Questo lavoro è stato reso possibile da un finanziamento della Wellcome Trust. JM (080.964) e SCW (080.948) sono stati sostenuti dal Wellcome Trust borse e DT da una Malawi-Liverpool Wellcome Trust borsa di studio.

1. Raccolta dei campioni Le piastrine possono essere facilmente attivati ​​tramite temperatura, agitazione o di stoccaggio e quindi dovrebbero essere maneggiati con cura. L&#39;uso di vacutainer per raccogliere il sangue per la preparazione delle piastrine è inevitabile nella maggior parte delle situazioni cliniche, ma deve essere attentamente considerata come aspirazione può potenzialmente causare l&#39;attivazione piastrinica. Grazie al protocollo clinico utilizzato presso il nostro ospedale di ricerca, i nostri campioni sono raccolti con cura in sodio citrato vacutainer. Non abbiamo avuto alcun problema con precoce attivazione piastrinica in questo o in un nostro precedente studio 12. Raccogliamo il sangue per la preparazione delle piastrine dal gruppo sanguigno O + individui per ridurre al minimo non specifico gruppo sanguigno antigene aggregazione. I donatori non hanno assunto farmaci negli ultimi 7-10 giorni, come alcuni farmaci sono noti per influenzare la funzione piastrinica. 1.1 Preparazione di plasma ricco di piastrine (PRP) <ol><li> Raccogliere circa 5 mldi sangue intero da una malaria ospite ingenui o 2,5 ml di sangue da CM o malaria grave (SM) pazienti in citrato di sodio vacutainer (BD codice prodotto 36276). </li><li> Centrifugare il sangue intero a 250 xg per 10 min a temperatura ambiente. Non centrifugare a 4 ° C a basse temperature possono causare le piastrine ad aggregarsi. </li><li> Trasferire con cautela il surnatante nuvoloso in un tubo pulito 15 ml. Piastrine sono facilmente attivata da variazioni di temperatura e agli urti fisici e dovrebbero pertanto essere maneggiato con cura. Evitare di scuotere o di eventuali movimenti a scatti del tubo. </li><li> Utilizzare haematocytometer di un Neubauer per contare e regolare la sospensione piastrinica&gt; 300 x 10 3 piastrine / mL per i donatori sani e &lt;150 x 10 3 piastrine / mL da CM e pazienti SM con 1X tampone fosfato (pH 7.2-7.4; PBS). Assicurati di scegliere un alto fattore di diluizione per facilitare la conta piastrinica e garantirne l&#39;esattezza. </li></ol> Nota: Malaria patients hanno una conta piastrinica ridotta rispetto ai soggetti sani 16,17,18. Pertanto le concentrazioni di piastrine per CM e di messaggistica unificata vengono regolati secondo le conte medie piastrine per i pazienti all&#39;interno di ogni gruppo di diagnosi della malaria. Il P. falciparum fenotipo aggregazione è comune negli isolati di CM e mostra una forte affinità di legame, pertanto le concentrazioni di piastrine ridotto non incide dimensione ciuffo o la frequenza in quanto la concentrazione di piastrine è standardizzato per tutti i casi CM. 1.2 Preparazione di plasma povero di piastrine (PPP) <ol><li> Per ottenere PPP, centrifugare una porzione del PRP sopra ottenuto a 1500 xg per 10 min. La maggior parte delle piastrine sono pellettato sul fondo della provetta. </li><li> Sia il PRP e PPP possono essere conservati a 4 ° C per un massimo di due settimane. Idealmente, utilizzare le piastrine fresche per il saggio di aggregazione. Dopo 8-10 giorni la maggior parte delle piastrine sono suscettibili di essere inattivo e probabilmente aggregato. </li></ol> 2. Parasite Cultura <ol><li> Lavare i pellet pRBC tre volte con 5-10 ml RPMI 1640 per centrifugazione a 370 xg per 5 min. Nota: in questo protocollo di tutte le culture hanno iniziato da circa 1 ml ematocrito (PCV) e conservati al 5% di ematocrito. Le culture possono essere avviati con un PCV di pRBC e regolato di conseguenza, non infetto RBC e dei media per raggiungere ematocrito desiderato. </li><li> Posizionare il pRBC in un pallone cultura e supplemento con standard di coltura malaria di RPMI 1640 supplementato con HEPES 25 mm, 5% Albumax II o il 10% di siero e 40 mcg / ml di gentamicina per raggiungere un ematocrito 5%. </li><li> Permeato cultura palloni con una miscela del 92,5% di azoto, 2,5% di ossigeno e 5% di anidride carbonica prima di sigillare e incubando. In alternativa, può essere utilizzato il metodo di candela vaso a tenuta stagna di Trager-Jensen. </li><li> Per pRBC ottenuta direttamente dai pazienti, incubare loro pallone di coltura per 24-36 ore a 37 ° C in incubatore al 5% di CO 2 per ottenere parassiti maturi. NOTA: Mlaboratorio ost e linee di cultura-adattati sono molto facili da mantenere in coltura in condizioni standard. Esistono tecniche semplici descritte di seguito che possono essere utilizzati per sincronizzare diversi stadi di parassiti di mantenere il tasso di crescita. </li><li> Preparare uno striscio di sangue sottile come descritto di seguito e di esaminare la maturazione parassita al microscopio ottico. </li></ol> 3. Thin Film sangue Preparazione del vetrino <ol><li> Collocare circa 10-15 ml di sangue su una estremità di un vetrino di vetro smerigliato appoggiata su una superficie piana. </li><li> Toccare la goccia di sangue con il bordo di una seconda slitta finché il sangue sia uniforme il bordo della seconda slitta. </li><li> Mentre si tiene la seconda diapositiva a un angolo di 45 °, in modo rapido, ma con delicatezza, senza esercitare