Ringraziamo i membri del nostro team, in particolare Blache MC per l&#39;assistenza tecnica, nonché M Irla e B Imhof, per il sostegno e proficue discussioni. I dati relativi deflazione e il confinamento riprodotto per gentile concessione di Nature Methods. Questo progetto è sostenuto da finanziamenti istituzionali del CNRS, l&#39;INSERM e Marsiglia University, e da contributi specifici della Regione Provence-Alpes-Côte-d&#39;Azur, Institut National du Cancer, Agence Nationale de la Recherche (ANR-08-PCVI- 0034-02, ANR 2010 blan 1214 01) &amp; Fondation pour la Recherche Médicale (Equipe labélisée FRM-2009). VR è supportato da una borsa di studio per il Cancro Ligue Nationale Contre le.

In questo video, vi presentiamo un completo unico esperimento di tracciamento di particelle, utilizzando quantum-dots rivolti ad un recettore di membrana specifico. L&#39;obiettivo principale di questo esperimento consiste nel discriminare differenti tipi di comportamenti diffusione molecolare misurata nella membrana plasmatica di cellule vive. Infatti, i movimenti molecolari che derivano a livello della membrana in genere può discostarsi dalla diffusione browniano essendo linearmente diretto o confinata all&#39;interno nanodomains 26-29, per esempio. Il nostro obiettivo è contemporaneamente in seguito come molti recettori tecnicamente possibile, di fornire un&#39;istantanea della varietà risultante nelle dinamiche che si verificano all&#39;interno della membrana di una cellula dal vivo. Questo è infine previsto per consentire decifrare dei meccanismi che regolano segnalazione cellulare recettore di superficie. 1. Coltura cellulare <ol><li> Preparare il campione cellulare: utilizzare aderenti COS-7 cellule che esprimono endogenamente l&#39;epidermal growth factor receptor (EGFR) 30. Quandolavorare con le cellule vive senza antibiotici assicurarsi di non avere latente sub-contaminazione rilevabile mediante appropriate tecniche sterili in qualsiasi momento durante la preparazione. </li><li> Crescere le cellule in mezzo completo (DMEM con 10% siero di vitello, glutammina 1%, 1% HEPES e sodio piruvato 1%, vedi tabella di reagenti specifici indicati), a 37 ° C con il 7% di CO 2, avendo cura di disporre in sub-confluenti, la crescita esponenziale prima di diffondersi in Lab-Tek. </li><li> Il giorno prima dell&#39;esperimento, diffondere 5000 cellule / pozzetto a 8-ben camere (Lab-Tek) e incubare durante la notte. Contare le cellule assicura una densità costante di cella, quindi un rapporto riproducibile dei quantum-punti per cella. </li></ol> 2. Cella Labeling Preparare quantum-dots con un rivestimento specifico. Quantum-dots sono nanoparticelle fluorescenti composte da semiconduttori. Queste nanoparticelle presentano un elevato interesse perché sono molto luminosi e fotostabili rispetto alla classicasonde fluorescenti 31,32, che permette raggiungimento di un opportuno segnale di rumore (SNR) per l&#39;imaging singola molecola. <ol><li> Prima l&#39;esperimento, produrre frammenti Fab contro EGFR dalla linea cellulare di ibridoma (mAb 108, ATCC HB-9764), mediante digestione con papaina come descritto in precedenza 21. </li><li> Fab coniugato con biotina, come da istruzioni del produttore (EZ-link solfo-NHS-LC-biotinylation Kit; Thermo Scientific, Fig. 1A.). </li><li> Utilizzare quantum-dots funzionalizzati con streptavidina (Invitrogen) e che emette a 605 nm (lunghezza d&#39;onda di emissione ottimale per la brillantezza, l&#39;individuazione e separazione dal cellulare autofluorescenza). </li><li> Preparare la soluzione di etichettatura in mezzo completo (vedi tabella di reagenti specifici), per saturare i streptavidins presenti intorno alle quantistica per punti, così come per prevenire l&#39;aggregazione e legame non specifico per le cellule e il vetrino. </li><li> Preparare due soluzioni intermedie:uno con quantum-dots-streptavidina e un altro con Fab biotinilato, ciascuno a 20 nm. </li><li> Mescolare un volume uguale di queste due soluzioni: mescolare i quantum-dots con Fab in rapporto 1:1 per ottenere una concentrazione finale di