Supportato da National Institutes of Health di sovvenzione R01EY018144.

1. Produzione, ripiegamento, e Purificazione HPLC di Holo-RBP <ol><li> Trasforma BL-21cells con il vettore pET3a ospitare il cDNA per RBP umano con la sua etichetta 6x sulla N-terminale. Crescono le trasformate BL-21 celle in un agitatore a 37 ° C in media ml 40 LB con carbenicillina fino OD a 600 nm raggiunge 0,5. Indurre l&#39;espressione della proteina RBP con l&#39;aggiunta di 1 mM IPTG a. Crescere i batteri a 37 ° C un altro 5 ore. </li><li> RBP prodotto in E. coli è presente soprattutto nei corpi di inclusione insolubili. Per arricchire corpi inclusi, cellule pellet a 10.000 xg per 20 min. Seguito da sonicazione le cellule su ghiaccio in 5 ml di PBS con inibitori della proteasi, seguiti da 2 cicli di gelo e disgelo. Pellet giù i corpi di inclusione a 20.000 xg per 30 min a 4 ° C. Rimuovere il surnatante e mantenere il pellet in ghiaccio. </li><li> Solubilizzare l&#39;inclusione corpo pellet per sonicazione in 10 ml 7,5 M guanidina cloridrato. Aggiungere un volume di mezzo (5 ml) di tampone Tris 25 mM, pH 9,0 e DTT ad una finale concentration di 10 mM. Agitare vigorosamente soluzione in un vortex per una notte a temperatura ambiente per ridurre completamente e denaturare le proteine. </li><li> Centrifugare la soluzione proteica per rimuovere il materiale insolubile a 18.000 xg per 20 min a 4 ° C. Dopo la rotazione, trasferire il surnatante in una nuova provetta e posizionare il tubo in ghiaccio. </li><li> Preparare quattro volumi (60 ml) di tampone di ripiegatura (25 mM Tris, pH 9,0, 0,3 mM cistina, cisteina 3,0 mM, EDTA 1 mM). Degassare il buffer ripiegatura. Preparare anche 600 microlitri 10 mM in etanolo retinolo sotto fioca luce rossa. Conservare al buio in ghiaccio. Sia la soluzione tampone di ripiegamento e retinolo devono essere preparati al momento. </li><li> Raffreddare sia la soluzione proteica e il buffer ripiegamento su ghiaccio per almeno 30 min. Temperature più alte riduce probabilmente la qualità della ripiegato RBP. Aggiungere 1 ml di tampone di ripiegamento goccia a goccia e 10 ul di soluzione retinolo, mentre a sua volta soluzione proteica è vigorosamente miscelato in un becher su ghiaccio. Ripetere questa operazione fino a quando tutti buffer di ripiegamento e retinolovengono aggiunti. Tenere agitazione la reazione in ghiaccio, al buio per 5 ore. </li><li> Centrifugare la reazione di ripiegatura a 24.000 xg per 30 min a 4 ° C. È essenziale eliminare gli aggregati subito dopo la reazione di ripiegatura. </li><li> Concentrare la soluzione supernatante utilizzando Amicon Ultra 15 concentratore (MWCO 10 K) a circa 10 ml. Non concentrare la soluzione ripiegato più di questo livello. Concentrarsi troppo porterà alla aggregazione proteica e riduce la resa finale e la qualità della RBP correttamente piegato. Diluire il campione concentrato con PBS freddo a 100 ml. Lo scopo di questa fase è quello di rimuovere i componenti della reazione di ripiegatura che interferiscono con la purificazione nickel. </li><li> Centrifugare la soluzione ancora una volta a 24.000 xg per 20 min a 4 ° C. È importante rimuovere qualsiasi precipitato. Trasferire il supernatante in due provette da 50 ml, ciascuna contenente 1 ml di Ni-NTA slurry che è stato lavato con PBS. Ruotare le provette a 4 ° C per un&#39;ora. Incubazione f una soluzione diluita dio 1 hr può causare la precipitazione di proteine ​​mal ripiegate che devono essere rimossi. </li><li> Centrifugare le provette a 500 xg per 3 min. Rimuovere il surnatante con attenzione. Galleggiante Tutto deve essere rimosso. Aggiungere PBS freddo a 30 ml per ciascun tubo. Filare di nuovo e rimuovere il surnatante. Ripetere questo processo fino a quando non vedi nulla, ma perle nel tubo. </li><li> Trasferire la resina Ni-NTA ad una colonna vuota. Lavare resina con 20 volumi di colonna di imidazolo 10 mM, NaCl 500 mM in PBS. Eluire His-RBP in 5 volumi di colonna di 100 mM imidazolo in PBS. Non conservare questa soluzione per un periodo prolungato di tempo, e congelamento riduce la resa e la qualità finale. Per ottenere risultati ottimali, RBP purificare mediante HPLC immediatamente. </li><li> Dializza