troppa pressione sulla prima diapositiva, fare scorrere il sangue in tutta la prima diapositiva di fare un film sottile di sangue che viene distribuito uniformemente. Aria secca. </li><li> Immergere il vetrino in metanolo per 10 sec. Aria secca. </li><li> Immergere il vetrino in 2% Giemsa stain per almeno 10 min. Sciacquare molto fino a quando l&#39;acqua è pulita. Aria secca. </li><li> Esaminare diapositiva utilizzando un 90-100x lente emulsione di olio su un microscopio ottico </li></ol> 4. Purificazione e sincronizzazione delle fasi asessuate La purificazione di una matura P. falciparum pRBC è un passo necessario per il saggio di aggregazione. Infatti, solo parassiti maturi sono in grado di legarsi ai recettori piastrinici come è in questa fase del ciclo di vita che i ligandi pertinenti sono espressi e sporgono dalla superficie degli eritrociti infetti. Ci sono diversi metodi per purificare e sincronizzare le fasi asessuali di P. falciparum: stadi asessuati tardivi possono essere arricchiti da Percoll gradiente 19; cellula magnetica ordinamento 20 o utilizzando il protocollo di gelatina di sedimentazione 21 qui descritto.. Sorbitolo-sincronizzazione seleziona per fasi anello 22, dopo di che gli anelli sono coltivate per 24-26 ore per ottenere stadi maturi (senza need eseguire flottazione gelatina). 4.1 Plasmagel flottazione Plasmagel galleggiamento usa soluzione di gelatina-come selezionare per peso inferiore knobbed eritrociti a rimanere in soluzione, mentre le forme ad anello dense e rosette si depositano sul fondo. Questa tecnica offre fino al 90% di purezza del maturo eritrociti stadio infette e può essere utilizzato sia per campo e isolati di laboratorio. Tuttavia, come accennato in precedenza, plasmagel galleggiamento rimuove pRBC rosette e stadi immaturi che potrebbe tradursi in una riduzione della frequenza di aggregazione nei campioni con una elevata frequenza di rosette. Tuttavia, l&#39;assenza del pRBC rosette dopo plasmagel galleggiamento non influisce sul saggio di aggregazione perché rosette è un&#39;interazione di eritrociti PRBC e non infetti, mentre aggregazione è pRBCs mediato vincolante dalle piastrine. Il ligando coinvolto in queste due caratteristiche è diverso, con il complemento principalmente recettore CR-1 su eritrociti non infetti mediazione rosette.<ol><li> Soluzione Gelofusine Preriscaldare e siero / Albumax media II-libera a 37 ° C in un bagno d&#39;acqua. </li><li> Trasferire la cultura ad un ambiente pulito sterile 15 ml di tubo e cellule pellet per centrifugazione a temperatura ambiente a 370 xg per 5 min. </li><li> Attenzione aspirare il surnatante in modo da non disturbare il pellet e risospendere le cellule in un volume uguale di Gelofusine medie e privo di proteine. </li><li> Trasferire miscela in una provetta sterile 15 ml e lasciare riposare per 15-20 minuti a 37 ° C incubatore o finché una chiara demarcazione rilevabile da un livello superiore e inferiore. </li><li> Trasferire con cautela lo strato superiore di un nuovo tubo sterile 15 ml e aggiungere 10 ml di RPMI fresca. </li><li> Centrifugare a 370 xg per 5 minuti e con attenzione scartare il surnatante. </li><li> Valutare fase parassitemia e di sviluppo da sottile striscio di sangue ed esaminare al microscopio ottico come descritto nella sezione 4. </li></ol> NOTA: Mature gamma pRBC tra il 60-90% degli eritrociti infetti depending sul parassitemia iniziale della cultura. Per l&#39;alta percentuale di parassiti maturi, utilizzare le culture con una parassitemia iniziale di ≥ 10%. 5. Aggregazione Assay <ol><li> Utilizzare haematocytometer di un Neubauer per contare e regolare la sospensione pRBC ottenuto dopo flottazione plasmagel a 1 x 10 8 pRBC / ml. </li><li> In una nuova provetta 1,5 ml, risospendere pRBC al 5% ematocrito, arancio acridina a 20 ug / ml concentrazione finale e PRP a 10% del volume totale. Invece di arancio di acridina, colture parassiti possono essere colorati con 25 ug / ml di bromuro di etidio per 5 minuti prima dell&#39;uso. Ad esempio per un mix di reazione 200 microlitri, aggiungere 10 microlitri pRBC maturo, 20 l di 300 x 10 3 piastrine / ml per PRP da donatori sani o 150 x 10 3 piastrine / mL da pazienti SM e 170 ml di medio privo di proteine. NOTA: Il rapporto di piastrine: PRBC nelle reazioni finali è 20:1. Questo è importante in quanto si consente la massimaum frequenza aggregazione di un campione da determinare. Se un minor numero di piastrine vengono aggiunti nei controlli non poi tutti pRBCs clumping potrebbero avere la possibilità di ciuffo. </li><li> Nello stesso modo preparare i seguenti comandi; globuli rossi non infetti e PRP e pRBC con PPP per accertare il ruolo di piastrine nel pRBCs agglomerante. </li><li> Trasferire la sospensione in un flacone ml conica 1.5-2.0 coperchio a vite. </li><li> Porre la fiala sotto leggera agitazione per laminazione a 10-12 rpm a temperatura ambiente. </li><li> Verificare la presenza di formazione ciuffo da un wet-slide preparate: prelevare 10 ml di pRBC ± mix piastrinica su un vetrino, coprire con scivolare un bicchiere ed esaminare sotto fluorescenza. </li><li> Campionamento può essere fatto a intervalli di 15-20 min per un totale di 120 min. Un ciuffo è considerato come un aggregato di tre o più eritrociti infetti. </li></ol>

