used for chronic in vivo two-photon imaging of the neocortex over time scales of months. It may also be used for other types of imaging, including optical intrinsic signal imaging.

Un Chirurgia Procedura Craniotomia per l&#39;imaging cerebrale cronica

Imaging techniques are becoming increasingly important in the study brain function. Among them, two-photon laser scanning microscopy has emerged as an ...

Ricerca

Biologia

Murine Renal Transplantation Procedure

Renal orthotopic transplantation in mice is a technically challenging procedure. Although the first kidney transplants in mice were performed by Russell et al over 30 years ago (1) and refined by Zhang et al years later (2), few people in the world have mastered this procedure. In our laboratory we have successfully performed 1200 orthotopic kidney transplantations with &gt; 90% survival rate. The key points for success include stringent control of reperfusion injury, bleeding and thrombosis, both during the procedure and post-transplantation, and use of 10-0 instead of 11-0 suture for anastomoses.
Post-operative care and treatment of the recipient is extremely important to transplant success and evaluation. All renal graft recipients receive antibiotics in the form of an injection of penicillin immediately post-transplant and sulfatrim in the drinking water continually. Overall animal health is evaluated daily and whole blood creatinine analyses are performed routinely with a portable I-STAT machine to assess graft function.

Renal transplantation in mice is a technically challenging procedure that requires careful post-operative care and treatment for success.

Murino procedura trapianto renale

Renal orthotopic transplantation in mice is a technically challenging procedure. Although the first kidney transplants in mice were performed by Russell ...

Bioluminescence Imaging of Heme Oxygenase-1 Upregulation in the Gua Sha Procedure

Gua Sha is a traditional Chinese folk therapy that employs skin scraping to cause subcutaneous microvascular blood extravasation and bruises. The protocol for bioluminescent optical imaging of HO-1-luciferase transgenic mice reported in this manuscript provides a rapid in vivo assay of the upregulation of the heme oxygenase-1 (HO-1) gene expression in response to the Gua Sha procedure. HO-1 has long been known to provide cytoprotection against oxidative stress. The upregulation of HO-1, assessed by the bioluminescence output, is thought to represent an antioxidative response to circulating hemoglobin products released by Gua Sha. Gua Sha was administered by repeated strokes of a smooth spoon edge over lubricated skin on the back or other targeted body part of the transgenic mouse until petechiae (splinter hemorrhages) or ecchymosis (bruises) indicative of extravasation of blood from subcutaneous capillaries was observed. After Gua Sha, bioluminescence imaging sessions were carried out daily for several days to follow the dynamics of HO-1 expression in multiple internal organs.

Gua Sha, traditional Chinese therapeutic skin scraping, causes subcutaneous microvascular blood extravasation. We report a protocol of bioluminescence imaging of HO-1-luciferase transgenic mice to demonstrate that Gua Sha upregulates heme oxygenase-1 (HO-1) in multiple organs.

Imaging bioluminescenza di eme ossigenasi-1 sovraregolazione alla Procedura di Gua Sha

Gua Sha is a traditional Chinese folk therapy that employs skin scraping to cause subcutaneous microvascular blood extravasation and bruises. The protocol ...

Mammary Epithelial Transplant Procedure

This article describes and compares the fat pad clearance procedure developed by DeOme KB et al.1 and the sparing procedure developed by Brill B et al.2, followed by the mammary epithelial transplant procedure. The mammary transplant procedure is widely used by mammary biologists because it takes advantage of the fact that significant development of the mammary epithelium doesn't occur until after puberty. At 3 weeks of age, growth of the mammary epithelial tree is confined to the vicinity of the nipple and the fat pad is largely devoid of mammary epithelium, but by 7 weeks of age the epithelial ductal tree extends throughout the entire fat pad. Therefore, if this small portion of the fat pad containing epithelium, the region between the nipple and the lymph node, is removed at 3 weeks of age, the endogenous epithelium will never populate the mammary fat pad and the fat pad is described as "cleared". At this time, mammary epithelium from another source can be transplanted in the cleared fat pad where it has the potential to extend mammary ductal trees through out the fat pad. This procedure has been utilized in many experimental models including the examination of tumor phenotype in transgenic mammary epithelial tissue without the confounding effects of genotype on the entire animal3, in the identification of mammary stem cells by transplanting cells in limited dilution4,5, determining if hyperplastic nodules proceed to mammary tumors6, and to assess the effect of prior hormone exposure on the behavior of the mammary epithelium7,8.
Three week old host mice are anesthetized, cleaned and restrained on a surgical stage. A mid-sagittal incision is made through the skin, but not the peritoneum, extending from the pubis to the sternum. Oblique cuts are made through the skin from the mid-sagittal incision across the pelvis toward each leg. The skin is pulled away from the peritoneum to expose the 4th inguinal mammary gland. The fat pad is cleared by removing the fat pad tissue anterior to the lymph node. Epithelium fragments or epithelial cells are transplanted into the remaining cleared fat pad and the mouse is closed.