His-RBP purificato dalla resina Ni-NTA contro 25 mM Tris, pH 8,4, e 120 mM NaCl. Un concentratore può essere utilizzato anche per lo scambio di buffer. Campioni chiari per HPLC mediante centrifugazione a 16.000 xg per 10 min a 4 ° C a destra prima di ogni corsa. </li><li> Purificare holo-RBP su HPLC utilizzando uno ioneColonna di scambio AX-300 da un gradiente di NaCl passo (220 mM 12 min, 360 mM 15 min, e 1.000 mm 15 min) con 25 mM Tris, pH 8,4 come fase mobile ad 1 ml / min. Con l&#39;aumento della concentrazione di NaCl, holo-His-RBP viene rilasciato mentre apo-RBP e misfolded RBP rimanere legato alla colonna (Figura 1). Se refolding RBP non avviene in modo ottimale, misfolded RBP (es misfolded RBP-I in Figura 1) può predominare l&#39;intera preparazione. </li><li> Ripristinare il corretto piegato olo-RBP dalle frazioni di picco a 360 mM di NaCl. Monitorare attentamente il profilo di eluizione correttamente piegato e misfolded His-RBP. A partire da 1000 mM di NaCl, la maggior parte di misfolded His-RBP dovrebbero essere liberati. </li><li> Le frazioni contenenti holo-RBP sono riunite, concentrate, e dializzata contro PBS a 4 ° C. Verificare la resa finale e la qualità (330 nm/280 nm) da spettrofotometro. Prodotto correttamente piegati dovrebbe avere un rapporto nm/280 330 nm di poco superiore a 1 (Figura 1). </li><li> Per produzionee apo-RBP, aggiungere un volume uguale di eptano al purificato olo-RBP e mescolare delicatamente ruotando la notte a 4 ° C. Centrifugare a 16.000 g per 10 min a 4 ° C e trasferire accuratamente la fase acquosa inferiore in una nuova provetta (evitando il precipitato all&#39;interfaccia). Ripetere il processo per tre volte con una incubazione per 3 ore ciascuno. Controllare l&#39;assorbimento di uno spettrofotometro Nanodrop per assicurarsi che il picco di 330 nm è scesa al livello di fondo. </li></ol> 2. Monitoraggio in tempo reale di STRA6 catalizzata Retinolo rilascio e Retinolo Caricamento in corso <ol><li> Bloccare un nero 96 pozzetti Microfluor-2 piastra (Thermo Scientific) con 200 pl di Blocker Casein (Pierce) notte a 4 ° C per prevenire il bloccaggio aspecifica di holo-RBP alla plastica. Blocker caseina dà l&#39;effetto migliore blocco dei tutte le soluzioni di blocco che abbiamo testato. </li><li> Membrane preparate da cellule esprimenti STRA6 o cellule di controllo sono lavate con PBS e attraverso una siringa Hamilton (GastiGHT # 1710) 6 volte per produrre una sospensione uniforme in PBS. Usiamo tipicamente membrane derivati ​​da 1/100 a 1/20 di cellule cresciute su un piatto di 100 mm per reazione. </li><li> Lavare i pozzetti della Microfluor-2 piastra una volta con 200 microlitri di PBS. Raffreddare la piastra sul ghiaccio prima aggiunta di sospensione di membrana (50 microlitri per pozzetto). </li><li> Monitoraggio in tempo reale di retinolo fluorescenza viene misurata con l&#39;ottica di fluorescenza della Omega Polarstar (BMG Labtech) con il 320EX filtro di eccitazione e il filtro per le emissioni 460-10. Il programma è impostato sulla modalità di lettura Endpoint. La modalità piastra può anche essere usato per misurare il corso di tempo se gli intervalli temporali non sono variati. Il segnale proveniente da ciascun punto di tempo è la media di 10 misurazioni (media orbitale con un diametro di 2 mm) e il guadagno è impostato a 1.800. La piastra viene agitata per 10 secondi a 500 giri al minuto con doppia agitazione orbitale prima di ogni misurazione. </li><li> Per iniziare l&#39;analisi retinolo rilascio, i pozzetti vengono letti una sola volta con l&#39;endpoint di lettura mode prima olo-RBP (tipicamente 1 pM concentrazione finale) viene aggiunto a 0 min. Appena olo-RBP viene aggiunta, la reazione viene monitorata continuamente ogni 5-10 minuti per 1-3 ore. Per avviare il saggio retinolo carico, all-trans retinolo (tipicamente 1 pM concentrazione finale) viene aggiunto ai pozzetti in fioca luce rossa. La piastra viene letta una volta prima apo-RBP viene aggiunto a 0 min. Appena apo-RBP viene aggiunto, la reazione viene monitorata continuamente ogni 5-10 minuti per 1-3 ore. </li><li> Dopo che tutte le misurazioni vengono effettuate, scaricare i dati grezzi (ad esempio