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Abbiamo descritto un saggio aggregazione piastrinica mediata usato per studiare pRBC in isolati clinici direttamente in campo. Aggregazione piastrinica mediata, un comportamento caratteristico in P. isolati clinici falciparum, è stato identificato come un fenotipo distinto adesivo, frequenti negli isolati CD36 vincolanti 12,23-24. Abbiamo usato questo test per identificare i tre punti principali: 1) una forte aggregazione in vitro fenotipo di P. falciparum isolato dai bambini del Malawi che è associato con la gravità della malattia e la diagnosi 2) nuovo recettore P-selectina mediaties clumping sulle piastrine insieme a CD36, 3) il grado di trombocitopenia presenti in pazienti con CM è sufficiente limitare l&#39;ulteriore formazione di grumi PRBC in vitro 12. Il coinvolgimento delle piastrine in formazione ciuffo è dimostrata esaminando una preparazione umido-slide come descritto nel capitolo 6. Le piastrine possono essere isolati da PRP per centrifugazione a velocità elevateal fine di minimizzare reazioni antigenici gruppi sanguigni, tuttavia, abbiamo utilizzato tutta PRP per minimizzare prematura attivazione piastrinica da movimenti eccessivi e dalla centrifugazione ad alta velocità. Attività delle piastrine può essere misurata mediante test di aggregazione piastrinica mediante deboli agonisti piastrinici, epinefrina o adenosina difosfato (ADP) 25 come descritto in 26. Ci sono diversi aspetti del test che sono stati in precedenza scarsamente caratterizzati, uno dei quali è l&#39;importanza di selezionare fonti PRP e l&#39;effetto dei gruppi di antigeni del sangue sul risultato del test. Abbiamo preparato PRP da individui che erano il gruppo sanguigno O + e non aveva preso alcun farmaco negli ultimi 7-10 giorni prima che il sangue viene prelevato da alcuni farmaci possono influenzare il comportamento delle piastrine. Altri fattori che possono influenzare la formazione di grumi di successo includono pRBC ematocrito, i livelli di parassitemia e la durata del test aggregazione. Utilizzando ematocrito alto e co piastriniciunt sarebbe difficile dire se il cluster è veramente un ciuffo o se troppe cellule sono semplicemente seduti insieme perché sono densamente 15. Aggregazione anche generalmente aumenta con tempi di incubazione più lunghi. Questi sono tutti utili linee guida che devono essere considerati durante la progettazione di studi di grumi. Troviamo che i campioni provenienti da diversi gruppi clinici possono essere analizzati in parallelo utilizzando PRP dallo stesso donatore se è possibile farlo, ma in contesti di risorse limitate, come i siti di campo la piscina trasfusione è generalmente limitato. È quindi difficile avere un singolo donatore O + per standardizzare i saggi. Abbiamo quindi identificato diverse O + donatori per garantire la compatibilità di gruppo sanguigno, ove possibile. L&#39;utilizzo di più donatori è utile anche in caso di grandi campioni di dimensioni in modo tale onere della donazione di sangue non dovesse cadere in un solo individuo. Punti di campionamento nei 15-20 minuti sono molto più fattibile se un singolo person sta conducendo le analisi, consentendo per i preparati wet-scivolo e l&#39;esecuzione di analisi cinetica senza tempi di campionamento che si sovrappongono. Maggior parte dei dati microscopico è visivo e alquanto oggettivo, quindi, è importante che il conteggio delle cellule è verificato da più di una persona. In quel caso, la manipolazione di un campione alla volta può permettere un&#39;analisi completa di tre-quattro campioni al giorno a seconda dell&#39;efficienza personale. Agglomerante piastrinica mediata può essere eseguita utilizzando sia clinici di laboratorio e isolati. Per le linee di laboratorio, si consiglia di CD36 parassiti vincolanti sono utilizzati per ottimizzare le frequenze grumi. Il dosaggio può essere accoppiato con altri test di agglutinazione quali rosette o utilizzato in saggi di inibizione aggregazione che consentano lo studio dei recettori sulle piastrine che possono mediare vincolante pRBC, un aspetto poco compreso ed esaminato di questo fenotipo.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RPMI 1640</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>21870-092</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Acridine orange</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>A3568</td>
 <td>10 mg/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gelofusine</td>
 <td>B Braun</td>
 <td>Gelofusine</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1 M HEPES</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>15630</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gentamycin</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>15750045</td>
 <td>50 mg/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Albumax</td>
 <td>GIBCO</td>
 <td>1102-037</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium citrate vacutainer</td>
 <td>BD</td>
 <td>362760</td>
 <td>4 ml capacity</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Inverted Microscope</td>
 <td>Leica</td>
 <td>MD16000 B</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fluorescent microscope</td>
 <td>Leica</td>
 <td>EL6000</td>
 <td>Contains blue and green light fluorescent filters for acridine orange and ethidium bromide </td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

a simple protocol for platelet-mediated clumping of plasmodium falciparum-infected erythrocytes in a resource poor setting