This article demonstrates the procedure developed by DeOme KB et al. (1959) and the sparing procedure developed by Brill B et al. (2008) for clearing the 4th inguinal mammary fat pad of a pubescent mouse in preparation for transplantation of mammary fragments, mammary epithelial cells, or mammary tumor cells.

Procedura di trapianto epiteliali mammarie

This article describes and compares the fat pad clearance procedure developed by DeOme KB et al.1 and the sparing procedure developed by Brill B et al.2, ...

A Chemical Screening Procedure for Glucocorticoid Signaling with a Zebrafish Larva Luciferase Reporter System

Glucocorticoid stress hormones and their artificial derivatives are widely used drugs to treat inflammation, but long-term treatment with glucocorticoids can lead to severe side effects. Test systems are needed to search for novel compounds influencing glucocorticoid signaling in vivo or to determine unwanted effects of compounds on the glucocorticoid signaling pathway. We have established a transgenic zebrafish assay which allows the measurement of glucocorticoid signaling activity in vivo and in real-time, the GRIZLY assay (Glucocorticoid Responsive In vivo Zebrafish Luciferase activitY). The luciferase-based assay detects effects on glucocorticoid signaling with high sensitivity and specificity, including effects by compounds that require metabolization or affect endogenous glucocorticoid production. We present here a detailed protocol for conducting chemical screens with this assay. We describe data acquisition, normalization, and analysis, placing a focus on quality control and data visualization. The assay provides a simple, time-resolved, and quantitative readout. It can be operated as a stand-alone platform, but is also easily integrated into high-throughput screening workflows. It furthermore allows for many applications beyond chemical screening, such as environmental monitoring of endocrine disruptors or stress research.

We describe the procedure and data analysis of a chemical screening system for glucocorticoid stress hormone signaling using zebrafish larvae: the Glucocorticoid Responsive In vivo Zebrafish Luciferase activitY (GRIZLY) assay. The assay sensitively and specifically detects effects on glucocorticoid signaling by compounds that require metabolization or affect endogenous glucocorticoid production.

Una procedura di screening chimico per glucocorticoidi segnalazione con un reporter del sistema Zebrafish Larva Luciferase

Glucocorticoid stress hormones and their artificial derivatives are widely used drugs to treat inflammation, but long-term treatment with glucocorticoids ...

Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure

The liver, an organ with an exceptional regeneration capacity, carries out a wide range of functions, such as detoxification, metabolism and homeostasis. As such, hepatocytes are an important model for a large variety of research questions. In particular, the use of human hepatocytes is especially important in the fields of pharmacokinetics, toxicology, liver regeneration and translational research. Thus, this method presents a modified version of a two-step collagenase perfusion procedure to isolate hepatocytes as described by Seglen 1.
Previously, hepatocytes have been isolated by mechanical methods. However, enzymatic methods have been shown to be superior as hepatocytes retain their structural integrity and function after isolation. This method presented here adapts the method designed previously for rat livers to human liver pieces and results in a large yield of hepatocytes with a viability of 77&plusmn;10%. The main difference in this procedure is the process of cannulization of the blood vessels. Further, the method described here can also be applied to livers from other species with comparable liver or blood vessel sizes.

A modified two-step collagenase perfusion procedure for isolation of human hepatocytes is described. This method can also be applied to other mammalian livers. The isolated hepatocytes are available in high yield and viability, making them a suitable model for scientific research in areas such as liver regeneration, pharmacokinetics and toxicology.

L&#39;isolamento di epatociti umani da un Two-step Collagenase perfusione procedura

The liver, an organ with an exceptional regeneration capacity, carries out a wide range of functions, such as detoxification, metabolism and homeostasis. ...

Procedure to Evaluate the Efficiency of Flocculants for the Removal of Dispersed Particles from Plant Extracts

Plants are important to humans not only because they provide commodities such as food, feed and raw materials, but increasingly because they can be used as manufacturing platforms for added-value products such as biopharmaceuticals. In both cases, liquid plant extracts may need to be clarified to remove particulates. Optimal clarification reduces the costs of filtration and centrifugation by increasing capacity and longevity. This can be achieved by introducing charged polymers known as flocculants, which cross-link dispersed particles to facilitate solid-liquid separation. There are no mechanistic flocculation models for complex mixtures such as plant extracts so empirical models are used instead. Here a design-of-experiments procedure is described that allows the rapid screening of different flocculants, optimizing the clarification of plant extracts and significantly reducing turbidity. The resulting predictive models allow the identification of robust process conditions and sets of polymers with complementary properties, e.g. effective flocculation in extracts with specific conductivities. The results presented for tobacco leaf extracts can easily be adapted to other plant species or tissues and will thus facilitate the development of more cost-effective downstream processes for commodities and plant-derived pharmaceuticals.

