Grazie a Elena Mitsi (Assistente di ricerca) e suor Carole Hancock (infermiere Research) e personale del teatro per il loro contributo alla ripresa, e David Shaw (infermiere ricerca) per il suo supporto con i nostri broncoscopie di ricerca. Grazie anche al nostro volontario Rebecca Dunphy per consentire a questa procedura per essere girato.

1. I soggetti sono accolti all&#39;arrivo dal Nurse Research respiratoria <ol><li> L&#39;argomento è stato a digiuno per&gt; 4 ore per il cibo solido e 2 ore per liquidi chiari 1. </li><li> La procedura viene eseguita come un caso al giorno con gli opportuni controlli pre-e post-procedura (come da politica ospedaliera standard). </li><li> Il soggetto indossa un camice. </li><li> Una piccola cannula calibro viene inserito (idealmente in mano sinistra) e rimane in situ fino al termine del periodo di recupero post-procedura 1. </li><li> Osservazioni Preprocedure sono prese (pressione arteriosa, frequenza cardiaca, saturazione dell&#39;ossigeno [SATs]). </li><li> Il soggetto viene trasferito alla suite broncoscopia. </li></ol> 2. Il soggetto è preparato per la Procedura nella Suite da una ricerca Clinico respiratoria Esperto in broncoscopia <ol><li> Apparecchiature di monitoraggio è fissato tra cui: 3 derivazioni, pulsossimetro 1,10 e sfigmomanometro. AnesteticiSupporto ic non è necessario compreso il consenso informato scritto. </li><li> L&#39;ossigeno può essere distribuito mediante cannula nasale fino a 4 L / min, per ottenere SATs&gt; 90% 1. </li><li> L&#39;operatore controlla il broncoscopio, questo include la garanzia di aspirazione efficace aspirando soluzione fisiologica sterile. </li><li> Anestesia topica con lidocaina è raggiunto nei passaggi nasali (utilizzando Instillagel 1) e la mucosa orale (usando xylocaina) </li><li> Se la sedazione è appropriato e richiesto dal soggetto, midazolam per via endovenosa è somministrato 1. Un agente di inversione del caso (flumazenil) è immediatamente disponibile. </li><li> Attrezzature per la rianimazione devono essere prontamente disponibili 1,10. </li></ol> 3. Il broncoscopio è inserita e posizionata <ol><li> Intubazione è di solito tramite il naso. Se questo non è possibile a causa di polipi nasali, turbinati infiammate, o qualsiasi disagio allora il soggetto è intubato attraverso la bocca (un paradenti è usato per preveniredanneggiare la portata o denti del soggetto). </li><li> Anestesia topica alla laringe viene completata usando 4% lidocaina, di solito viene utilizzato un totale di 4-6 ml. Comunemente questo provoca tosse su instillazione. </li><li> Le corde vocali sono passati, ed ulteriori anestesia delle mucose con 2 ml di lidocaina al 2% alla carena, alla divisione del lobo inferiore destro (RLL) e del lobo medio destro (RML) e all&#39;ingresso RML. </li><li> Il broncoscopio è posizionato all&#39;interno della RML, idealmente nel segmento mediale, in una posizione in cui è sufficiente essere in una posizione sicura distale ma non troppo distale in modo che il collasso delle vie aeree quando si aspira (&#39;test Wink&#39; utilizzando il pulsante aspirazione ). </li><li> Buon posizionamento è indicato durante la prova wink da un broncoscopio che può essere completamente mantenuta in posizione dal broncoscopista e una via aerea che non fa chiudere completamente immediatamente aspirazione delicata. </li></ol> 4. Il BAL viene eseguito <ol><li> Quattro 60 ml siringhe preriempito con soluzione salina riscaldata - 60 ml, 50 ml, 50 ml e 40 ml in siringhe successive. Quando il soggetto e broncoscopista sono pronti prima siringa di soluzione salina viene instillata dall&#39;assistente broncoscopia mentre il broncoscopista mantiene la posizione nella RML. </li><li> Aspirazione mano delicata viene quindi eseguita l&#39;assistente utilizzando la stessa porta e 50 ml siringa. </li><li> Questa procedura viene poi ripetuta un ulteriore 3x, con un volume massimo di 200 ml utilizzati nella nostra tecnica specifica. </li><li> Il fluido BAL recuperato viene espulso delicatamente in contenitori etichettati già svoltasi il ghiaccio in fusione. Contenitori di vetro possono essere presiliconized per inibire l&#39;adesione cellulare e massimizzare il rendimento cella. </li><li> Il fluido BAL appare nebuloso contro la luce con superficie le bolle di sapone formati da tensioattivi. </li><li> Il broncoscopio sta lentamente completamente ritirata. </li><li> Il BAL viene trasportato immediatamente in ghiaccio per l&#39;elaborazione immediata. </li></ol> 5. Oggetto Recovery </p&gt; <ol><li> Il soggetto viene recuperato per 2-4 ore dalla nutrice di ricerca respiratorio in un reparto. </li><li> Durante questo periodo essi sono autorizzati a riposare e poi solo mangiare e bere&gt; 60 min 1 dopo la procedura (quando la loro rondine è valutato come sicuro), al fine di ridurre il rischio di aspirazione. </li><li> Osservazioni post procedurali sono monitorati e registrati. Un esame clinico si verifica prima della dimissione. </li><li> Il soggetto è informato pre-dimissione circa gli effetti collaterali più comuni (febbre, mite destra sottomammario dolore al petto, mal di gola) e dato un numero da contattare in caso di significativi effetti collaterali si verificano 1. </li><li> Il soggetto è un follow-up a 1-5 giorni post-procedura con un contatto clinico. Questo può essere sia per telefono o di persona. </li></ol> 6. Le cellule sono isolati in laboratorio - Eseguire su Melting Ice Dove Possibile <ol><li> Il volume di fluido BAL è registrato e filtrato attraverso un doppio strato di garza sterile tamponeper rimuovere i tappi di muco in prechilled, sterili provette da 50 ml centrifuga. </li><li> Le cellule vengono pellettizzate per centrifugazione a 500 xg a 4 ° C per 5-10 minuti e lavate vortex in 50 ml di soluzione fisiologica fredda. La centrifugazione viene ripetuto una volta. </li><li> Le cellule sono risospese in terreno di coltura (RPMI-1640 + siero bovino fetale al 10% + 2 mM L-glutammina + penicillina [40 UI / ml], streptomicina [75 UI / ml], e amfotericina B [0,5 UI / ml]) e conteggio differenziale effettuato con un volume uguale di trypan blu e un emocitometro. </li><li> La sospensione cellulare è normalizzata alla densità richiesta (usiamo 1 x 10 6 cellule / ml), introdotto pipettando nella opportune piastre di coltura tissutale, e incubate a 37 ° C per 3 ore per consentire macrofagi aderenza. 1 ml di questa sospensione di cellule per pozzetto è appropriato per piastre di coltura da 24 pozzetti. </li><li> Per il lavoro linfociti, dopo 3 ore di incubazione, il mezzo di coltura viene delicatamente pipettati su e giù 3x, e raccolto. Questo mezzo contiene linfocitie macrofagi non aderenti e può essere utilizzato per valutare la funzione dei linfociti, ma può essere utilizzato anche in fasi di purificazione ad esempio con CD14 biglie magnetiche per rimuovere i macrofagi. </li><li> Per lavoro macrofagi, dopo 3 h di incubazione, il mezzo viene accuratamente rimosso con pipettaggio minimo e sostituito con fresco, medio caldo senza antibiotici (RPMI 1640 + 10% siero fetale bovino + 2 mM L-glutammina). I macrofagi sono aderenti alla piastra di coltura tissutale (vedi Figura 1). </li></ol>