P. falciparum causa la maggior parte dei gravi infezioni malariche. I meccanismi fisiopatologici alla base malaria cerebrale (CM) non sono pienamente compresi e diverse ipotesi sono state avanzate, tra cui ostruzione meccanica dei microvasi di P. globuli rossi falciparum-parassitati (pRBC). Infatti, durante la fase intra-eritrocitaria del suo ciclo di vita, P. falciparum ha la capacità unica di modificare la superficie del eritrociti infetto esportando antigeni di superficie con diverse proprietà adesive sulla membrana RBC. Questo permette al sequestro di pRBC in molteplici tessuti e organi per adesione alle cellule endoteliali che rivestono il microcircolo delle venule post-capillari 1. Così facendo, le forme mature del parassita evitano liquidazione splenica degli eritrociti infetti deformata 2 e limitano il loro ambiente per una più favorevole bassa pressione di ossigeno 3. Come conseguenza di questa SEQUESTrazione, è solo parassiti asessuati immaturi e gametociti che possono essere rilevati nel sangue periferico. Cytoadherence e sequestro di pRBC maturo ai numerosi recettori ospitanti espressi su letti microvascolari si verifica nella malattia grave e senza complicazioni. Tuttavia, diverse linee di evidenza suggeriscono che solo fenotipi adesive specifiche sono suscettibili di essere associati con esiti patologici gravi di malaria. Un esempio di tali specifiche interazioni ospite-parassita è stata dimostrata in vitro, in cui la capacità della molecola di adesione intercellulare-1 per supportare legame di pRBC con particolari proprietà adesive è stato collegato allo sviluppo di malaria cerebrale 4,5. La placenta è stato riconosciuto anche come sito preferenziale di accumulo pRBC nelle donne in gravidanza con infezione da malaria, con Chondrotin solfato Un espresso in sinciziotrofoblasti quella linea spazio intervilloso placentare come il principale recettore 6. Rosette di pRBC teritrociti non infetti o attraverso il recettore del complemento a 1 (CD35) 7,8 è stata anche associata con grave malattia 9. Uno dei più recentemente descritta P. falciparum fenotipi cytoadherence è la capacità del pRBC per formare grumi piastrinica in vitro mediata. La formazione di tali ciuffi pRBC richiede CD36, una glicoproteina espressa sulla superficie delle piastrine. Altro recettore umano, gC1qR/HABP1/p32, espressa su diversi tipi cellulari, comprese le cellule endoteliali e piastrine, è stato anche dimostrato per facilitare l&#39;adesione pRBC su piastrine per formare grumi 10. Se invece ciò avvenga in vivo è ancora chiaro, ma potrebbe spiegare la notevole accumulo di piastrine descritte nel microcircolo cerebrale dei bambini del Malawi che sono morti da cm 11. Inoltre, la capacità del clinico di isolare le colture a raggrupparsi in vitro era direttamente legata alla gravità della malattia in Malawi 12 </sup&gt; E pazienti del Mozambico 13, (anche se non in Mali 14). Con diversi aspetti del fenotipo aggregazione pRBC poco caratterizzato, studi in corso su questo argomento non hanno seguito una procedura standardizzata. Questo è un tema importante per la nota alta variabilità insita nel test 15. Qui vi presentiamo un metodo per l&#39;aggregazione piastrinica in vitro mediata da P. falciparum con la speranza che possa fornire una piattaforma per un metodo coerente per altri gruppi e aumentare la consapevolezza dei limiti di indagare questo fenotipo in studi futuri. Essendo basato in Malawi, forniamo un protocollo specifico per un ambiente risorsa limitata, con il vantaggio che gli isolati clinici di fresco raccolti possono essere esaminati per fenotipo senza necessità di crioconservazione.