mostrato in Figura 2) dal software Omega Data Analysis (BMG Labtech) in Microsoft Excel per l&#39;analisi dei dati. Ciascun punto di tempo genera un file che contiene le letture di tutte le condizioni sperimentali. Ad esempio, se ci sono 20 punti di tempo, consolidare i 20 file in un unico file di Excel per l&#39;analisi dei dati. </li><li> Per l&#39;analisi dei dati, i segnali di fluorescenza prima dell&#39;aggiunta di retinolo o holo-RBP a 0 min sono considerati segnali di fondo und sottratti dai segnali finali fluorescenza a tutti i tempi. Sebbene i segnali di fondo sono bassi rispetto alla fluorescenza in retinolo olo-RBP, sottraendo il fondo elimina l&#39;influenza aspecifica di dispersione della luce dalle membrane e permette di concentrarsi sulla fluorescenza retinolo di holo-RBP o retinolo aggiunta a 0 min. </li></ol> 3. Monitoraggio in tempo reale di STRA6 catalizzata da trasporto di retinolo da Holo-RBP a CRBP-I <ol><li> Retinolo-EGFP è un nuovo trasferimento di risonanza di fluorescenza (FRET), coppia che è stata recentemente istituita 41. STRA6-catalizzata trasporto retinolo da olo-RBP per EGFP-CRBP-I è monitorata in tempo reale misurando retinolo-EGFP FRET. EGFP-CRBP-I proteina di fusione con 6XHis tag (EGFP-CRBP-I) viene prodotto in cellule di mammifero e viene purificata su resina Ni-NTA prima dell&#39;esperimento. EGFP-CRBP-I possono essere memorizzati in PBS con inibitori della proteasi per un breve periodo di tempo a 4 ° C. Alternativamente la proteina di fusione is congelati in -80 ° C in piccole aliquote. </li><li> Prima che le reazioni, preparare una bloccato Microfluor-2 piastra e membrane come descritto sopra. Lavare i pozzetti della piastra Microfluor-2 una volta con 200 microlitri di PBS prima dell&#39;aggiunta di sospensione di membrana (50 microlitri per pozzetto). </li><li> In tempo reale retinolo-EGFP FRET è misurata utilizzando Polarstar Omega con l&#39;eccitazione 320EX filtro e i filtri di emissione 460-10 e 510-10 con simultanei duello di emissione ottica di fluorescenza. Il programma è impostato sulla modalità di lettura Endpoint. La modalità piastra può anche essere usato per misurare il corso di tempo se gli intervalli temporali non sono variati. Il segnale proveniente da ciascun punto di tempo è la media di 10 misurazioni (media orbitale con un diametro di 2 mm) e il guadagno è impostato a 1800 per canale. La piastra viene agitata per 10 secondi a 500 giri al minuto con doppia agitazione orbitale prima di ogni misurazione. </li><li> Per avviare le reazioni, EGFP-CRBP-I (tipicamente 1 pM concentrazione finale) viene aggiunto ai pozzetti. La piastra viene letta sullace si utilizza la modalità di lettura Endpoint prima olo-RBP è aggiunto a 0 min. Appena olo-RBP viene aggiunta, la reazione viene monitorata continuamente dalla misurazione ogni 5-10 minuti per 1-2 ore. </li><li> Dopo tutte le misurazioni vengono effettuate, scaricare i dati grezzi (esempio mostrato in Figura 3) dal software Omega analisi dei dati per Microsoft Excel per l&#39;analisi dei dati come descritto sopra. </li><li> Retinolo-EGFP FRET è calcolata la variazione dinamica del rapporto delle accettore / donatore picchi di emissione 47. L&#39;equazione 41 per calcolare questo rapporto è [(510 t -510 b) / (460 t -460 b)], dove t 510, 510 b, t 460, e 460 b rappresentano le emissioni a 510 nm dopo l&#39;inizio della reazione ( t = tempo di punto), a 510 nm prima retinolo o olo-RBP viene aggiunto (b = sfondo), a 460 nm dopo l&#39;inizio della reazione (tempo t = punto), ed a 460 nm prima retinolo o olo-RBP viene aggiunto (b = sfondo), rispettivamente. </li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Condividiamo qui un protocollo ottimizzato di produzione RBP perché RBP procedure di produzione e di purificazione sono fondamentali per la generazione di RBP correttamente piegato. Data la possibilità di specie RBP misfolded e la presenza di tracce di proteine ​​batteriche anche in HPLC purificato batteri-RBP prodotte, è utile utilizzare RBP nativa da siero per confermare una conclusione relativa a RBP. RBP urina, che è disponibile in commercio, è una miscela complessa di molte specie di RBP tra apo-RBP e olo-...