<ol>
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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bronchoalveolar+lavage+in+the+normal+volunteer+subject.+2.+Safety+and+results+of+repeated+BAL,+and+use+in+the+assessment+of+intrasubject+variability.">Bronchoalveolar lavage in the normal volunteer subject. 2. Safety and results of repeated BAL, and use in the assessment of intrasubject variability.</a> Chest. 94, 281-285 (1988).</li><li>De Brauwer, E. I., Jacobs, J. A., Nieman, F., Bruggeman, C. A., Drent, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bronchoalveolar+lavage+fluid+differential+cell+count.+How+many+cells+should+be+counted.">Bronchoalveolar lavage fluid differential cell count. How many cells should be counted.</a> Anal. Quant. Cytol. Histol. 24, 337-341 (2002).</li><li>Mtunthama, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malawians+permit+research+bronchoscopy+due+to+perceived+need+for+healthcare.">Malawians permit research bronchoscopy due to perceived need for healthcare.</a> J. Med. Ethics. 34, 303-307 (2008).</li><li>Pereira, W., Kovnat, D. M., Snider, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+prospective+cooperative+study+of+complications+following+flexible+fiberoptic+bronchoscopy.">A prospective cooperative study of complications following flexible fiberoptic bronchoscopy.</a> Chest. 73, 813-816 (1978).</li><li>Huang, Y. C., Bassett, M. A., Levin, D., Montilla, T., Ghio, A. 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Andrea M. Collins è finanziato dalla Bill e Melinda Gates Foundation, e nessun potenziale conflitto di interessi. Ha ricevuto fondi dalla Merck (MSD) e GSK per partecipare a conferenze e le tasse universitarie. 50 Bals di ricerca svolte in modo indipendente. Jamie Rylance è finanziato dal Wellcome Trust, e non ha alcun conflitto di interessi. Egli non ha ricevuto altri fondi. 70 Bals di ricerca svolte in modo indipendente. Daniel G. Wootton è finanziato da un NIHR PhD Fellowship, e non ha conflitti di interesse. 40 Bals di ricerca svolte in modo indipendente. Angela D. Wright non ha alcun potenziale conflitto di interessi. Assist con oltre 100 Bals ricerca. Adam KA Wright non ha alcun potenziale conflitto di interessi. Ha elaborato oltre 50 campioni di BAL. Duncan G. Fullerton </strong&gt; Non ha alcun potenziale conflitto di interessi. 100 Bals di ricerca svolte in modo indipendente. Stephen B. Gordon non ha alcun potenziale conflitto di interessi. Ha ricevuto fondi dalla Merck (MSD) e Novartis per partecipare a conferenze. 400 Bals di ricerca svolte in modo indipendente.

Per ottenere buoni risultati i seguenti sono utili: <ol><li> Buona anesthetisation alla base della lingua e posteriore dell&#39;orofaringe. Questo è importante perché migliora la tolleranza procedurale del soggetto e comfort complessivo. </li><li> O una pediatrico (diametro esterno 3,4-3,6 mm) o broncoscopio adulto (diametro esterno 4,8-5,9 mm) possono essere utilizzati. </li><li> Se c&#39;è qualche disagio durante l&#39;intubazione nasale, intubazione orale è preferito. In generale, intubazione nasale o è una tecnica semplice, o dovrebbe essere abbandonato. </li><li> Dopo instillazione iniziale di lidocaina all&#39;orofaringe, il soggetto può preferire broncoscopio ritirata in attesa dell&#39;inizio dell&#39;anestesia, soprattutto se il broncoscopio viene inserito per via orale. </li><li> Garantire almeno 10 x 10 ml siringhe sono precompilati con solo 2-4 ml di lidocaina. L&#39;aria deve essere lasciato nelle siringhe che consentano un migliore consegna delle dell&#39;anestesia direttamente su corde e muco endobronchialesa. </li><li> Poiché tosse durante la procedura riduce significativamente BAL rendimento; utilizzando una soluzione salina riscaldata e con buone anestesia mucose sono importanti per ridurre questo. </li><li> I 50 ml siringhe devono essere pre-riempite con soluzione salina riscaldata. E &#39;comune per i primi 50 ml di soluzione salina normale instillato cedere tra 10-20 ml causa della perdita spazio morto e la restante esecuzione nelle vie aeree terminali. Ulteriori aliquote restituiscono una percentuale maggiore di fluido. </li><li> L&#39;operatore deve sempre controllare il broncoscopio prima di intubazione, compresa la garanzia di aspirazione efficace aspirando soluzione fisiologica sterile. Perdita di aspirazione può comunemente verificarsi a causa di attorcigliamento del tubo o perdite attorno alle connessioni con il broncoscopio o dispositivo di aspirazione. </li><li> Durante l&#39;aspirazione manuale, idealmente le vie aeree non deve crollare. Se l&#39;aspirazione crolla ricorrentemente le vie aeree, ritorna BAL ridurre al meccanismo a valvola, e infiammazione locale e sanguinamento è più probabile: questo a sua volta rende le vie aeree mminerale irritabile e tosse più probabile. La scelta del più appropriato ramo subsegmentali RML e con basse pressioni di aspirazione sono quindi entrambi importanti. </li><li> Quando l&#39;aria viene aspirata costantemente verificare nuovamente la connessione della siringa al broncoscopio e anche la posizione del broncoscopio nelle vie aeree distale. Se questo è un problema ricorrente, post-procedura assicurarsi che non ci siano buchi nel broncoscopio stessa. </li><li> BAL dai fumatori è spesso più scuro a causa della presenza di particelle intracellulari. I fumatori possono tollerare la broncoscopia meno bene, e hanno aumento della tosse. </li><li> La resa del volume BAL preferibile è&gt; 100 ml. Una resa di&gt; 150 ml è eccellente. Non abbiamo avuto alcun rendimenti&gt; 170 ml. Non esiste una relazione lineare tra il rendimento delle cellule e BAL resa volume. </li><li> I rendimenti di &lt;100 ml sono, nella nostra esperienza, più propensi a portare a effetti collaterali quali tosse, dolore toracico e febbre. Si consiglia che i soggetti con rese di &lt;100 ml essere recoVered in posizione laterale sinistra, puo aiutare il drenaggio di qualsiasi fluido polmone residuo. </li><li> Contatto clinico dovrebbe essere effettuato con il soggetto entro 1-5 giorni per garantire l&#39;assenza di effetti collaterali. </li><li> Midazolam sedazione viene utilizzato per &lt;50% dei soggetti nel Regno Unito e &lt;5% in Malawi. Midazolam non sembra direttamente migliorare la tollerabilità, alcuni operatori ritengono che la sedazione a volte può essere controproducente nel mantenere un dialogo coerente (e rassicurante) con il soggetto. </li><li> Nella nostra esperienza, c&#39;è una curva di apprendimento significativo con questa tecnica. Per esempio il coordinamento tra medico e infermiere richiede tempo e rendimenti sono spesso inferiori all&#39;inizio del processo di apprendimento. </li><li> Nei soggetti HIV positivi, usiamo gli antibiotici a scopo profilattico prebronchoscopy. </li></ol>

