C'è un crescente apprezzamento per l'impatto del microambiente meccanico sulla segnalazione cellulare e sulla migrazione. Richiede l'uso di approcci unici e sperimentali per fornire stimolazione meccanica alle singole cellule. Questa tecnica consente la manipolazione dinamica del micro-ambiente meccanico sotto una cella in tempo reale.
Consentire l'osservazione di cambiamenti regolati meccanicamente nel comportamento di migrazione cellulare e di eventi di segnalazione subcellulare. A dimostrare la procedura con me ci saranno Nyla Naim, un post-doc e Johnathan Patterson, un tecnico del nostro laboratorio. Iniziare utilizzando un Chorono-1 per attivare la superficie di vetro di ogni coperchio inferiore scivolare per 20 secondi, prima di sovrasporare immediatamente 50 microlitri di legare la soluzione di lavoro del silane su ogni slittamento del coperchio.
Lasciare asciugare la soluzione per 10 minuti prima di risciacquare il coperchio scivola due volte con il 95% di etanolo e due volte con isopropanolo. Quindi, lasciare che il coperchio scivoli ad asciugare all'aria per circa 20 minuti. Per la deposizione fluorescente di micro-perline, sonicare prima la soluzione di micro-perline funzionante per un'ora.
15 minuti prima della fine della sonicazione, posizionare il coperchio attivato scivola verticalmente in un portascivolo di copertura in ceramica e trasferire il supporto in un detergente al plasma da tavolo per il trattamento al plasma dell'aria ambiente per tre minuti. Successivamente, posizionare pezzi di pellicola di paraffina in coperchi per piatti petri da 60 millilitri e posizionare la copertura scivola sulle pellicole, toccando leggermente ogni slitta di copertura per garantire un buon contatto tra il film e il copripazzo. Quindi, aggiungere 150 microlitri della soluzione di perline di lavoro nella parte superiore di ogni coverlip e aspirare immediatamente la soluzione di etanolo dal lato dei copricapo, lasciando le perline sul coperchio.
Per lanciare gli idrogel subito dopo la loro preparazione, aggiungere una goccia da 25 microliter di soluzione Hydrogel sul lato attivato di ogni copriletto inferiore e capovolgere immediatamente i copripacchi superiore perline, lato perline verso il basso, sulla goccia. Lasciare polimerizzare i gel per 30 minuti prima di utilizzare le forcep per rimuovere delicatamente le coverlips. Quindi, sciacquare i gel con lavaggi di tre, cinque minuti in 50 miliMoler Hepes per lavaggio.
Per attivare le superfici hydrogels, incubare i gel in 50 miliMoler Hepes freschi, integrati con 0,4 miliMolar Sulfo Sanpah, ed esporre immediatamente i gel a una lampada ad arco ultravioletto in un'area chiusa per 90 secondi. Al termine dell'attivazione, lavare i gel con lavaggi di tre, cinque minuti in Hepes fresco e trattare gli idrogel attivati con 20 microgrammi per millilitro di fibronectina per un'ora a 37 gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, aspirare la soluzione di fibronectina in eccesso e lavare i gel tre volte in PBS per cinque minuti per lavaggio.
Dopo l'ultimo lavaggio, posizionare gli Idrogel in un piccolo volume di PBS e sterilizzare i gel per 15 minuti sotto la luce ultravioletta in un cappuccio di coltura tissutale. Quindi, lavare i gel una volta in PBS fresco. Per la placcatura cellulare, seme 2.1 per 10 le quattro delle cellule di interesse in tre millilitri di mezzo per idrogel e consentire alle cellule di aderire a 37 gradi Celsius per quattro-18 ore.
Mentre le cellule sono equilibbranti, utilizzare un estrattore di micro-pipetta per tirare un diametro di un millimetro per micro-pipetta di vetro borosilicato lungo 100 millimetri, per ottenere un cono di oltre due millimetri che si riduce a circa 50 micrometri di diametro nel primo millimetro e si estende a un lungo tubo parallelo di 10 micrometri di diametro nell'ultimo millimetro. Quindi, caricare la pipetta in una microforgia e modellare la pipetta per avere una punta smussata di 15 micrometri che è racchiusa all'estremità di una sezione di 250 micrometri, piegata a circa 35 gradi angelo dal resto della pipetta. Il diametro approssimativo alla curva dovrebbe essere di circa 30 micrometri per dare resistenza alla punta.