La vitamina A è una molecola organica che è essenziale per la sopravvivenza umana e il corretto funzionamento di quasi tutti gli organi umani. Derivati ​​della vitamina A (retinoidi) partecipare a diversi eventi biochimici e cellulari tra cui il rilevamento della luce per 1,2 visione e la regolazione dell&#39;espressione genica e della traduzione di proteine ​​durante lo sviluppo embrionale e nei tessuti adulti 3-6. Sebbene retinolo ha la capacità di diffondere sistemica, evoluzione avvicinò con proteine ​​plasmatiche retinolo legante, una proteina carrier specifico per la vitamina A trasporto nel sangue per ottenere alta efficienza e specificità e per evitare la tossicità associata con diffusione casuale 7-10. Un recettore ad alta affinità che si lega alla RBP e riprende vitamina A è stato ipotizzato nel 1970 11-13. Nonostante le prove accumulate in tre decenni l&#39;esistenza del recettore RBP 14-31, l&#39;ipotesi del recettore è stata discussa per molti anni a causa della existence di una definizione errata di olo-RBP. La corretta definizione di holo-RBP è che è l&#39;alta affinità complesso 1:1 fra retinolo e RBP. Estrazione ripetuta di olo-RBP di solvente organico è necessario per la produzione di apo-RBP. Questa definizione è utilizzata da quasi tutti i laboratori che studiano RBP 7,9,32-35 o il recettore RBP 14-31,36-42. La definizione errata di olo-RBP, che è stato utilizzato per confutare l&#39;esistenza del recettore RBP è la miscela acuta di retinolo libero con apo-RBP. Poiché la funzione del recettore RBP di vitamina A assorbimento da olo-RBP è quello di rilasciare retinolo da olo-RBP, il recettore RBP avrebbe giocato alcun ruolo nella captazione retinolo se retinolo è libero di cominciare (come proposto dalla definizione errata di holo -RBP). La recente identificazione del recettore RBP come una proteina di dominio multitransmembrane chiamato STRA636 e la sua funzione di assorbimento di vitamina A da olo-RBP 36-43 sostiene con forza contro l&#39;ipotesi che RBP nonbisogno di un recettore per fornire vitamina A. dettagliate analisi ha rivelato che STRA6 ha 9 domini transmembrana con l&#39;N-terminale extracellulare e situati C-terminale situati intracellularmente 40. Situato tra transmembrana 6 e 7 è un dominio di legame essenziale RBP 39. STRA6 è accoppiato sia LRAT e CRBP-I di vitamina A assorbimento da olo-RBP, ma né LRAT né CRBP-I è assolutamente necessaria per una maggiore attività STRA6 41. STRA6 capacità di catalizzare rilascio retinolo da olo-RBP è la chiave per la sua attività di assorbimento di vitamina A 41. Facendo affidamento su STRA6 per rilasciare il suo retinolo, vitamina A consegna entro il RBP in grado di trasportare la vitamina A per colpire le cellule nei tessuti periferici, con elevata specificità ed efficienza. L&#39;importanza cruciale di olo-RBP definizione e la preparazione è dimostrata non solo dal dibattito storico sulla esistenza del recettore RBP, ma anche da tre documenti relativi recenti basate su olo-RBP definizioni difdifferenti dalla definizione originale e corretta 44-46. Il primo documento utilizzato l&#39;olo-RBP definizione che è stato utilizzato per disapprovare l&#39;esistenza del recettore RBP per studiare il recettore RBP 44. I documenti secondo e terzo avvicinò con una terza definizione di holo-RBP che ha reso ancora meno probabile per retinolo essere studiati per formare un complesso con adeguata RBP 45,46. Questi studi preparato tre H-retinol/RBP mescolando olo-RBP (nemmeno apo-RBP) con 3 H-retinolo. Poiché questo dosaggio non ha avuto 3 H-retinol/RBP formata e non rimuovere eventuale eccessivo 3 H-retinolo 45,46, non è un saggio per 3 H-retinolo assorbimento da 3 H-retinol/RBP, ma è un libero 3 H-retinolo diffusione dosaggio. E &#39;stato dimostrato in precedenza che STRA6 non aumenta l&#39;assorbimento cellulare di retinolo libero da LRAT 38 o CRBP-I 41. Praticamente tutti retinolo è associato RBP nel sangue e non vi è rilevabile free retinolo. Una delle principali funzioni del recettore RBP è catalizzare rilascio retinolo da olo-RBP durante l&#39;assorbimento retinolo da olo-RBP 41. Se il retinolo è artificialmente rilasciato o è in forma libera per cominciare 45,46, il recettore RBP non è necessaria. I risultati notevolmente diversi ottenuti dal test gratuito diffusione retinolo rispetto alle analisi basate su preparato correttamente olo-RBP dimostrano che una corretta preparazione di RBP è di fondamentale importanza per i suoi saggi funzionali. RBP può essere purificata da siero umano 41, ma il procedimento è complesso e la resa è bassa. Un approccio alternativo è quello di produrre RBP in E. coli. Perché E. coli non ha la capacità di piegamento corretto mammiferi proteine ​​secrete con più di una coppia di legami disolfuro come RBP, è essenziale RBP ripiegare e purificare la proteina correttamente ripiegata. Proteine ​​mal ripiegate non solo si comportano diversamente da correggere RBP piegato in vari metodi,ma anche causare aggregazione di proteine ​​durante la conservazione. Per la stessa ragione, apo-RBP viene prodotta solo da alta qualità olo-RBP. Descriviamo qui un protocollo ottimizzato per la produzione di RBP di alta qualità 100% loaded con retinolo attraverso l&#39;espressione batterica, ripiegamento, e la purificazione HPLC. Purificazione HPLC non solo rimuove RBP piegato in modo non corretto, ma anche significativa la contaminazione batterica che può causare artefatti gravi se RBP è utilizzato in saggi di trasduzione del segnale. Abbiamo anche descrivere due sensibili in tempo reale tecniche di monitoraggio per lo studio dei trasporti retinolo STRA6. Entrambe le tecniche dipendono RBP alta qualità. Per motivi di spazio, le tecniche classiche di vitamina radioattivo a base di retinoidi e HPLC-based A dosaggi di assorbimento non sono descritte qui.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente / materiale </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> guanidina cloridrato </td><td> EMD </td><td> 5010 </td><td></td></tr><tr><td> cistina </td><td> Sigma </td><td> C8755 </td><td></td></tr><tr><td> cisteina </td><td> Sigma </td><td> C7352 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Pescatore </td><td> BP118-500 </td><td></td></tr><tr><td> Tris </td><td> Pescatore </td><td> 7786-1 </td><td></td></tr><tr><td> DTT </td><td> EMD </td><td> 3860 </td><td></td></tr><tr><td> retinolo </td><td> Sigma </td><td> R7632 </td><td></td></tr><tr><td> carbenicillina </td><td> Pescatore </td><td> BP2648-5 </td><td></td></tr><tr><td> IPTG </td><td> EMD </td><td> 5810 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> EMD </td><td> 6508 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Pescatore </td><td> BP358-10 </td><td></td></tr><tr><td> Ni-NTA </td><td> Qiagen </td><td> 1018244 </td><td></td></tr><tr><td> imidazolo </td><td> EMD </td><td> 5720 </td><td></td></tr><tr><td> eptano </td><td> EMD </td><td> HX0295-1 </td><td></td></tr><tr><td> Blocker caseina </td><td> Perforare </td><td> 37528 </td><td></td></tr><tr><td> Amicon Ultra 15 concentratore (MWCO10 K) </td><td> Millipore </td><td> UFC901024 </td><td></td></tr><tr><td> Microfluor-2 Piastra </td><td> Pescatore </td><td> 14-245-177 </td><td></td></tr><tr><td> Hamilton siringa a tenuta di gas # 1710 </td><td> Pescatore </td><td> 14-824-655 </td><td></td></tr></tbody></table>