Sfondo Broncoscopia a fibre ottiche è stato sviluppato per la pratica clinica, è ampiamente utilizzato sia diagnostico che terapeutico 1,2. Il lavaggio broncoalveolare (BAL) rimuove le cellule non aderenti e del polmone rivestimento liquido dalla superficie della mucosa, la biopsia viene usato per campionare mucosa e sottomucosa tessuti. In ambienti di ricerca, BAL permette di campionamento di innata (macrofagi polmonari 3-5), cellulare (B e le cellule T 6), e umorali (immunoglobuline 7) risposte all&#39;interno del polmone. BAL è accettata a livello internazionale per la ricerca 8 e dal 1999 la tecnica è stata eseguita in&gt; 1.000 soggetti nel Regno Unito e in Malawi dal nostro gruppo. Usiamo questa tecnica negli studi di risposte immunitarie innate, cellulari e umorali all&#39;antigene pneumococco inclusi sperimentale trasporto umano pneumococcica 9,17, biomassa fumo 5, HIV e la vaccinazione, e stu trattamento adiuvantemuore in recupero da polmonite. La nostra tecnica utilizza aspirazione a mano gentile di liquido instillato, questo è stato progettato per massimizzare il volume BAL restituiti e applicare una forza minima di taglio sulla epiteli ciliato al fine di preservare la struttura e la funzione delle cellule all&#39;interno del fluido BAL. In un contesto di ricerca BAL utilizza una tecnica diversa da quella praticata da medici di assistenza respiratoria e intensiva (lavare spesso definita bronchiale, lavaggi, di lavaggio, o BAL), che mirano a ottenere benefici diagnostico o terapeutico. La tecnica di ricerca è destinato a raccogliere le cellule e preservare la vitalità di facilitare la crescita delle cellule in coltura ex vivo. Per questi motivi la tecnica di ricerca utilizza un instillate volume più grande (tipicamente dell&#39;ordine di 200 ml) e impiega aspirazione manuale per ridurre il danno cellulare. I pazienti sono date anestesia locale, offerto sedazione cosciente (midazolam), e tollerano la procedura bene con effetti collaterali minimi. Soggettivi verbale e scrittainformazioni t migliora la tolleranza e il consenso informato scritto è obbligatoria 1. Scopo L&#39;obiettivo generale è che la procedura dovrebbe essere sicuro ed efficace. I soggetti non dovrebbero incontrare alcun disturbo fisiologico e gli operatori devono costantemente raccogliere in eccesso di 100 ml di BAL di soggetti. Dopo la procedura, i soggetti dovrebbero verificarsi effetti collaterali minimi. Sicurezza Sicurezza del soggetto è fondamentale. I soggetti vengono accuratamente selezionati con chiari criteri di inclusione ed esclusione. Questo protocollo include una descrizione dei rischi potenziali e le misure adottate per mitigarli. Controindicazioni alla broncoscopia ricerca possono essere espressi come assoluto o relativo, e sono inclusi nel nostro protocollo di studio come criteri di esclusione e di inclusione. I nostri soggetti sono tutti selezionati per garantire piena salute. Controindicazioni assoluteincludere rachide cervicale instabile, ipossia non risponde, angina instabile, diatesi emorragica e maligna aritmia cardiaca. Le controindicazioni relative, comprese quelle condizioni associate con l&#39;aumento del tasso di complicanze, comprendono: Generale: mal cooperativa soggetto 1, alcun significativo problema di salute generale ad esempio l&#39;epilessia, precedente broncoscopia mal tollerata, noto reazioni avverse ai lidocaina o midazolam, gravidanza, cattiva alimentazione. Respiratorio: ipossia [saturazioni (CST), in onda &lt;94%], ipercapnia, asma instabile 1, la funzione respiratoria significativa compromissione 1 (FEV1 &lt;1 L), ipertensione polmonare. Cardiovascolare: uremia, entro 6 settimane di infarto del miocardio 1, superior ostruzione della vena cava. Altro: immunosoppressione (il nostro gruppo si esibisce regolarmente questa proceduradura in soggetti HIV positivi). Vedi Tabella 1 - Rischi connessi con BAL per la ricerca.