The design-of-experiments procedure presented here allows the evaluation of different flocculants in terms of their ability to aggregate dispersed particles in plant extracts, thus reducing turbidity and the costs of downstream processing.

Procedura per valutare l&#39;efficienza di flocculanti per la rimozione di particelle disperse di estratti di piante

Plants are important to humans not only because they provide commodities such as food, feed and raw materials, but increasingly because they can be used ...

Procedure and Key Optimization Strategies for an Automated Capillary Electrophoretic-based Immunoassay Method

New technologies that utilize capillary-based immunoassays promise faster and more quantitative protein assessment compared to traditional immunoassays. However, similar to other antibody-based protein assays, optimization of capillary-based immunoassay parameters, such as protein concentration, antibody dilution, and exposure time is an important prerequisite to the generation of meaningful and reliable data. Measurements must fall within the linear range of the assay where changes in signal are directly proportional to changes in lysate concentration. The process of choosing appropriate lysate concentrations, antibody dilutions, and exposure times in the human bronchial epithelial cell line, BEAS-2B, is demonstrated here. Assay linearity is shown over a range of whole cell extract protein concentrations with p53 and &#945;-tubulin antibodies. An example of signal burnout is seen at the highest concentrations with long exposure times, and an &#945;-tubulin antibody dilution curve is shown demonstrating saturation. In addition, example experimental results are reported for doxorubicin-treated cells using optimized parameters.

A capillary-based immunoassay using a commercial platform to measure target proteins from total protein preparations is demonstrated. In addition, assay parameters of exposure time, protein concentration, and antibody dilution are optimized for a cell culture model system.

Procedure e strategie di ottimizzazione chiave per un metodo automatizzato Immunoassay basati su elettroforetica capillare

New technologies that utilize capillary-based immunoassays promise faster and more quantitative protein assessment compared to traditional immunoassays. ...

A Semiautomated ChIP-Seq Procedure for Large-scale Epigenetic Studies

Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-Seq) is a powerful and widely used approach to profile chromatin DNA associated with specific histone modifications, such as H3K27ac, to help identify cis-regulatory DNA elements. The manual process to complete a ChIP-Seq is labor intensive, technically challenging, and often requires large-cell numbers (&#62;100,000 cells). The method described here helps to overcome those challenges. A complete semiautomated, microscaled H3K27ac ChIP-Seq procedure including cell fixation, chromatin shearing, immunoprecipitation, and sequencing library preparation, for batch of 48 samples for cell number inputs less than 100,000 cells is described in detail. The semiautonomous platform reduces technical variability, improves signal-to-noise ratios, and drastically reduces labor. The system can thereby reduce costs by allowing for reduced reaction volumes, limiting the number of expensive reagents such as enzymes, magnetic beads, antibodies, and hands-on time required. These improvements to the ChIP-Seq method suit perfectly for large-scale epigenetic studies of clinical samples with limited cell numbers in a highly reproducible manner.

This paper describes a semiautomated, microscaled ChIP-Seq protocol of DNA regions associated with a specific histone modification (H3K27ac) using a ChIP liquid-handler platform, followed by library preparation using tagmentation. The procedure includes control assessment for quality and quantity purposes and can be adopted to other histone modifications or transcription factors.

Una procedura ChIP-Seq semiautomatica per studi epigenetici su larga scala

Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-Seq) is a powerful and widely used approach to profile chromatin DNA associated with specific ...

Migliorare la sopravvivenza e lo sviluppo degli uistitì utilizzando un approccio di allevamento manuale

Hand-Rearing Method for Infant Marmosets

The common marmoset (Callithrix jacchus) is a small and highly social New World monkey with high reproduction rates, which has been proven to be a compelling non-human primate model for biomedical and neuroscience research. Some females give birth to triplets; however, the parents cannot raise all of them. To save these infants, we have developed a hand-rearing method for raising newborn marmosets. In this protocol, we describe the formula of the food, the time for feeding, the configuration of the temperature and humidity, as well as the adaptation of the hand-reared infants to the colony environment. This hand-rearing method significantly increases the survival rate of marmoset infants (without hand-rearing: 45%; with hand-rearing: 86%) and provides the opportunity to study the development of marmoset infants with similar genetic backgrounds raised in different postnatal environments. As the method is practical and easy to use, we anticipate that it could also be applied to other labs working with common marmosets.

Autore in primo piano: Marmosettì Research - Ambito e sfide 

Here, we describe a hand-rearing method for raising infant marmosets in an animal incubator. This method greatly increases the survival rate of marmoset infants, which provides the opportunity to study the development of marmoset infants with similar genetic backgrounds raised in different postnatal environments.