real-time analyses of retinol transport by the membrane receptor of plasma retinol binding protein

La vitamina A è essenziale per la visione e la crescita / differenziazione di quasi tutti gli organi umani. Plasma Retinol Binding Protein (RBP), è il principio e il supporto specifico di vitamina A nel sangue. Qui si descrive una tecnica ottimizzata per produrre e purificare olo-RBP e due in tempo reale tecniche di monitoraggio per studiare il trasporto di vitamina A per il recettore ad alta affinità RBP STRA6. La prima tecnica permette di produrre una grande quantità di alta qualità holo-RBP (100%-caricato con retinolo) per la vitamina A saggi trasporto. RBP di alta qualità è essenziale per saggi funzionali perché misfolded RBP comunicati vitamina A contaminazione batterica prontamente e in preparazione RBP può causare artefatti. In tempo reale, come le tecniche di monitoraggio elettrofisiologico hanno dato un contributo critico agli studi di trasporto di membrana. Il recettore-mediata RBP trasporto retinolo non è stato analizzato in tempo reale fino a poco tempo. La seconda tecnica qui descritta è la ragionel analisi in tempo STRA6-catalizzata rilascio retinolo o il carico. La terza tecnica è analisi in tempo reale di STRA6 catalizzata da trasporto retinolo da olo-RBP di proteina cellulare che si lega al retinolo (CRBP-I). Queste tecniche offrono l&#39;elevata sensibilità e risoluzione nel rivelare recettore della vitamina RBP di un meccanismo di assorbimento.

Presentiamo qui i risultati rappresentativi per olo-RBP produzione e purificazione mediante HPLC (Figura 1), analisi in tempo reale di STRA6 catalizzata rilascio retinolo da olo-RBP e carico retinolo in apo-RBP (Figura 2) e analisi in tempo reale di STRA6-catalizzata retinolo trasporto da olo-RBP per EGFP-CRBP-I (Figura 3). Senza ripiegamento, RBP prodotta in batteri è quasi completamente misfolded per la presenza di numerosi legami disolfu...

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Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein

Qui si descrive una tecnica ottimizzata per la produzione di alta qualità di vitamina A / complesso RBP e due in tempo reale tecniche di monitoraggio per studiare una nave da trasporto vitamina da STRA6, il recettore RBP.

Analisi in tempo reale di Trasporti retinolo da parte del recettore di membrana di proteine ​​plasmatiche Retinol Binding

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs.  Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and ...

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Research

JoVE Journal

Biology

13.6K Views.  University of California, Los Angeles. Qui si descrive una tecnica ottimizzata per la produzione di alta qualità di vitamina A / complesso RBP e due in tempo reale tecniche di monitoraggio per studiare una nave da trasporto vitamina da STRA6, il recettore RBP.

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Measuring Plasma Membrane Protein Endocytic Rates by Reversible Biotinylation

Plasma membrane proteins are a large, diverse group of proteins comprised of receptors, ion channels, transporters and pumps.  Activity of these proteins is responsible for a variety of key cellular events, including nutrient delivery, cellular excitability, and chemical signaling.  Many plasma membrane proteins are dynamically regulated by endocytic trafficking, which modulates protein function by altering protein surface expression.  The mechanisms that facilitate protein endocytosis are complex and are not fully understood for many membrane proteins.  In order to fully understand the mechanisms that control the endocytic trafficking of a given protein, it is critical that the protein s endocytic rate be precisely measured.  For many receptors, direct endocytic rate measurements are frequently achieved utilizing labeled receptor ligands.  However, for many classes of membrane proteins, such as transporters, pumps and ion channels, there is no convenient ligand that can be used to measure the endocytic rate.  In the present report, we describe a reversible biotinylation method that we employ to measure the dopamine transporter (DAT) endocytic rate.  This method provides a straightforward approach to measuring internalization rates, and can be easily employed for trafficking studies of most membrane proteins.

Regulated endocytosis governs the cell surface expression levels of the majority of membrane proteins. Here we utilize reducible, membrane impermeant biotinylation reagents to measure the endocytic rate of the dopamine transporter (DAT), a polytopic membrane protein. The method facilitates a straightforward approach to measuring the endocytic rate of most plasma membrane proteins.

Misurazione delle proteine ​​plasmatiche Tariffe endocitico membrana da biotinilazione reversibile

Plasma membrane proteins are a large, diverse group of proteins comprised of receptors, ion channels, transporters and pumps.  Activity of these proteins ...