Un esempio di un saggio ciuffo piastrine mediata utilizzando circa il 70% stadi maturi di P. falciparum dopo arricchimento da plasmagel flottazione è mostrato in Figura 2. Un ciuffo è un aggregato di tre o più eritrociti infetti. Colorazione con arancio di acridina o etidio bromuro può essere visualizzato mediante microscopia a fluorescenza. Arancio di acridina è spettralmente simile a fluoresceina, con un massimo di eccitazione a 502 nm e un massimo di emissione a 525 nm (verde), mentre etidio bromuro ha un massimo di eccitazione a 493 nm e un massimo di emissione a 620 nm (simile a tinture rodamina, rosso ). Ciuffi si individuano agevolmente al microscopio a luce normale come essi appaiono come aggregati di cellule e sotto fluorescenza come macchie di verde o rosso quando colorato con arancio di acridina o etidio bromuro coloranti, rispettivamente, come mostrato in Figura 2 (punto 30 tempo min utilizzando arancio di acridina ). Più grandi sono i grumi, il più grande aggregato cellulare appare ONUder normale luce e la più grande delle macchie di sotto verde o rosso fluorescenti per i rispettivi coloranti. Dal momento che l&#39;obiettivo di coloranti DNA e quindi i nuclei macchia, piastrine e globuli rossi infetti non vengono rilevate al microscopio a fluorescenza a causa della loro mancanza di nuclei. Formazione casuale di piccoli ciuffi PRBC di 4,7 ± 1,6 pRBCs / ciuffo si verificano dopo 30 min. La dimensione ciuffo aumenta significativamente a una media di&gt; 15 PRBC / ciuffi dopo incubazione per 120 minuti con alcuni ciuffi contenenti numerosi pRBC / ciuffo che non poteva essere contato visivo. La frequenza del fenotipo agglomerante è calcolato come numero di cellule infette presenti in ciuffi / 1000 cellule infette, contati in saggi duplicati. <img alt="Figura 1" fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/4316/4316fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4316/4316fig1.jpg" /> Figura 1. Il flusso di lavoro per l&#39;aggregazione esperimento. Platelet rICH e plasma povero (A) e un P. cultura eritrociti falciparum infetto (B) vengono preparati e poi combinati per il saggio aggregazione (C). <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4316/4316fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4316/4316fig2.jpg" /> Figura 2. Aggregazione di eritrociti infettati da P. laboratorio falciparum isolare. Ciuffi formate da HB3 al tempo 0, 30 e 120 minuti nel plasma ricco di piastrine (A) e scarsa ciuffo in plasma povero di piastrine (B). Limitazioni del test Ci sono limitazioni che incidono specificamente la funzione piastrinica o influenza il risultato e la maggior parte di questi sono già stati evidenziati da Arman e Rowe 15. Qui citiamo alcuni dei potenziali problemi che si possono incontrare a different fasi del test: <ol><li> Adattando isolati clinici di coltura in vitro può essere una sfida come talvolta lunghi periodi di coltura sono necessari per conseguire parassitemia alta abbastanza da permettere la formazione di grumi. Con alti tassi di variazione antigenica in P. falciparum, il fenotipo adesivo della cultura-adattato parassita potrebbe non rispecchiare l&#39;originale popolazione infettando parassita dopo tempi prolungati in coltura. </li><li> Per evitare agglutinazione aspecifica causa antigeni dei gruppi sanguigni, donatori di piastrine devono corrispondere per l&#39;antigene di gruppo sanguigno con isolati clinici utilizzati nello stesso saggio, o il donatore di gruppo sanguigno universale antigene O-utilizzata. Tuttavia, le persone con gruppo sanguigno O-sono rari in siti africani come il Malawi e quindi le piastrine comunemente utilizzati sono ottenuti da sangue di gruppo O + donatori e devono essere abbinati per gruppo sanguigno. </li><li> Contando ciuffi su una preparazione del vetrino bagnato è ingombrante e impegnativo per la cattura delle immagini, come la cells sono in costante movimento. Di solito, pRBC accumulano sui bordi del vetrino o tendono a stare insieme formando grumi &quot;falsi&quot; che possono essere facilmente confusi con ciuffi reali. Per ridurre movimento cella, consentire alle cellule sedimentare per 15 minuti a temperatura ambiente prima dell&#39;analisi. </li><li> Il saggio di aggregazione è time-sensitive e quindi permette un solo campione da analizzare a persona alla volta per una precisione ottimale. Campionamento punti di tempo per due differenti campioni può facilmente sovrapporsi, causando non corrispondenti punti di tempo di campionamento tra campioni manipolzione più di un campione allo stesso tempo. In tali circostanze, un sofisticato software quantitativo potrebbe calcolare le dimensioni ciuffo o anticorpi in alternativa cellula-specifici potrebbe essere utilizzato per analizzare la composizione dei grumi. Mentre queste tecniche potrebbero migliorare notevolmente la significatività dei dati, in contesti poveri di risorse in cui questo test è suscettibile di essere utilizzato, tali tecniche e le attrezzature non sono facilmente disponibili. </li></ol>

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A Simple Protocol for Platelet-mediated Clumping of Plasmodium falciparum-infected Erythrocytes in a Resource Poor Setting

Questo metodo indaga la piastrinica mediata fenotipo aggregazione di<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-Infetti eritrociti (pRBC) in isolati clinici. Ciò avviene isolando e co-incubando plasma ricco di piastrine e una sospensione di pRBC.

Un semplice protocollo per Clumping piastrinica mediata da<em&gt; Plasmodium falciparum</emEritrociti&gt; infette in una risorsa Povero Setting

P. falciparum causes the majority of severe malarial infections. The pathophysiological mechanisms underlying cerebral malaria (CM) are not fully ...

a-simple-protocol-for-platelet-mediated-clumping-plasmodium

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Simple Protocol for Platelet-mediated Clumping of Plasmodium falciparum-infected Erythrocytes in a Resource Poor Setting

18.6K Views.  Malawi-Liverpool-Wellcome Trust Clinical Research Programme. Questo metodo indaga la piastrinica mediata fenotipo aggregazione di Plasmodium falciparum-Infetti eritrociti (pRBC) in isolati clinici. Ciò avviene isolando e co-incubando plasma ricco di piastrine e una sospensione di pRBC.

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Protocol for Production of a Genetic Cross of the Rodent Malaria Parasites

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to successful identification of genes or loci underlying various traits in malaria parasites of rodents1-3 and humans4-6. The malaria parasite Plasmodium yoelii is one of many malaria species isolated from wild African rodents and has been adapted to grow in laboratories. This species reproduces many of the biologic characteristics of the human malaria parasites; genetic markers such as microsatellite and amplified fragment length polymorphism (AFLP) markers have also been developed for the parasite7-9. Thus, genetic studies in rodent malaria parasites can be performed to complement research on Plasmodium falciparum. Here, we demonstrate the techniques for producing a genetic cross in P. yoelii that were first pioneered by Drs. David Walliker, Richard Carter, and colleagues at the University of Edinburgh10.

Genetic crosses in P. yoelii and other rodent malaria parasites are conducted by infecting mice Mus musculus with an inoculum containing gametocytes of two genetically distinct clones that differ in phenotypes of interest and by allowing mosquitoes to feed on the infected mice 4 days after infection. The presence of male and female gametocytes in the mouse blood is microscopically confirmed before feeding. Within 48 hrs after feeding, in the midgut of the mosquito, the haploid gametocytes differentiate into male and female gametes, fertilize, and form a diploid zygote (Fig. 1). During development of a zygote into an ookinete, meiosis appears to occur11. If the zygote is derived through cross-fertilization between gametes of the two genetically distinct parasites, genetic exchanges (chromosomal reassortment and cross-overs between the non-sister chromatids of a pair of homologous chromosomes; Fig. 2) may occur, resulting in recombination of genetic material at homologous loci. Each zygote undergoes two successive nuclear divisions, leading to four haploid nuclei. An ookinete further develops into an oocyst. Once the oocyst matures, thousands of sporozoites (the progeny of the cross) are formed and released into mosquito hemoceal. Sporozoites are harvested from the salivary glands and injected into a new murine host, where pre-erythrocytic and erythrocytic stage development takes place. Erythrocytic forms are cloned and classified with regard to the characters distinguishing the parental lines prior to genetic linkage mapping. Control infections of individual parental clones are performed in the same way as the production of a genetic cross.