<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:966px;" width="966">
	<tbody>
		<tr>
			<td style="width:244px;height:25px;">
			Material
			</td>
			<td style="width:161px;height:25px;">
			Company
			</td>
			<td style="width:151px;height:25px;">
			Catalogue Number
			</td>
			<td style="width:410px;height:25px;">
			Comments
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:244px;height:26px;">
			Fibreoptic bronchoscope, light and suction source
			</td>
			<td style="width:161px;height:26px;">
			unspecified
			</td>
			<td style="width:151px;height:26px;">
			
			</td>
			<td style="width:410px;height:26px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:244px;height:26px;">
			Surgical gown, sterile gloves
			</td>
			<td style="width:161px;height:26px;">
			unspecified
			</td>
			<td style="width:151px;height:26px;">
			
			</td>
			<td style="width:410px;height:26px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:244px;height:26px;">
			Sphygnomanometer
			</td>
			<td style="width:161px;height:26px;">
			unspecified
			</td>
			<td style="width:151px;height:26px;">
			
			</td>
			<td style="width:410px;height:26px;">
			For continuous patient monitoring
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:244px;height:26px;">
			Pulse oximeter
			</td>
			<td style="width:161px;height:26px;">
			unspecified
			</td>
			<td style="width:151px;height:26px;">
			
			</td>
			<td style="width:410px;height:26px;">
			For continuous patient monitoring
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:244px;height:26px;">
			3 lead ECG monitor
			</td>
			<td style="width:161px;height:26px;">
			unspecified
			</td>
			<td style="width:151px;height:26px;">
			
			</td>
			<td style="width:410px;height:26px;">
			For continuous patient monitoring
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:244px;height:26px;">
			Nasal oxygen delivery 2-4l/min
			</td>
			<td style="width:161px;height:26px;">
			unspecified
			</td>
			<td style="width:151px;height:26px;">
			
			</td>
			<td style="width:410px;height:26px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:244px;height:26px;">
			Lidocaine 10% spray (Xylocaine)
			</td>
			<td style="width:161px;height:26px;">
			AstraZeneca
			</td>
			<td style="width:151px;height:26px;">
			
			</td>
			<td style="width:410px;height:26px;">
			For topical anaesthesia
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:244px;height:26px;">
			Lidocaine hydrochloride 2%
			</td>
			<td style="width:161px;height:26px;">
			unspecified
			</td>
			<td style="width:151px;height:26px;">
			
			</td>
			<td style="width:410px;height:26px;">
			For topical anaesthesia
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:244px;height:26px;">
			Lidocaine gel (Instillagel)
			</td>
			<td style="width:161px;height:26px;">
			Farco-Pharma, Germany
			</td>
			<td style="width:151px;height:26px;">
			
			</td>
			<td style="width:410px;height:26px;">
			Alternative products available from other suppliers
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:244px;height:26px;">
			Normal saline, sterile 200ml
			</td>
			<td style="width:161px;height:26px;">
			unspecified
			</td>
			<td style="width:151px;height:26px;">
			
			</td>
			<td style="width:410px;height:26px;">
			Warm to 30oC
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:244px;height:26px;">
			10ml taper-end syringe (x10)
			</td>
			<td style="width:161px;height:26px;">
			unspecified
			</td>
			<td style="width:151px;height:26px;">
			
			</td>
			<td style="width:410px;height:26px;">
			For administration of lidocaine
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:244px;height:26px;">
			Intravenous cannula 18G
			</td>
			<td style="width:161px;height:26px;">
			unspecified
			</td>
			<td style="width:151px;height:26px;">
			
			</td>
			<td style="width:410px;height:26px;">
			For administration of midazolam
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:244px;height:26px;">
			Midazolam
			</td>
			<td style="width:161px;height:26px;">
			unspecified
			</td>
			<td style="width:151px;height:26px;">
			
			</td>
			<td style="width:410px;height:26px;">
			For sedation
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:244px;height:26px;">
			Flumazenil
			</td>
			<td style="width:161px;height:26px;">
			unspecified
			</td>
			<td style="width:151px;height:26px;">
			
			</td>
			<td style="width:410px;height:26px;">
			Reversal of benzodiazepine sedation (emergency use only)
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:244px;height:26px;">
			60ml taper-end syringes (x4)
			</td>
			<td style="width:161px;height:26px;">
			unspecified
			</td>
			<td style="width:151px;height:26px;">
			
			</td>
			<td style="width:410px;height:26px;">
			For normal saline injection and BAL fluid withdrawal.
			May require connector to attach to the injection port of the bronchoscope
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:244px;height:26px;">
			Sterile gauze swab
			</td>
			<td style="width:161px;height:26px;">
			Vernaid, UK
			</td>
			<td style="width:151px;height:26px;">
			
			</td>
			<td style="width:410px;height:26px;">
			Alternative products available from other suppliers
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:244px;height:26px;">
			Sterile container for BAL fluid
			</td>
			<td style="width:161px;height:26px;">
			See text and comments
			</td>
			<td style="width:151px;height:26px;">
			
			</td>
			<td style="width:410px;height:26px;">
			Siliconised glass bottles reduce macrophage adherence. Alternatively, 50ml centrifuge tubes may be used (total capacity 200ml)
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:244px;height:26px;">
			Sigmacote
			</td>
			<td style="width:161px;height:26px;">
			Sigma, UK
			</td>
			<td style="width:151px;height:26px;">
			SL2
			</td>
			<td style="width:410px;height:26px;">
			Only if siliconised glass bottles used. NB: Harmful and flammable. If used, follow precautions detailed in manufacturer&#8217;s MSDS
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:244px;height:26px;">
			Centrifuge
			</td>
			<td style="width:161px;height:26px;">
			unspecified
			</td>
			<td style="width:151px;height:26px;"></td>
			<td style="width:410px;height:26px;">
			At least 4x50ml tube capacity. Refrigeration to 4oC preferred.
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:244px;height:26px;">
			Shandon Cytospin centrifuge
			</td>
			<td style="width:161px;height:26px;">
			Thermo Scientific, UK
			</td>
			<td style="width:151px;height:26px;">
			
			</td>
			<td style="width:410px;height:26px;">
			For differential count only
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:244px;height:26px;">
			RPMI 1640 medium with L-glutamine
			</td>
			<td style="width:161px;height:26px;">
			Sigma, UK
			</td>
			<td style="width:151px;height:26px;">
			R8758
			</td>
			<td style="width:410px;height:26px;">
			Alternative products available from other suppliers
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:244px;height:26px;">
			Fetal bovine serum
			</td>
			<td style="width:161px;height:26px;">
			Sigma, UK
			</td>
			<td style="width:151px;height:26px;">
			F6178
			</td>
			<td style="width:410px;height:26px;">
			Alternative products available from other suppliers
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:244px;height:26px;">
			Penicillin-Streptomycin
			</td>
			<td style="width:161px;height:26px;">
			Sigma, UK
			</td>
			<td style="width:151px;height:26px;">
			P4333
			</td>
			<td style="width:410px;height:26px;">
			Alternative products available from other suppliers
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:244px;height:26px;">
			Amphotericin B
			</td>
			<td style="width:161px;height:26px;">
			Sigma, UK
			</td>
			<td style="width:151px;height:26px;">
			A2942
			</td>
			<td style="width:410px;height:26px;">
			Alternative products available from other suppliers
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:244px;height:26px;">
			Tissue culture plates
			</td>
			<td style="width:161px;height:26px;">
			Greiner Bio-One, UK
			</td>
			<td style="width:151px;height:26px;">
			662160
			</td>
			<td style="width:410px;height:26px;">
			Alternative products available from other suppliers
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:244px;height:26px;">
			Glass microscope slides
			</td>
			<td style="width:161px;height:26px;">
			unspecified
			</td>
			<td style="width:151px;height:26px;">
			