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Biologia

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces glucose uptake by insulin-sensitive tissues, most notably the brain, skeletal muscle, and adipocytes. Patients suffering from type-2 diabetes and/or obesity often develop insulin resistance and are unable to control their glucose homeostasis. New insights into the mechanisms of insulin resistance may provide new treatment strategies for type-2 diabetes.
The GLUT family of glucose transporters consists of thirteen members distributed on different tissues throughout the body1. Glucose transporter type 4 (GLUT4) is the major transporter that mediates glucose uptake by insulin sensitive tissues, such as the skeletal muscle. Upon binding of insulin to its receptor, vesicles containing GLUT4 translocate from the cytoplasm to the plasma membrane, inducing glucose uptake. Reduced GLUT4 translocation is one of the causes of insulin resistance in type-2 diabetes2,3.
The translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane can be visualized by immunocytochemistry, using fluorophore-conjugated GLUT4-specific antibodies.
Here, we describe a technique to quantify total amounts of GLUT4 translocation to the plasma membrane of cells during a chosen duration, using flow cytometry. This protocol is rapid (less than 4 hours, including incubation with insulin) and allows the analysis of as few as 3,000 cells or as many as 1 million cells per condition in a single experiment. It relies on anti-GLUT4 antibodies directed to an external epitope of the transporter that bind to it as soon as it is exposed to the extracellular medium after translocation to the plasma membrane.

This protocol describes a rapid technique to quantify the translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane of cells by flow cytometry.

Misurazione quantitativa della traslocazione GLUT4 sulla membrana plasmatica mediante citometria di flusso

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Biochemical Reconstitution of Steroid Receptor&#x2022;Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

Hsp90 is an essential and highly abundant molecular chaperone protein that has been found to regulate more than 150 eukaryotic signaling proteins, including transcription factors (e.g. nuclear receptors, p53) and protein kinases (e.g. Src, Raf, Akt kinase) involved in cell cycling, tumorigenesis, apoptosis, and multiple eukaryotic signaling pathways 1,2. Of these many 'client' proteins for hsp90, the assembly of steroid receptor&bull;hsp90 complexes is the best defined (Figure 1). We present here an adaptable glucocorticoid receptor (GR) immunoprecipitation assay and in vitro GR&bull;hsp90 reconstitution method that may be readily used to probe eukaryotic hsp90 functional activity, hsp90-mediated steroid receptor ligand binding, and molecular chaperone cofactor requirements. For example, this assay can be used to test hsp90 cofactor requirements and the effects of adding exogenous compounds to the reconstitution process. 
The GR has been a particularly useful system for studying hsp90 because the receptor must be bound to hsp90 to have an open ligand binding cleft that is accessible to steroid 3. Endogenous, unliganded GR is present in the cytoplasm of mammalian cells noncovalently bound to hsp90. As found in the endogenous GR&bull;hsp90 heterocomplex, the GR ligand binding cleft is open and capable of binding steroid. If hsp90 dissociates from the GR or if its function is inhibited, the receptor is unable to bind steroid and requires reconstitution of the GR&bull;hsp90 heterocomplex before steroid binding activity is restored 4 . GR can be immunoprecipitated from cell cytosol using a monoclonal antibody, and proteins such as hsp90 complexed to the GR can be assayed by western blot. Steroid binding activity of the immunoprecipitated GR can be determined by incubating the immunopellet with [3H]steroid. 
Previous experiments have shown hsp90-mediated opening of the GR ligand binding cleft requires hsp70, a second molecular chaperone also essential for eukaryotic cell viability. Biochemical activity of hsp90 and hsp70 are catalyzed by co-chaperone proteins Hop, hsp40, and p23 5. A multiprotein chaperone machinery containing hsp90, hsp70, Hop, and hsp40 are endogenously present in eukaryotic cell cytoplasm, and reticulocyte lysate provides a chaperone-rich protein source 6. 
In the method presented, GR is immunoadsorbed from cell cytosol and stripped of the endogenous hsp90/hsp70 chaperone machinery using mild salt conditions. The salt-stripped GR is then incubated with reticulocyte lysate, ATP, and K+, which results in the reconstitution of the GR&bull;hsp90 heterocomplex and reactivation of steroid binding activity 7. This method can be utilized to test the effects of various chaperone cofactors, novel proteins, and experimental hsp90 or GR inhibitors in order to determine their functional significance on hsp90-mediated steroid binding 8-11.

Biochemical Reconstitution of Steroid Receptor&amp;#x2022;Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

An in vitro method for preparing functional glucocorticoid receptor (GR)&#x2022;hsp90 protein complexes from purified proteins and cellular lysates is described. The method utilizes immunoadsorption of recombinant GR followed by salt-stripping and protein complex reconstitution. The importance of cofactors and buffer conditions are discussed, as are potential method applications.

Ricostituzione biochimica dei recettori di steroidi • Complessi proteina Hsp90 e la riattivazione del Ligand Binding

Hsp90 is an essential and highly abundant molecular chaperone protein that has been found to regulate more than 150 eukaryotic signaling proteins, ...