Genetic crosses of rodent malaria parasites are performed by feeding two genetically distinct parasites to mosquitoes. Recombinant progeny are cloned from mouse blood after allowing mosquitoes to bite infected mice. This video shows how to produce genetic crosses of Plasmodium yoelii and is applicable to other rodent malaria parasites.

Protocollo per la produzione di un incrocio fra i roditori parassiti della malaria

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her viral population uses the CCR5 coreceptor for cellular entry, and not an alternative coreceptor. One approach to tropism testing is to examine the sequence of the V3 region of the HIV envelope, which interacts with the coreceptor.
Methods: Viral RNA is extracted from blood plasma. The V3 region is amplified in triplicate with nested reverse transcriptase-PCR. The amplifications are then sequenced and analyzed using the software, RE_Call. Sequences are then submitted to a bioinformatic algorithm such as geno2pheno to infer viral tropism from the V3 region. Sequences are inferred to be non-R5 if their geno2pheno false positive rate falls below 5.75%. If any one of the three sequences from a sample is inferred to be non-R5, the patient is unlikely to respond to a CCR5-antagonist.

HIV tropism can be inferred from the V3 region of the viral envelope. V3 is PCR amplified in triplicate using nested RT-PCR, sequenced, and interpreted using bioinformatic software. Samples with with 1 or more sequence(s) with low g2P scores are classified as non-R5 virus.

Inferenza genotipica del virus HIV-1 Tropismo utilizzo basati sulla popolazione sequenziamento del V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

Mosquitoes are vectors for a number of disease-causing pathogens such as the yellow fever virus, malaria parasites and filarial worms. Laboratories are investigating anti-pathogen components of the innate immune system in disease vector species in the hopes of generating transgenic mosquitoes that are refractory to such pathogens1, 2. The innate immune system of mosquitoes consists of several lines of defense 3. Pathogens that manage to escape the barrier imposed by the epithelium-lined mosquito midgut 4 enter the hemolymph and encounter circulating hemocytes, important cellular components that encapsulate and engulf pathogens 5, 6. Researchers have not found evidence for hematopoietic tissues in mosquitoes and current evidence suggests that the number of hemocytes is fixed at adult emergence and numbers may actually decline as the mosquito ages 7. The ability to properly collect and identify hemocytes from medically important insects is an essential step for studies in cellular immunity. However, the small size of mosquitoes and the limited volume of hemolymph pose a challenge to collecting immune cells. 
Two established methods for collecting mosquito hemocytes include expulsion of hemolymph from a cut proboscis 8, and volume displacement (perfusion), in which saline is injected into the membranous necklike region between the head and thorax (i.e., cervix) and the perfused hemolymph is collected from a torn opening in a distal region of the abdomen 9, 10. These techniques, however, are limited by low recovery of hemocytes and possible contamination by fat body cells, respectively 11. More recently a method referred to as high injection/recovery improved recovery of immunocytes by use of anticoagulant buffers while reducing levels of contaminating scales and internal tissues 11. While that method allows for an improved method of collecting and maintaining hemocytes for primary culture, it entails a number of injection and collecting steps that are not necessary if the downstream goal is to collect, fix and stain hemocytes for diagnostics. Here, we demonstrate our method of collecting mosquito hemolymph that combines the simplicity of perfusion, using anticoagulant buffers in place of saline solution, with the accuracy of high injection techniques to isolate clean preparations of hemocytes in Aedes mosquitoes.

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

A simplified yet accurate method to collect and stain mosquito hemocytes is described. Our method combines the simplicity of perfusion with the accuracy of high injection techniques to isolate clean preparations of hemocytes in Aedes mosquitoes. This method facilitates studies requiring knowledge of the types of hemocytes and their abundance.

Un protocollo per la raccolta e la colorazione ematociti concentrati dal Mosquito febbre gialla Aedes aegypti</em

 Mosquitoes are vectors for a number  of disease-causing pathogens such as the yellow fever virus, malaria parasites  and filarial worms. Laboratories are ...

