Questa metodologia di analisi, è un importante progresso nella conoscenza dell'immunità cellulare contro la malaria in fase ematica, contribuendo a scoprire nuovi obiettivi terapeutici e ad accelerare il progresso del vaccino contro la malaria. L'istituzione di un saggio in vitro del plasmodio che può essere utilizzato per campioni umani o animali è prezioso per una migliore comprensione della patogenesi della malaria. L'immunità protettiva alla malaria non è completamente compresa.
Per lo sviluppo di nuove terapie, è essenziale esplorare i meccanismi di immunità cellulare allo stadio parassitario della malaria. A dimostrare la procedura saremo io, Luna de Lacerda e Christopher Gomes, uno studente universitario del laboratorio di Caroline. Per iniziare, aspirare 100 microlitri di soluzione di eparina in una siringa da un millilitro con un ago da 26 gauge.
Posizionare il mouse su un lato e inserire perpendicolarmente l'ago appena sotto il gomito, attraverso le costole e nel cuore. Estrarre lentamente lo stantuffo della siringa e ruotare l'ago fino ad ottenere da 0,5 a un millilitro di sangue. Pulire asetticamente il lato sinistro del mouse con etanolo al 70%.
Con le forbici chirurgiche, fai un taglio sul lato sinistro del mouse, passando attraverso la pelle e il peritoneo. Individua la milza e rimuovila. Posizionare la milza del topo in una capsula di Petri con cinque millilitri di mezzo completo per purificare la popolazione di cellule effettrici desiderata.
Posizionare un filtro cellulare da 100 micromolari su un tubo conico da 50 millilitri e trasferire la milza asportata nel filtro cellulare usando una pinza anatomica. Schiacciare la milza attraverso il colino con uno stantuffo della siringa. Lavare le celle attraverso il filtro con 10 millilitri di mezzo completo.
Centrifugare le cellule a 300 G per 10 minuti a quattro gradi centigradi. Quindi, scartare il surnatante. Risospendere il pellet cellulare in due millilitri di tampone di lisi RBC a freddo e incubare la sospensione per cinque minuti su ghiaccio.
Lavare la sospensione cellulare con 10 millilitri di mezzi completi a quattro gradi centigradi e rimuovere eventuali coaguli cellulari tra i lavaggi per milza da topi infetti da plasmodio. Centrifugare le cellule a 400 G per cinque minuti a quattro gradi centigradi. Quindi, scartare il surnatante.
Ora posiziona una colonna LS o LD nel campo magnetico e prepara la colonna risciacquandola con tre millilitri di tampone MACS. Quindi, applicare la sospensione cellulare sulla colonna. Dopo aver lavato la colonna tre volte con tre millilitri di tampone MACS, raccogliere il flusso contenente le celle spleniche.
Raccogliere 10 microlitri di cellule spleniche e aggiungere 10 microlitri di blu di tripano per verificare la vitalità cellulare. Aggiungere le cellule all'emocitometro. Contare gli splenociti in una soluzione di tripano blu e controllare la vitalità cellulare.
Centrifugare tutti gli splenociti ed eliminare il surnatante. Risospendere il pellet cellulare in 40 microlitri di tampone MACS. Aggiungere 10 microlitri di un cocktail di anticorpi alla biotina alle cellule, mescolare bene e incubare per cinque minuti sul ghiaccio.
Dopo aver incubato le microsfere anti-biotina sul ghiaccio per 10 minuti, posizionare la colonna MACS LS nel supporto del campo magnetico e preparare la colonna risciacquandola con tre millilitri di tampone MACS. Applicare la sospensione cellulare sulla colonna. Lavare la colonna tre volte con tre millilitri di tampone MACS e raccogliere il flusso contenente tutte le cellule citotossiche non etichettate.
Dopo aver centrifugato il sangue raccolto a 350 volte G per cinque minuti, scartare il siero e risospendere il sangue in un millilitro di RPMI senza FBS. Dopo aver posizionato la colonna LS nel supporto del campo magnetico, sciacquare con RPMI e far passare la sospensione RBC attraverso la colonna. Una volta che le cellule passano attraverso la colonna, centrifugare il flusso attraverso, scartare il surnatante e riapplicare un millilitro del flusso nella colonna per isolare più iRBC.
Lavare la colonna due volte con cinque millilitri di RPMI. Eseguire le fasi di lavaggio aggiungendo aliquote tampone non appena il serbatoio della colonna è vuoto. Aggiungere cinque millilitri di RPMI, rimuovere la colonna e spurgare gli iRBC in un nuovo tubo da 15 millilitri.
Diluire un microlitro di una soluzione CFSE da 10 millimolari in un millilitro RPMI senza FBS. Dopo aver risospeso i globuli rossi in 500 millilitri di RPMI senza FBS, aggiungere 500 millilitri di CFSE diluito e incubare per otto minuti a temperatura ambiente, al riparo dalla luce. Lavare le celle tre volte con 14 millilitri di mezzo completo e centrifugare le cellule due volte.
Per la co-coltura di linfociti citotossici, placcare le cellule in una piastra a fondo rotondo a 96 pozzetti. Aggiungere i linfociti purificati e gli iRBC marcati con CFSE nel rapporto effettore/cellula bersaglio desiderato ad un volume finale di 200 millilitri e omogeneizzare. Preparare ogni condizione in triplice copia e incubare le cellule a 37 gradi centigradi.
Gli iRBC sono stati purificati da topi infetti da P.yoelii utilizzando colonne LS. La purificazione è evidenziata da strisci di sangue da sangue raccolto prima e dopo l'arricchimento della colonna. La strategia di gating necessaria per valutare la percentuale di lisi dei globuli rossi è presentata qui.
Il cancello di arresto è impostato nella popolazione di perline di conteggio. La strategia di gating viene avviata selezionando le singole celle, esclusi i detriti, in base al rapporto altezza-area del picco di dispersione in avanti, seguita dalla selezione della popolazione RBC in Ter119+ e CD8-Quindi, selezionare IBC vivi come CFSE altamente positivo. Ecco l'analisi applicata a un esempio sperimentale che utilizza diversi effettori per indirizzare i rapporti, visualizzando RBC vivi dopo la co-coltura.
Viene mostrata una rappresentazione grafica della percentuale di lisi dei globuli rossi, calcolata in base a questa formula. La significatività tra i gruppi che utilizzavano CD8 citotossico o CD8 naïve è stata valutata mediante ANOVA bidirezionale con confronti multipli. Il metodo attuale esplora la lisi dei globuli rossi mediante contatto cellulare diretto con cellule killer e può essere pianificato per scoprire i meccanismi coinvolti utilizzando anticorpi bloccanti a specifici recettori o molecole.
Questo test di uccisione in vitro presenta una nuova strategia per chiarire i meccanismi dell'immunità cellulo-mediata alla malaria in fase ematica, che aiuterà il progresso di nuove terapie e vaccini contro la malaria.