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing (MTT)

Our goal is to obtain a comprehensive description of molecular processes occurring at cellular membranes in different biological functions. We aim at characterizing the complex organization and dynamics of the plasma membrane at single-molecule level, by developing analytic tools dedicated to Single-Particle Tracking (SPT) at high density: Multiple-Target Tracing (MTT)1. Single-molecule videomicroscopy, offering millisecond and nanometric resolution1-11, allows a detailed representation of membrane organization12-14 by accurately mapping descriptors such as cell receptors localization, mobility, confinement or interactions.
We revisited SPT, both experimentally and algorithmically. Experimental aspects included optimizing setup and cell labeling, with a particular emphasis on reaching the highest possible labeling density, in order to provide a dynamic snapshot of molecular dynamics as it occurs within the membrane. Algorithmic issues concerned each step used for rebuilding trajectories: peaks detection, estimation and reconnection, addressed by specific tools from image analysis15,16. Implementing deflation after detection allows rescuing peaks initially hidden by neighboring, stronger peaks. Of note, improving detection directly impacts reconnection, by reducing gaps within trajectories. Performances have been evaluated using Monte-Carlo simulations for various labeling density and noise values, which typically represent the two major limitations for parallel measurements at high spatiotemporal resolution.
The nanometric accuracy17 obtained for single molecules, using either successive on/off photoswitching or non-linear optics, can deliver exhaustive observations. This is the basis of nanoscopy methods17 such as STORM18, PALM19,20, RESOLFT21 or STED22,23, which may often require imaging fixed samples. The central task is the detection and estimation of diffraction-limited peaks emanating from single-molecules. Hence, providing adequate assumptions such as handling a constant positional accuracy instead of Brownian motion, MTT is straightforwardly suited for nanoscopic analyses. Furthermore, MTT can fundamentally be used at any scale: not only for molecules, but also for cells or animals, for instance. Hence, MTT is a powerful tracking algorithm that finds applications at molecular and cellular scales.

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing MTT

Multiple-Target Tracing is a homemade algorithm developed for tracking individually labeled molecules within the plasma membrane of living cells. Efficiently detecting, estimating and tracing molecules over time at high-density provide a user-friendly, comprehensive tool to investigate nanoscale membrane dynamics.

Mappatura diffusione molecolare nella membrana plasmatica da parte di più-Target Tracing (MTT)

Our goal is to obtain a comprehensive description of molecular processes occurring at cellular membranes in different biological functions. We aim at ...

Real-time Monitoring of Ligand-receptor Interactions with Fluorescence Resonance Energy Transfer

FRET is a process whereby energy is non-radiatively transferred from an excited donor molecule to a ground-state acceptor molecule through long-range dipole-dipole interactions1. In the present sensing assay, we utilize an interesting property of PDA: blue-shift in the UV-Vis electronic absorption spectrum of PDA (Figure 1) after an analyte interacts with receptors attached to PDA2,3,4,7. This shift in the PDA absorption spectrum provides changes in the spectral overlap (J) between PDA (acceptor) and rhodamine (donor) that leads to changes in the FRET efficiency. Thus, the interactions between analyte (ligand) and receptors are detected through FRET between donor fluorophores and PDA. In particular, we show the sensing of a model protein molecule streptavidin. We also demonstrate the covalent-binding of bovine serum albumin (BSA) to the liposome surface with FRET mechanism. These interactions between the bilayer liposomes and protein molecules can be sensed in real-time. The proposed method is a general method for sensing small chemical and large biochemical molecules. Since fluorescence is intrinsically more sensitive than colorimetry, the detection limit of the assay can be in sub-nanomolar range or lower8. Further, PDA can act as a universal acceptor in FRET, which means that multiple sensors can be developed with PDA (acceptor) functionalized with donors and different receptors attached on the surface of PDA liposomes.

We demonstrate FRET between conjugated polymer polydiacetylene (PDA) and fluorophore attached to the surface of PDA liposomes for the sensing of biomolecules. PDA liposomes also contained receptor molecules on their surfaces for biomolecules to be used as probes. Ligand-receptor interactions lead to changes in the FRET efficiency between the fluorophore and PDA which is the basis of the sensing mechanism.

Monitoraggio in tempo reale delle interazioni ligando-recettore mediante Bonifico Fluorescence Resonance Energy

FRET is a process  whereby energy is non-radiatively transferred from an excited donor molecule to  a ground-state acceptor molecule through long-range ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Quantitative characterization of protein interactions is essential in practically any field of life sciences, particularly drug discovery. Most of currently available methods of KD determination require access to purified protein of interest, generation of which can be time-consuming and expensive. We have developed a protocol that allows for determination of binding affinity by microscale thermophoresis (MST) without purification of the target protein from cell lysates. The method involves overexpression of the GFP-fused protein and cell lysis in non-denaturing conditions. Application of the method to STAT3-GFP transiently expressed in HEK293 cells allowed to determine for the first time the affinity of the well-studied transcription factor to oligonucleotides with different sequences. The protocol is straightforward and can have a variety of application for studying interactions of proteins with small molecules, peptides, DNA, RNA, and proteins.

Microscale thermophoresis (MST) can be widely used for determination of binding affinity without purification of the target protein from cell lysates. The protocol involves overexpression of the GFP-fused protein, cell lysis in non-denaturing conditions, and detection of MST signal in the presence of varying concentrations of the ligand.