			</td>
			<td style="width:410px;height:26px;">
			For differential count only
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:244px;height:26px;">
			Shandon cytofunnel
			</td>
			<td style="width:161px;height:26px;">
			Thermo Scientific, UK
			</td>
			<td style="width:151px;height:26px;">
			A78710003
			
			</td>
			<td style="width:410px;height:26px;">
			For differential count only
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:244px;height:26px;">
			Shandon cytoclip
			</td>
			<td style="width:161px;height:26px;">
			Thermo Scientific, UK
			</td>
			<td style="width:151px;height:26px;">
			59910052
			</td>
			<td style="width:410px;height:26px;">
			For differential count only
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:244px;height:26px;">
			Hemacolor staining set (fixative, red and blue reagents)
			</td>
			<td style="width:161px;height:26px;">
			Merck, Germany
			</td>
			<td style="width:151px;height:26px;">
			111661
			</td>
			<td style="width:410px;height:26px;">
			Use according to manufacturer&#8217;s instructions
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bronchoalveolar lavage (bal) for research; obtaining adequate sample yield

Descriviamo una tecnica di ricerca per la broncoscopia a fibre ottiche con lavaggio broncoalveolare (BAL) con mano il manuale di aspirazione possedute al fine di rimuovere le cellule non aderenti e liquido rivestimento del polmone dalla superficie della mucosa. In ambienti ricerca, BAL permette di campionamento di innata (macrofagi polmoni), cellulari (cellule T B e) e umorali (immunoglobulina) risposte all&#39;interno del polmonare. BAL è accettata a livello internazionale per scopi di ricerca e dal 1999 la tecnica è stata eseguita in&gt; 1.000 soggetti nel Regno Unito e in Malawi dal nostro gruppo. La nostra tecnica utilizza aspirazione portatile delicato da fluido instillato, questo è stato progettato per massimizzare il volume BAL restituito e applicare una forza minima al taglio su epiteli ciliati al fine di preservare la struttura e la funzione delle cellule all&#39;interno del BAL e preservare la vitalità di facilitare la crescita di cellule in coltura ex vivo. La tecnica di ricerca utilizza pertanto un più ampio volume di insstillato (tipicamente dell&#39;ordine di 200 ml) e impiega aspirazione manuale per ridurre il danno cellulare. I pazienti sono date anestesia locale, offerto sedazione cosciente (midazolam), e tollerano la procedura bene con effetti collaterali minimi. Informazioni soggette verbale e scritta migliora la tolleranza e il consenso informato scritto è obbligatoria. Sicurezza del soggetto è fondamentale. I soggetti vengono accuratamente selezionati con chiari criteri di inclusione ed esclusione. Questo protocollo include una descrizione dei rischi potenziali e le misure adottate per mitigare loro, un elenco di controindicazioni, pre e verifiche post-procedura, nonché precise tecniche di broncoscopia e di laboratorio.

Buoni risultati clinici sono un volume BAL con oltre 100 ml e un soggetto che ha sperimentato al massimo, disagio minore (vedere Tabella 1). Ciò richiede un soggetto rilassato e cooperativo. Il medico deve essere sicuro, pienamente preparati (Materiali), e comprensione verso il volontario. Variabilità inter-e intra-soggetto della resa cellulare (compresa la conta differenziale) è stato descritto. Conta delle cellule differenziali di soggetti sani sono in genere&gt; 90% macrofagi con un piccolo numero di neutrofili (&lt;2%) e linfociti (5-10%). Cellule BAL centrifugati su vetrini da microscopio possono essere colorati con una macchia nucleare differenziale per ottenere queste informazioni (Figura 1). In Figura 1, le cellule BAL sono state fissate e colorate con Hemacolor colorazione secondo le istruzioni del produttore. Almeno 300 celle devono essere contati per ottenere risultati affidabili per i macrofagi,neutrofili e linfociti; 500 cellule per i tipi di cellule più rari. <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Pericolo </td><td> Rischio </td><td> Ridotto in questo protocollo da: </td></tr><tr><td colspan="3"> Effetto della broncoscopia e BAL 1, 14 </td></tr><tr><td> Lieve disagio </td><td> &lt;25% 14 # </td><td> Analgesia e sedazione adeguata. Approccio fiducioso e attento al soggetto. </td></tr><tr><td> Epistassi </td><td> &lt;1% # </td><td> Leggera pressione solo per intubazione nasale. Se il soggetto fastidio o un diaframma più chiuso - intubazione orale invece. </td></tr><tr><td> Emorragia endobronchiale (emottisi) </td><td> &lt;0,1% * 15 </td><td> Nessun biopsie prese. Attento controllo durante la broncoscopia - evitando mucosa respiratoria. </td></tr><tr><td> Nausea, vomito e polmonite da aspirazione </td><td> &lt;0,02% 14, # </td><td> Il digiuno per cibo solido&gt; 4 ore preprocedure 1. Adeguata anestesia topica. Posizione semiseduta durante la procedura. Un&#39;attenta osservazione post-procedura. </td></tr><tr><td> Febbre </td><td> 0.01 14-1% # 16 </td><td> Si riferisce a infiammazione, e può minimizzato raccolta massima di BAL. Lobo singolo BAL solo. # </td></tr><tr><td> Naso Mal / di gola e raucedine </td><td> &lt;25% 14 # </td><td> Adeguate anestesia topica del naso, della gola e della laringe (minimizzando tosse). </td></tr><tr><td> Infezione </td><td> &lt;0,1% in HIV negativo, 1% in pazienti HIV positivi 14 # </td><td> Procedura broncoscopio lavaggio standard 1. Lobo singolo BAL solo. # Il riconoscimento precoce di infezione: esame clinico entro 1 ora did contatto clinica 1-5 giorni dopo la broncoscopia. </td></tr><tr><td> Dolore toracico / tosse </td><td> &lt;0,2% 14, # </td><td> Lobo solo single BAL. Raccolta massima BAL. # </td></tr><tr><td colspan="3"> Effetti dei farmaci: lidocaina, midazolam </td></tr><tr><td> Aritmia </td><td> Molto raro * </td><td rowspan="3"> Massimo di 5 mg / kg 14 lidocaina utilizzati. Riscaldato soluzione fisiologica instillato. # Pulsossimetria (satelliti&gt; 90% con la supplementazione di ossigeno), il monitoraggio cardiaco tutta procedura. Benzodiazepine antagonista (flumazenil) immediatamente disponibile. </td></tr><tr><td> Disorientamento / agitazione </td><td> &lt;0,1% † # </td></tr><tr><td> Depressione respiratoria Cardio </td><td> Molto raro * </td></tr></tbody></table> * Non sperimentato nel nostro gruppo in oltre 1.500 procedure di ricerca. † idiosyncratic anziché reazione dose-dipendente. # Esperienza del nostro gruppo in oltre 1.500 procedure di ricerca. Tabella 1. Rischi connessi con BAL per la ricerca. Questo include pericolo o del rischio e come questo viene ridotto usando la tecnica descritta. Effetti della broncoscopia / BAL e anche gli effetti di tutte le droghe medicinali utilizzati sono inclusi. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/4345/4345fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1. Un vetrino da microscopio Mostro BAL macrofagi e neutrofili occasionale. Cellule BAL sono stati fissati in metanolo e colorate con Hemacolor rosso (eosina Y) e blu (azzurro B).

