Questo protocollo consente la valutazione delle interazioni cellula-cellula tra diversi tipi di cellule all'interno di un tessuto e manipolazioni molecolari e farmacologiche ex vivo che sarebbero meno fattibili in vivo. Il principale vantaggio di questa tecnica è il lungo periodo di tempo in cui queste sezioni tissutali potrebbero essere mantenute in coltura consentendo la loro valutazione in periodi di tempo successivi. Questa tecnica consentirà uno screening più rapido dei composti terapeutici per correggere i danni alla ghiandola salivare e probabilmente ridurrà il numero di topi utilizzati per questi studi.
Abbiamo in programma di utilizzare questa tecnica per comprendere la risposta della ghiandola salivare alla radioterapia nei punti intermedi e per accendere e spegnere i geni a intervalli specifici. L'aspetto più difficile di questa procedura è il sessamento dei tessuti e la prevenzione della perdita di sezioni tissutali durante la coltura e le fasi di colorazione. Prima di iniziare la procedura disinfettare i componenti del vibratomo staccabili con 70%etanolo, seguiti dalla sterilizzazione UV per almeno 30 minuti.
Fissare un foglio aggiuntivo di pellicola di laboratorio sul vassoio tampone per evitare che il ghiaccio cada e riempire la camera di ghiaccio con ghiaccio frantumato. Rimuovere la pellicola da laboratorio dal vassoio tampone e riempire il vassoio tampone con 100 millilitri di PBS ghiacciato integrati con 1%penicillina streptomicina ampicillina, o PSA. Quindi posizionare una lama di rasoio in acciaio inossidabile nel supporto della lama e utilizzare un cacciavite per facilitare la regolazione dell'angolo della lama.
Dopo aver isolato le ghiandole salivari, posizionare il tessuto raccolto in un piatto sterile da coltura di 30 millimetri contenente due millilitri di PBS ghiacciato integrato con 1%PSA. Utilizzando le forcelle autoclavate, trasferire le ghiandole sul fondo dello stampo incorporante e coprire il tessuto con agarosio liquido a basso punto di fusione del 3%. Usando le forcelle, regolare il tessuto al centro del blocco nel piano appropriato e posizionare il blocco di agarosio sul ghiaccio per 10 minuti.
Quando l'agarosio si è indurito, eseguire con cura una lama di rasoio attorno al bordo esterno dello stampo e lasciare che il blocco scivoli sul film di laboratorio sterilizzato dai raggi UV. Utilizzare la lama del rasoio per tagliare una scatola di agarosio contenente la ghiandola salivare, facendo attenzione che il piano di sezione sia dritto e parallelo al lato opposto del blocco. Utilizzare la supercolla per fissare il blocco alla superficie di taglio e ottenere sezioni spesse 50 o 90 micrometri sul vibratomo a una velocità di 0,075 millimetri al secondo a una frequenza di 100 hertz.
Quindi utilizzare una spazzola per capelli naturale autoclavata per trasferire le sezioni in singoli pozzi di un piatto di coltura tissutale di 24 pozzetti contenente un millilitro di PBS ghiacciato per così come sono ottenuti. Una volta acquisite tutte le sezioni, utilizzare e autoclavare micro spatola per trasferire le sezioni in singoli inserti di membrana pour size da 0,4 micrometri in ogni pozzo di una piastra di coltura tissutale di 24 po 'contenente 300 microlitri di mezzo di coltura del vibratomo per pozzo. Quindi posizionare la piastra in un incubatore di anidride carbonica di 37 gradi Celsius e 5% con umidità, rinfrescando il mezzo nella parte inferiore di ogni pozzo e aggiungendo 40 microlitri di mezzo agli inserti della membrana a giorni diversi se necessario per un massimo di 30 giorni.
Per irradiare i tessuti, trasferire le sezioni all'impianto di irradiatore in un contenitore coperto di polistirolo per evitare fluttuazioni di temperatura e trattare le sezioni con un'unica dose di radiazioni di cinque gradi. Quindi riportare le colture in un incubatore di coltura tissutale sicuro per le radiazioni. Per la colorazione degli anticorpi delle sezioni tissutali, lavare i campioni con almeno due lavaggi di cinque minuti in PBS sterile e fissare le sezioni in paraformaldeide al 4% a quattro gradi Celsius durante la notte.
La mattina successiva lavare le sezioni tre volte con PBS integrato con albumina di siero bovino all'1% e 0,1%Triton X-100, o PBT, prima di permeabilizzare i tessuti con 0,3%Triton X-100 in PBS per 30 minuti. Lavare le sezioni tre volte in PBT come dimostrato prima di bloccare qualsiasi legame non specifico con agente bloccante integrato con siero di capra normale all'1% per un'ora. Quindi incubare le sezioni durante la notte nell'anticorpo primario appropriato di interesse.
Immagini al microscopio a campo brillante di colture primarie di sezione di ghiandola salivare 2D rivelano la presenza di tessuti vitali per un massimo di 30 giorni di coltura sotto tutte le concentrazioni di completamento del siero testato. La capacità proliferativa di queste fette coltivate rappresentative è stata valutata dall'immunostaining Ki-67 e questo marcatore è stato osservato in ogni momento valutato. Un basso livello di cellule positive di Caspasi-3 scisto è stato osservato in tutti i punti di tempo con un piccolo aumento rilevato al giorno 30.
La colorazione dell'e-cadherina è stata osservata sia nelle fette di ghiandola sottomandibolare che in quello parotido durante il periodo di coltura di 30 giorni. Cellule positive all'actina muscolare liscia e organizzazione citoscheletricha sono state rilevate a livelli simili durante tutto il periodo di coltura. Allo stesso modo, sono state rilevate anche proteine funzionali come l'amilasi e l'acquaporina-5, anche se al giorno 14 la colorazione sembrava essere più granulare.
Al contrario, CD31 e TUBB3 non sono stati costantemente espressi durante tutto il periodo della coltura in entrambe le ghiandole, suggerendo che vi sia una diversità di costituenti tissutali mantenuti per diversi periodi di tempo durante il periodo di coltura di 30 giorni. Le fette irradiate in entrambe le ghiandole imitavano simili cambiamenti proliferativi apoptotici e citoscheletrici osservati in vivo. Fare attenzione quando si spostano le sezioni dal bagno PBS nel vibratomo alla piastra di coltura e durante le procedure di colorazione in quanto le sezioni sono piccole e delicate.
Le colture di sezione possono essere trattate con la maggior parte dei metodi di coltura della linea cellulare con l'ulteriore vantaggio di essere in condizioni più strettamente correlate all'in vivo. Prevediamo che questa sarà una tecnica potente per altri ricercatori da incorporare nei loro esperimenti. La lama sul vibratomo è affilata e può essere difficile da inserire, quindi sii stanco durante la manipolazione.
Anche il colorante blu trypan è tossico e cancerogeno, quindi segui tutte le linee guida pp.