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and vector mosquitoes, as an integral part of their control programs1,2,3,4,5. For sustainable establishment of these accurate approaches in operations research to strengthen malaria control and elimination efforts, simple and affordable methods, with parsimonious reagent and equipment requirements are essential6,7,8. Here we present a simple Chelex-based technique for extracting malaria parasite and vector DNA from field collected mosquito specimens.
We morphologically identified 72 Anopheles gambiae sl. from 156 mosquitoes captured by pyrethrum spray catches in sleeping rooms of households within a 2,000 km2 vicinity of the Malaria Institute at Macha. After dissection to separate the head and thorax from the abdomen for all 72 Anopheles gambiae sl. mosquitoes, the two sections were individually placed in 1.5 ml microcentrifuge tubes and submerged in 20 &mu;l of deionized water. Using a sterile pipette tip, each mosquito section was separately homogenized to a uniform suspension in the deionized water. Of the ensuing homogenate from each mosquito section, 10 &mu;l was retained while the other 10 &mu;l was transferred to a separate autoclaved 1.5 ml tube. The separate aliquots were subjected to DNA extraction by either the simplified Chelex or the standard salting out extraction protocol9,10. The salting out protocol is so-called and widely used because it employs high salt concentrations in lieu of hazardous organic solvents (such as phenol and chloroform) for the protein precipitation step during DNA extraction9.
Extracts were used as templates for PCR amplification using primers targeting arthropod mitochondrial nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase (NADH) subunit 4 gene (ND4) to check DNA quality11, a PCR for identification of Anopheles gambiae sibling species10 and a nested PCR for typing of Plasmodium falciparum infection12. Comparison using DNA quality (ND4) PCR showed 93% sensitivity and 82% specificity for the Chelex approach relative to the established salting out protocol. Corresponding values of sensitivity and specificity were 100% and 78%, respectively, using sibling species identification PCR and 92% and 80%, respectively for P. falciparum detection PCR. There were no significant differences in proportion of samples giving amplicon signal with the Chelex or the regular salting out protocol across all three PCR applications. The Chelex approach required three simple reagents and 37 min to complete, while the salting out protocol entailed 10 different reagents and 2 hr and 47 min' processing time, including an overnight step. Our results show that the Chelex method is comparable to the existing salting out extraction and can be substituted as a simple and sustainable approach in resource-limited settings where a constant reagent supply chain is often difficult to maintain.

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

A rapid and affordable way to extract quality malaria parasite and vector DNA from mosquito specimens is described. Capitalizing on chelating properties of Chelex resin, the simple method enables genotyping of malaria parasites in mosquito mid-gut and salivary gland phases, as well as molecular identification of the Anopheles sibling species by PCR.

Un protocollo Chelex semplice per l&#39;estrazione del DNA da<em&gt; Anopheles</em&gt; Spp.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for  efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and  vector ...

Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means

Unlike other Plasmodium species, P. falciparum can be cultured in the lab, which facilitates its study 1. While the parasitemia achieved can reach the &asymp;40% limit, the investigator usually keeps the percentage at around 10%. In many cases it is necessary to isolate the parasite-containing red blood cells (RBCs) from the uninfected ones, to enrich the culture and proceed with a given experiment. 
When P. falciparum infects the erythrocyte, the parasite degrades and feeds from haemoglobin 2, 3. However, the parasite must deal with a very toxic iron-containing haem moiety 4, 5. The parasite eludes its toxicity by transforming the haem into an inert crystal polymer called haemozoin 6, 7. This iron-containing molecule is stored in its food vacuole and the metal in it has an oxidative state which differs from the one in haem 8. The ferric state of iron in the haemozoin confers on it a paramagnetic property absent in uninfected erythrocytes. As the invading parasite reaches maturity, the content of haemozoin also increases 9, which bestows even more paramagnetism on the latest stages of P. falciparum inside the erythrocyte.
Based on this paramagnetic property, the latest stages of P. falciparum infected-red blood cells can be separated by passing the culture through a column containing magnetic beads. These beads become magnetic when the columns containing them are placed on a magnet holder. Infected RBCs, due to their paramagnetism, will then be trapped inside the column, while the flow-through will contain, for the most part, uninfected erythrocytes and those containing early stages of the parasite.
Here, we describe the methodology to enrich the population of late stage parasites with magnetic columns, which maintains good parasite viability 10. After performing this procedure, the unattached culture can be returned to an incubator to allow the remaining parasites to continue growing.

Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means

The paramagnetic properties of hemozoin are used to isolate late stages of Plasmodium falciparum-infected red blood cells growing in culture. The method is simple and fast and does not affect the subsequent invasive capabilities of the parasites.

Separazione dei<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Fine Stage-eritrociti infettati da mezzi magnetici

Unlike other Plasmodium species, P. falciparum can be cultured in the lab, which facilitates its study 1. While the parasitemia achieved can reach the ...

A Protocol for Analyzing Hepatitis C Virus Replication

Hepatitis C Virus (HCV) affects 3% of the world&#8217;s population and causes serious liver ailments including&#160;chronic hepatitis, cirrhosis, and hepatocellular carcinoma. HCV is an enveloped RNA virus belonging to the family Flaviviridae. Current treatment is not fully effective and causes adverse side effects. There is no HCV vaccine available. Thus, continued effort is required for developing a vaccine and better therapy. An HCV cell culture system is critical for studying various stages of HCV growth including viral entry, genome replication, packaging, and egress. In the current procedure presented, we used a wild-type intragenotype 2a chimeric virus, FNX-HCV, and a recombinant FNX-Rluc virus carrying a Renilla luciferase reporter gene to study the virus replication. A human hepatoma cell line (Huh-7 based) was used for transfection of in vitro transcribed HCV genomic RNAs. Cell-free culture supernatants, protein lysates and total RNA were harvested at various time points post-transfection to assess HCV growth. HCV genome replication status was evaluated by quantitative RT-PCR and visualizing the presence of HCV double-stranded RNA. The HCV protein expression was verified by Western blot and immunofluorescence assays using antibodies specific for HCV NS3 and NS5A proteins. HCV RNA transfected cells released infectious particles into culture supernatant and the viral titer was measured. Luciferase assays were utilized to assess the replication level and infectivity of reporter HCV. In conclusion, we present various virological assays for characterizing different stages of the HCV replication cycle.

Hepatitis C Virus (HCV) is a major human pathogen that causes liver disorders, including cirrhosis and cancer. An HCV infectious cell culture system is essential for understanding the molecular mechanism of HCV replication and developing new therapeutic approaches. Here we describe a protocol to investigate various stages of the HCV replication cycle.