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Bronchoalveolar Lavage BAL for Research; Obtaining Adequate Sample Yield

Descriviamo una tecnica di ricerca per la broncoscopia a fibre ottiche e di lavaggio broncoalveolare con l&#39;aspirazione a bassa pressione. La tecnica è utilizzata per raccogliere cellule immunitarie dalle superfici bronco polmonare. Viene utilizzato anestesia locale e sedazione cosciente lieve (midazolam). Soggetti tollerano gli effetti collaterali minimi procedura di bene e di esperienza.

Lavaggio broncoalveolare (BAL) di ricerca; ottenere un&#39;adeguata Yield Esempio

We describe a research technique for fiberoptic bronchoscopy with bronchoalveolar lavage (BAL) using manual hand held suction in order to remove ...

bronchoalveolar-lavage-bal-for-research-obtaining-adequate-sample

Research

JoVE Journal

Medicine

Bronchoalveolar Lavage (BAL) for Research; Obtaining Adequate Sample Yield

73.0K Views.  National Institute for Health Research.  Descriviamo una tecnica di ricerca per la broncoscopia a fibre ottiche e di lavaggio broncoalveolare con l'aspirazione a bassa pressione. La tecnica è utilizzata per raccogliere cellule immunitarie dalle superfici bronco polmonare. Viene utilizzato anestesia locale e sedazione cosciente lieve (midazolam). Soggetti tollerano gli effetti collaterali minimi procedura di bene e di esperienza. 

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Generation of Comprehensive Thoracic Oncology Database - Tool for Translational Research

The Thoracic Oncology Program Database Project was created to serve as a comprehensive, verified, and accessible repository for well-annotated cancer specimens and clinical data to be available to researchers within the Thoracic Oncology Research Program. This database also captures a large volume of genomic and proteomic data obtained from various tumor tissue studies. A team of clinical and basic science researchers, a biostatistician, and a bioinformatics expert was convened to design the database. Variables of interest were clearly defined and their descriptions were written within a standard operating manual to ensure consistency of data annotation. Using a protocol for prospective tissue banking and another protocol for retrospective banking, tumor and normal tissue samples from patients consented to these protocols were collected. Clinical information such as demographics, cancer characterization, and treatment plans for these patients were abstracted and entered into an Access database. Proteomic and genomic data have been included in the database and have been linked to clinical information for patients described within the database. The data from each table were linked using the relationships function in Microsoft Access to allow the database manager to connect clinical and laboratory information during a query. The queried data can then be exported for statistical analysis and hypothesis generation.

A thoracic oncology database was developed to serve as a comprehensive repository for clinical and laboratory data for the purposes of translational research. The database will serve translational cancer researchers within the Thoracic Oncology Research Program. This database is adaptable to other cancer models, as well as other human diseases.

Generazione di Comprehensive Database Oncologia Toracica - Strumento per la ricerca traslazionale

The Thoracic Oncology Program Database Project was created to serve as a comprehensive, verified, and accessible repository for well-annotated cancer ...

Ricerca

Medicina

Bilateral Common Carotid Artery Occlusion as an Adequate Preconditioning Stimulus to Induce Early Ischemic Tolerance to Focal Cerebral Ischemia

There is accumulating evidence, that ischemic preconditioning - a non-damaging ischemic challenge to the brain - confers a transient protection to a subsequent damaging ischemic insult. We have established bilateral common carotid artery occlusion as a preconditioning stimulus to induce early ischemic tolerance to transient focal cerebral ischemia in C57Bl6/J mice. In this video, we will demonstrate the methodology used for this study.

There is accumulating evidence, that ischemic preconditioning (PC) &#x2013; a non-damaging ischemic challenge to the brain - confers a transient protection to a subsequent damaging ischemic insult. We established bilateral common carotid artery occlusion (BCCAO) as a preconditioning stimulus to induce early ischemic tolerance (IT) to transient focal cerebral ischemia (induced by middle cerebral artery occlusion, MCAO) in C57Bl6/J mice.

Bilaterale occlusione comune Arteria carotide come uno stimolo precondizionamento in grado di indurre tolleranza ischemica precoce di focale Ischemia Cerebrale

There is accumulating evidence, that ischemic preconditioning - a non-damaging ischemic challenge to the brain - confers a transient protection to a ...

Method for Obtaining Primary Ovarian Cancer Cells From Solid Specimens

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a valuable tool for understanding ovarian cancer, their use has many limitations. These include the lack of heterogeneity and the plethora of genetic alterations associated with extended in vitro passaging.&#160;Here we describe a method that allows for rapid establishment of primary ovarian cancer cells form solid clinical specimens collected at the time of surgery. The method consists of subjecting clinical specimens to enzymatic digestion for 30 min. The isolated cell suspension is allowed to grow and can be used for downstream application including drug screening. The advantage of primary ovarian cancer cell lines over established ovarian cancer cell lines is that they are representative of the original specific clinical specimens they are derived from and can be derived from different sites whether primary or metastatic ovarian cancer.