Protein Purification-libera Metodo di Binding Affinity Determinazione Thermophoresis microscala

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

Autonomously Bioluminescent Mammalian Cells for Continuous and Real-time Monitoring of Cytotoxicity

Mammalian cell-based in vitro assays have been widely employed as alternatives to animal testing for toxicological studies but have been limited due to the high monetary and time costs of parallel sample preparation that are necessitated due to the destructive nature of firefly luciferase-based screening methods. This video describes the utilization of autonomously bioluminescent mammalian cells, which do not require the destructive addition of a luciferin substrate, as an inexpensive and facile method for monitoring the cytotoxic effects of a compound of interest. Mammalian cells stably expressing the full bacterial bioluminescence (luxCDABEfrp) gene cassette autonomously produce an optical signal that peaks at 490 nm without the addition of an expensive and possibly interfering luciferin substrate, excitation by an external energy source, or destruction of the sample that is traditionally performed during optical imaging procedures. This independence from external stimulation places the burden for maintaining the bioluminescent reaction solely on the cell, meaning that the resultant signal is only detected during active metabolism. This characteristic makes the lux-expressing cell line an excellent candidate for use as a biosentinel against cytotoxic effects because changes in bioluminescent production are indicative of adverse effects on cellular growth and metabolism. Similarly, the autonomous nature and lack of required sample destruction permits repeated imaging of the same sample in real-time throughout the period of toxicant exposure and can be performed across multiple samples using existing imaging equipment in an automated fashion.

Mammalian cells expressing the bacterial bioluminescence gene cassette (lux) produce light autonomously. The resulting bioluminescent dynamics upon chemical exposure have been demonstrated to reflect the treatment effects on cellular growth and metabolism, making these cells an inexpensive, continuous, real-time toxicity screening tool that can easily be adapted for high-throughput automation.

Autonomamente bioluminescenti cellule di mammifero per la continua e monitoraggio in tempo reale di citotossicità

Mammalian  cell-based in vitro assays have been  widely employed as alternatives to animal testing for toxicological studies but  have been limited due to ...

Imaging Plasma Membrane Deformations With pTIRFM

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during the fusion of vesicle and plasma membranes. These rapid and localized changes are achieved by dynamic interactions between lipids and specialized proteins that control membrane curvature. The absence of such interactions would not only have devastating consequences for vesicle fusion, but a host of other cellular functions that involve control of membrane shape. In recent years, the identity of a number of proteins with membrane-shaping properties has been determined. What remains missing is a roadmap of when, where, and how they act as fusion and content release progress.
Our understanding of the molecular events that enable membrane remodeling has historically been limited by a lack of analytical methods that are sensitive to membrane curvature or have the temporal resolution to track rapid changes. PTIRFM satisfies both of these criteria. We discuss how pTIRFM is implemented to visualize and interpret rapid, submicron changes in the orientation of chromaffin cell membranes during dense core vesicle (DCV) fusion. The chromaffin cells we use are isolated from bovine adrenal glands. The membrane is stained with a lipophilic carbocyanine dye,1,1&#39;-dioctadecyl-3,3,3&#39;,3&#39;-tetramethylindodicarbocyanine, 4-chlorobenzenesulfonate, or&#160;diD. DiD intercalates in the membrane plane with a &#34;fixed&#34; orientation and is therefore sensitive to the polarization of the evanescent field. The diD-stained cell membrane is sequentially excited with orthogonal polarizations of a 561&#160;nm laser (p-pol, s-pol). A 488&#160;nm laser is used to visualize vesicle constituents and time the moment of fusion. Exocytosis is triggered by locally perfusing cells with a depolarizing KCl solution. Analysis is performed offline using custom-written software to understand how diD emission intensity changes relate to fusion pore dilation.

Polarization-based Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (pTIRFM) enables real-time detection of cell membrane dynamics. This article describes the implementation of pTIRFM for the study of membrane remodeling during regulated exocytosis. The technique is generalizable to other processes in cell biology that directly or indirectly involve changes in membrane shape.

Imaging Plasma membrana Deformazioni Con pTIRFM

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during ...

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and understanding the nature of such interactions is a central step in biological research. Surface Plasmon Resonance (SPR) is a sensitive detection technique for label-free study of bio-molecular interactions in real time. In a typical SPR experiment, one component (usually a protein, termed 'ligand') is immobilized onto a sensor chip surface, while the other (the 'analyte') is free in solution and is injected over the surface. Association and dissociation of the analyte from the ligand are measured and plotted in real time on a graph called a sensogram, from which pre-equilibrium and equilibrium data is derived. Being label-free, consuming low amounts of material, and providing pre-equilibrium kinetic data, often makes SPR the method of choice when studying dynamics of protein interactions. However, one has to keep in mind that due to the method's high sensitivity, the data obtained needs to be carefully analyzed, and supported by other biochemical methods. 
SPR is particularly suitable for studying membrane proteins since it consumes small amounts of purified material, and is compatible with lipids and detergents. This protocol describes an SPR experiment characterizing the kinetic properties of the interaction between a membrane protein (an ABC transporter) and a soluble protein (the transporter's cognate substrate binding protein).

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR

Surface Plasmon Resonance (SPR) is a label-free method for detecting bio-molecular interactions in real time. Herein, a protocol for a membrane protein:receptor interaction experiment is described, while discussing the pros and cons of the technique.

Le misurazioni in tempo reale delle Membrane Protein: recettore interazioni Uso risonanza plasmonica di superficie (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and  understanding the nature of such interactions is a central ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Green Fluorescent Protein-base Espressione Proiezione di proteine ​​di membrana in<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Analisi in tempo reale di Trasporti retinolo da parte del recettore di membrana di proteine ​​plasmatiche Retinol Binding

Analisi in tempo reale di Trasporti retinolo da parte del recettore di membrana di proteine plasmatiche Retinol Binding