Un protocollo per l&#39;analisi dell&#39;epatite C replicazione del virus

Hepatitis C Virus (HCV) affects 3% of the world&#8217;s population and causes serious liver ailments including&#160;chronic hepatitis, cirrhosis, and ...

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of free merozoites from the blood by phagocytic cells. However assessing the functional efficacy of merozoite specific opsonizing antibodies is challenging due to the short half-life of merozoites and the variability of primary phagocytic cells. Described in detail herein is a method for generating viable merozoites using the E64 protease inhibitor, and an assay of merozoite opsonin-dependent phagocytosis using the pro-monocytic cell line THP-1. E64 prevents schizont rupture while allowing the development of merozoites which are released by filtration of treated schizonts. &#160;Ethidium bromide labelled merozoites are opsonized with human plasma samples and added to THP-1 cells. Phagocytosis is assessed by a standardized high throughput protocol. Viable merozoites are a valuable resource for assessing numerous aspects of P. falciparum biology, including assessment of immune function. Antibody levels measured by this assay are associated with clinical immunity to malaria in naturally exposed individuals. The assay may also be of use for assessing vaccine induced antibodies. &#160;

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

Measuring antibody function is key to understanding immunity to Plasmodium falciparum malaria. This method describes the purification of viable merozoites, and measurement of opsonization-dependent phagocytosis by flow cytometry.

High Yield Purificazione di<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Merozoiti Per l&#39;uso in opsonizzante anticorpo saggi

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of ...

A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted as an important hallmark of cancer. Our research on breast cancer focuses on the active role that tumor infiltrating lymphocytes play in tumor progression and patient outcome. Toward this goal, we developed a methodology for the rapid isolation of intact lymphoid cells from normal and abnormal tissues in an effort to evaluate them proximate to their native state. Homogenates prepared using a mechanical dissociator show both increased viability and cell recovery while preserving surface receptor expression compared to enzyme-digested tissues. Furthermore, enzymatic digestion of the remaining insoluble material did not recover additional CD45+ cells indicating that quantitative and qualitative measurements in the primary homogenate likely genuinely reflect infiltrating subpopulations in the tissue fragment. The lymphoid cells in these homogenates can be easily characterized using immunological (phenotype, proliferation, etc.) or molecular (DNA, RNA and/or protein) approaches. CD45+ cells can also be used for subpopulation purification, in vitro expansion or cryopreservation. An additional benefit of this approach is that the primary tissue supernatant from the homogenates can be used to characterize and compare cytokines, chemokines, immunoglobulins and antigens present in normal and malignant tissues. This protocol functions extremely well for human breast tissues and should be applicable to a wide variety of normal and abnormal tissues.

This protocol describes the rapid non-enzymatic dissociation of fresh human tissue fragments for qualitative and quantitative assessment of CD45+ cells (lymphocytes/leukocytes) present in various normal and malignant human tissues. Additionally, the supernatant obtained from the primary tissue homogenate can be collected and stored for further analysis or experimentation.

Un semplice e rapido protocollo non-enzimaticamente dissociare freschi tessuti umani per l&#39;analisi di linfociti infiltranti

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted ...

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

The genetic variation responsible for the sickle cell allele (HbS) enables erythrocytes to resist infection by the malaria parasite, P. falciparum. The molecular basis of this resistance, which is known to be multifactorial, remains incompletely understood. Recent studies found that the differential expression of erythrocyte microRNAs, once translocated into malaria parasites, affect both gene regulation and parasite growth. These miRNAs were later shown to inhibit mRNA translation by forming a chimeric RNA transcript via 5&#39; RNA fusion with discreet subsets of parasite mRNAs. Here, the techniques that were used to study the functional role and putative mechanism underlying erythrocyte microRNAs on the gene regulation and translational potential of P. falciparum, including the transfection of modified synthetic microRNAs into host erythrocytes, will be detailed.&#160; Finally, a polysome gradient method is used to determine the extent of translation of these transcripts. Together, these techniques allowed us to demonstrate that the dysregulated levels of erythrocyte microRNAs contribute to cell-intrinsic malaria resistance of sickle erythrocytes.

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

Human microRNAs translocate from host erythrocytes to Plasmodium falciparum parasites. Here, the techniques used to transfect synthetic microRNAs into host erythrocytes and isolate all RNAs from P. falciparum are described. In addition, this paper will detail a method of polysome isolation in P. falciparum to determine the ribosomal occupancy and translational potential of parasite transcripts.

Metodi per studiare il ruolo di regolamentazione dei piccoli RNA ribosomiale e di occupazione<em&gt; Plasmodium falciparum</em

The genetic variation responsible for the sickle cell allele (HbS) enables erythrocytes to resist infection by the malaria parasite, P. falciparum. The ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been successfully employed for editing genomes of various organisms. Here we describe a protocol for editing the vaccinia virus (VV) genome in the cytoplasm of VV-infected CV-1 cells using the RNA-guided Cas9. RNA-guided Cas9 induces double-stranded DNA breaks facilitating homologous recombination efficiently and specifically in the targeted site of VV and a transgene can be incorporated into these sites by homologous recombination. By using a site-specific homologous vector with transgene(s), a N1L gene-deleted VV with the red fluorescence protein (RFP) gene incorporated in this region was generated with a successful recombination efficiency 10 times greater than that obtained from the conventional homologous recombination method. This protocol demonstrates successful use of RNA-guided Cas9 system to generate mutant VVs with enhanced efficiency.

Vaccinia virus (VV) has been widely used in biomedical research and the improvement of human health. This article describes a simple, highly efficient method to edit the VV genome using a CRISPR-Cas9 system.