This study describes a detailed method for isolation and characterization of primary ovarian cancer cells from solid clinical specimens. Ovarian cancer clinical specimens are subjected to enzymatic digestion to obtain viable, fibroblast-free epithelial ovarian cancer (EOC) cells highly suitable for downstream applications.

Metodo per ottenere primarie cellule tumorali ovariche da campioni solidi

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a ...

Working with Human Tissues for Translational Cancer Research

Medical research for human benefit is greatly impeded by the necessity for human tissues and subjects. However, upon obtaining consent for human specimens, precious samples must be handled with the greatest care in order to ensure integrity of organs, tissues, and cells to the highest degree. Unfortunately, tissue processing by definition requires extraction of tissues from the host, a change which can cause great cellular stress and have major repercussions on subsequent analyses. These stresses could result in the specimen being no longer representative of the site from which it was retrieved. Therefore, a strict protocol must be adhered to while processing these specimens to ensure representativeness. The desired assay(s) must also be taken into consideration in order to ensure that an optimal technique is used for sample processing. Outlined here is a protocol for tissue retrieval, processing and various analyses which may be performed on processed tissue in order to maximize downstream production from limited tissue samples.

Translational cancer research is dependent on extraction of human tissues. Much work has gone into optimizing extraction methods for ex vivo analysis. Here, we describe tissue processing methods allowing for maximal data output from limited samples.

Lavorare con tessuti umani per Translational Cancer Research

Medical research for human benefit is greatly impeded by the necessity for human tissues and subjects. However, upon obtaining consent for human ...

Lavage-induced Surfactant Depletion in Pigs As a Model of the Acute Respiratory Distress Syndrome (ARDS)

Various animal models of lung injury exist to study the complex pathomechanisms of human acute respiratory distress syndrome (ARDS) and evaluate future therapies. Severe lung injury with a reproducible deterioration of pulmonary gas exchange and hemodynamics can be induced in anesthetized pigs using repeated lung lavages with warmed 0.9% saline (50 ml/kg body weight). Including standard respiratory and hemodynamic monitoring with clinically applied devices in this model allows the evaluation of novel therapeutic strategies (drugs, modern ventilators, extracorporeal membrane oxygenators, ECMO), and bridges the gap between bench and bedside. Furthermore, induction of lung injury with lung lavages does not require the injection of pathogens/endotoxins that impact on measurements of pro- and anti-inflammatory cytokines. A disadvantage of the model is the high recruitability of atelectatic lung tissue. Standardization of the model helps to avoid pitfalls, to ensure comparability between experiments, and to reduce the number of animals needed.

Lavage-induced Surfactant Depletion in Pigs As a Model of the Acute Respiratory Distress Syndrome ARDS

Repeated pulmonary lavages in anesthetized pigs induce lung injury resembling major aspects of human acute respiratory distress syndrome (ARDS). For this purpose the lungs are repeatedly lavaged with 0.9% saline at 37 &#176;C. The goal of the protocol is a reproducible mitigation of gas exchange and hemodynamics for research in ARDS.

Lavage indotta surfattante esaurimento nei suini come un modello della sindrome da distress respiratorio acuto (ARDS)

Various animal models of lung injury exist to study the complex pathomechanisms of human acute respiratory distress syndrome (ARDS) and evaluate future ...

Sample Preparation for Computed Tomography-based Three-dimensional Visualization of Murine Hind-limb Vessels

Blood vessels are complex networks with tree-like structures, and vascular networks are essential for maintaining both circulation and maintaining organ function. Clarifying the mechanism of blood vessel formation is therefore extremely useful for elucidating developmental processes and pathological mechanisms. Murine hind-limb vessels are often used as a model for physiological and pathological angiogenesis. Evaluation is mainly performed via a two-dimensional method using tissue sections. However, methods for evaluating three-dimensional (3D) vascular morphology are particularly limited. This paper introduces a method for visualizing murine hind-limbs using computed tomography (CT). Radiation-opaque resin is injected through the descending aorta, and whole vessels are filled with dye. By adjusting the time of dye injection, arterial-specific filling is also possible, and samples can be obtained with any micro-X-ray CT device. This contrast method provides a basic technique for the 3D evaluation of murine blood vessels in the lower extremities. Furthermore, this method can be used to visualize all blood vessels below the diaphragm and evaluate blood vessels in the abdominal organs.

Here, we describe a visualization and quantification method for murine hind-limb vessels using micro-X-ray computed tomography.

Preparazione del campione per la visualizzazione tridimensionale basata sulla tomografia computerizzata dei vasi dell'arto posteriore murino

Blood vessels are complex networks with tree-like structures, and vascular networks are essential for maintaining both circulation and maintaining organ ...

Technique for Obtaining Mesenchymal Stem Cell from Adipose Tissue and Stromal Vascular Fraction Characterization in Long-Term Cryopreservation

Human mesenchymal stem cells derived from adipose tissue have become increasingly attractive as they show appropriate features and are an accessible source for regenerative clinical applications. Different protocols have been used to obtain adipose-derived stem cells. This article describes different steps of an improved time-saving protocol to obtain a more significant amount of ADSC, showing how to cryopreserve and thaw ADSC to obtain viable cells for culture expansion. One hundred milliliters of lipoaspirate were collected, using a 26 cm three-hole and 3 mm caliber syringe liposuction, from the abdominal area of nine patients who subsequently underwent elective abdominoplasty. The stem cells isolation was carried out with a series of washes with Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (DPBS) solution supplemented with calcium and the use of collagenase. Stromal Vascular Fraction (SVF) cells were cryopreserved, and their viability was checked by immunophenotyping. The SVF cellular yield was 15.7 x 105 cells/mL, ranging between 6.1-26.2 cells/mL. Adherent SVF cells reached confluence after an average of 7.5 (&#177;4.5) days, with an average cellular yield of 12.3 (&#177; 5.7) x 105 cells/mL. The viability of thawed SVF after 8 months, 1 year, and 2 years ranged between 23.06%-72.34% with an average of 47.7% (&#177;24.64) with the lowest viability correlating with cases of two-year freezing. The use of DPBS solution supplemented with calcium and bag resting times for fat precipitation with a shorter time of collagenase digestion resulted in an increased stem cell final cellular yield. The detailed procedure for obtaining high yields of viable stem cells was more efficient regarding time and cellular yield than the techniques from previous studies. Even after a long period of cryopreservation, viable ADSC cells were found in the SVF.