Quindi, posizionare un Hydrogel sul palco di un microscopio invertito. Coprire il mezzo con olio minerale e selezionare l'obiettivo 10x. Sterilizzare la micro-pipetta preparata con il 70% di alcol.
Quindi, inserire nel supporto della micro-pipetta con il gancio puntato verso il piatto e utilizzare il manipolatore del corso per abbassare la pipetta fino a quando il gancio tocca solo la superficie del liquido. Focalizzare il microscopio sulle cellule aderenti alla parte superiore del gel e fare attenzione che l'obiettivo non sia in pericolo di colpire il campione o lo stadio, portare la messa a fuoco sopra il gel per trovare la punta della micro-pipetta. Ruotare la pipetta fino a quando la punta non è perpendicolare al piano focale, in modo che la punta smussata della micro-pipetta sia rivolta verso il basso e rifocalizzare sulla punta della pipetta, se necessario.
Tornate a fuoco verso il basso fino allo strato di cella per misurare quanto è lontana la pipetta dalla superficie del gel e tornate a fuoco fino a un piano che è a metà strada tra il gel e la punta della pipetta. Quindi, abbassare lentamente la pipetta per raggiungere il piano focale intermedio e aumentare l'ingrandimento a quello che verrà utilizzato nell'esperimento, prima di abbassare la pipetta fino a quando non si libra appena sopra la superficie dell'Idrogel. Per la calibrazione del micro manipolatore, immagini un'area priva di cellule, un'area con perline, ma nessuna manipolazione, con la pipetta che coinvolge il gel e con la pipetta impegnata che tira il gel.
Quindi, usa l'immagine J per confrontare i campi senza perline con i campi di perline senza impegno, i campi di perline con il gel inserito e il gel tirato per calcolare i relativi spostamenti delle perline e la forza applicata ai gel. Per condurre un test durotaxis, monitorare un gruppo di cellule per 30 minuti per identificare le cellule che si muovono in modo diretto. Selezionare una cella che si muove costantemente in una direzione e monitorare le celle della frequenza fotogrammi desiderata per altri 30 minuti.
Quindi, posizionare la pipetta di circa 50 micrometri davanti al lato vicino del bordo anteriore della cella selezionata e spostare il micro manipolatore in modo che il gel sia deformato ortogonalmente nella direzione di marcia della cella. Quindi, osservare la cellula nel tempo in quanto risponde al gradiente acuto e locale della rigidità dell'idrogel. Utilizzando questa tecnica come dimostrato, i fibroblasti embrionali di ratto si muovono verso l'aumento della rigidità nei gradienti applicati da una micro-pipetta di vetro.
Le cellule fibroblatrici embrionali del ratto, che esprimono transitoriamente il sensore di tensione della vinculina su gel di poliacrilammide di 125 kilopascal, dimostrano anche la formazione di aderenze focali nelle direzioni del tratto per un periodo di 40 minuti. L'analisi del trasferimento di energia a risonanza forstere rivela che la vinculina localizzata alle aderenze focali sperimenta un cambiamento immediato della tensione, quando viene presentata con una stimolazione durotattica acuta. Espandere l'utilità di questo saggio all'osservazione di eventi di segnalazione subcellulare, in risposta alla stimolazione durotattica.
Se si tentano più tentativi di allungare una cella o se la microrischia scivola durante il saggio, ricominciare con una nuova cella per evitare di impartire stimoli meccanici multipli, variabili. Oltre alla sua utilità per il dosaggio della durotassi, questa tecnica può essere combinata con approcci genetici, come biosensori, RNAI o editing genico per aiutare a delineare i meccanismi molecolari coinvolti nella meccanotraduzione.