The present protocol describes an improved methodology for ADSC isolation resulting in a tremendous cellular yield with time gain compared to the literature. This study also provides a straightforward method for obtaining a relatively large number of viable cells after long-term cryopreservation.

Tecnica per ottenere cellule staminali mesenchimali dal tessuto adiposo e dalla caratterizzazione della frazione vascolare stromale nella crioconservazione a lungo termine

Human mesenchymal stem cells derived from adipose tissue have become increasingly attractive as they show appropriate features and are an accessible ...

Isolation of Murine Intestinal Mesenchyme Resulting in a High Yield of Telocytes

The murine small intestine, or colon mesenchyme, is highly heterogenous, containing distinct cell types including blood and lymphatic endothelium, nerves, fibroblasts, myofibroblasts, smooth muscle cells, immune cells, and the recently identified cell type, telocytes. Telocytes are unique mesenchymal cells with long cytoplasmic processes, reaching a distance of tens to hundreds of microns from the cell body. Telocytes have recently emerged as an important intestinal stem cell niche component, providing Wnt proteins that are essential for stem and progenitor cell proliferation.
Although protocols on how to isolate mesenchyme from the mouse intestine are available, it is not clear whether these procedures allow the efficient isolation of telocytes. Isolating telocytes efficiently requires special protocol adjustments that would allow dissociation of the strong cell-cell contact between telocytes and neighboring cells without affecting their viability. Here, available intestinal mesenchyme isolation protocols were adjusted to support the successful isolation and culture of mesenchyme containing a relatively high yield of viable single-cell telocytes.
The obtained single-cell suspension can be analyzed by several techniques, such as immunostaining, cell sorting, imaging, and mRNA experiments. This protocol yields mesenchyme with sufficiently conserved antigenic and functional properties of telocytes, and can be used for several applications. For example, they can be used for co-culture with mouse- or human-derived organoids to support organoid growth with no growth factor supplementation, to better reflect the situation in the original tissue.

Here, we present a protocol to isolate murine intestinal mesenchyme, including telocytes. These can be used for several applications, such as co-culture with mouse or human-derived organoids, to support growth and better reflect the situation in the original tissue.

Isolamento del mesenchima intestinale murino con conseguente alta resa di telociti

The murine small intestine, or colon mesenchyme, is highly heterogenous, containing distinct cell types including blood and lymphatic endothelium, nerves, ...

Preparing Zanba-Stir-Fried Tiebangchui (TBC) Sample for Processing Technology Optimization

To begin a single factor experiment to compare Tiebangchui, or TBC slice thickness, for processing technology optimization, prepare five test groups each having 30 grams of TBC, but different slice thickness. Then weigh 90 grams of Zanba, which is three times as much as that of the TBC in each group. Set the temperature and the time of the automatic stir fry machine to 140 degrees Celsius and 40 minutes respectively.After the machine has heated up to the set temperature, add the weighed amounts of TBC and Zanba into the machine. Then using a high speed smashing machine, grind the Zanba stir-fried TBC into powder. Next, weigh two grams of Zanba stir-fried TBC powder in a conical flask.To the sample in the flask, add three milliliters of ammonia solution followed by 50 milliliters of a mixture of isopropyl alcohol and ethyl acetate, having a volume ratio of one is to one. After recording the weight of the conical flask with the contents, ultrasonicate the TBC sample for 30 minutes at 220 volts and 40 kilohertz maintaining a temperature below 25 degrees Celsius. Weigh the conical flask with the sample once again after the ultrasonic extraction.Make up for the lost weight by adding the isopropyl alcohol and ethyl acetate mixture mentioned previously, and filter the sample solution. Evaporate 25 milliliters of the filtrate to dryness using a rotary evaporator at 40 degrees Celsius. Then dissolve the residue in five milliliters of a solution of 0.05 hydrochloric acid in methanol.Filter the solution through a 0.2 micron syringe filter, and analyze it by performing high performance liquid chromatography, or HPLC. Calculate the contents of the MDA and DDAs in different processing products according to the standard curve. Calculate the comprehensive score based on the results via the critic method.Following the method demonstrated above, compare the amounts of Zanba, processing temperatures, and times for processing technology optimization. The results of the single factor tests revealed that the comprehensive scores of Zanba stir-fried TBC were highest when the sliced thickness is two centimeters, the amount of Zanba is three times, the processing temperature is 120 degrees Celsius, and the processing time is 60 minutes. The results revealed the range of slicing thickness, amount of Zanba, processing temperature, and processing time to be used for future experiments.

Preparazione del campione di tiebangchui (TBC) Zanba-Stir-Fried per l'ottimizzazione della tecnologia di elaborazione

Scoperta di biomarcatori non invasivi per la proteomica lacrimale mediante LC-MS

A Protein Suspension-Trapping Sample Preparation for Tear Proteomics by Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

Tear fluid is one of the easily accessible biofluids that can be collected non-invasively. Tear proteomics has the potential to discover biomarkers for several ocular diseases and conditions. The suspension trapping column has been reported to be an efficient and user-friendly sample preparation workflow for the broad application of downstream proteomic analysis. Yet, this strategy has not been well-studied in the analysis of human tear proteome. The present protocol describes an integrated workflow from clinical human tear samples to purified peptides for non-invasive tear protein biomarker research using mass spectrometry, which provides insights into disease biomarkers and monitoring when combined with bioinformatics analysis. A protein suspension trapping sample preparation was applied and demonstrated the discovery of tear proteome with fast, reproducible, and user-friendly procedures, as a universal, optimized sample preparation for human tear fluid analysis. In particular, the suspension trapping procedure outperformed in-solution sample preparation in terms of peptide recovery, protein identification, and shorter sample preparation time.

Autore in primo piano: Avanzamento dell'analisi del fluido lacrimale utilizzando un protocollo standardizzato per la ricerca proteomica 

This protocol describes a method for collecting tear samples using Schirmer strips and an integrated quantitative workflow for discovering non-invasive tear protein biomarkers. The suspension trapping sample preparation workflow enables fast and robust tear sample preparation and mass spectrometric analysis, resulting in higher peptide recovery yields and protein identification than standard in-solution procedures.

Una preparazione del campione di intrappolamento della sospensione proteica per la proteomica lacrimale mediante cromatografia liquida-spettrometria di massa tandem

Tear fluid is one of the easily accessible biofluids that can be collected non-invasively. Tear proteomics has the potential to discover biomarkers for ...