lavoro di nM Fab 10: quantum-dots complessa. Utilizzo di un rapporto equimolare favorisce la formazione di complessi mono-funzionalizzati composti da uno quantum dot-e un frammento Fab biotinilato. Ciò favorisce l&#39;etichettatura monovalente, limitando le osservazioni artefatto dovuto al recettore cross-linking 33,34. </li><li> Incubare per 15 minuti a 25 ° C, usando un agitatore a 1200 giri al minuto per prevenire l&#39;aggregazione. La miscela è quindi pronto per l&#39;uso in cellule viventi. </li><li> Incubare le cellule in 100 pl di miscela per 5 minuti a 37 ° C con il 7% CO 2. </li><li> Lavare le cellule con non-autofluorescente mezzo di imaging (tampone HBSS, 1% HEPES, vedere tabella di reagenti specifici) preriscaldata a 37 ° C. </li><li> Rimuovere con cura l&#39;eccesso di etichette per impedire l&#39;necessario rovinare il SNR da non legato, fuori fuoco quantum-dots, ampiamente da lavare ogni pozzetto con una media di imaging, di solito 5 volte a temperatura ambiente, con almeno 5 minuti di ritardo prima che l&#39;ultimo lavaggio. </li></ol> 3. Setup Optical Il video-microscopia installazione si compone di quattro parti principali: <ol><li> Un microscopio invertito con un cubo specifico fluorescenza (FF01-457/50 eccitazione, FF495-DI02 dicroico e FF01-617/73 filtri di emissione, Semrock) e un&#39;apertura numerico ad elevata (1.3 o 1.49) ad immersione in olio obiettivo 100x. </li><li> Una lampada a mercurio da 100 W (accoppiato al microscopio attraverso una fibra ottica, evitando interferenze con termoregolazione). </li><li> Una sensibilità di 512 x 512 pixel di altezza EMCCD fotocamera per ottenere una sufficiente SNR. </li><li> Un incubatore di mantenere i campioni biologici a 37 ° C durante l&#39;esperimento. </li></ol> 4. Acquisizione <ol><li> Selezionare le celle isolate e ben diffusa. Questofavorisce l&#39;estensione di Nizza, lamellipodia piatto, più adatto a cercare il movimento planare di molecole di membrana. </li><li> Valutare lo stato fisiologico cellulare, per il suo aspetto, sia in luce trasmessa e in fluorescenza: traffico vescicolare intenso, l&#39;assenza di segni necrotiche o apoptotiche, autofluorescenza bassa e medio-forte quantum-dot etichettatura (di solito fino a 1.000 quantum-dots per cella, vedere Fig. 1B, C). </li><li> Selezionare un alta densità di etichettatura, che è critica per monitorare simultaneamente i recettori quante più possibile. Questo è effettivamente limitato sia dalla fisiologica (espressione di superficie, accessibilità epitopo, movimento laterale) e parametri algoritmici (senza sovrapposizioni point-spread funzioni (PSF), anche tenendo conto sfocatura dovuta al movimento, per consentire una corretta rilevazione e riconnessione). </li><li> Per ogni cella, prima acquisire un&#39;immagine campo campo chiaro (preferibilmente utilizzando DIC, se disponibile) che consentono di verificare ulteriormente l&#39;aspetto delle cellulee limiti spaziali della lamellipodia. </li><li> Salva questa immagine utilizzando lo stesso nome come il video-stack (come ad esempio cell1.tif &amp; cell1.stk per esempio), in una sotto-cartella denominata DIC, dal momento che, con queste convenzioni, l&#39;algoritmo può automaticamente ritrovare l&#39;immagine corrispondente per ogni pila. </li><li> Acquisire video da 1 a 3 per cella, in continuo, tipicamente a 36 ms rate, il più rapido tasso ottenibile in full frame con questa fotocamera. Tuttavia si può acquisire a frequenze più elevate, fino a 1-ms frequenza, utilizzando CCD dedicato con sensibilità e / o meno pixel. Il frame-trasferimento di tecnologia fornisce ritardo trascurabile tra i fotogrammi. </li><li> Valorizzazione moltiplicano Electron dovrebbe sempre essere impostato al massimo (appena al di sotto di saturazione, se del caso) per consentire di raggiungere sensibilità unica molecola, con una sufficiente SNR, almeno superiore a 20 dB (per un efficace rilevamento di picco 1), tipicamente intorno 25-30 dB. </li><li> Tipicamente acquisire 300 fotogrammi al video, il peccatotraiettorie ce sono ricostruiti oltre ~ 100 frames in media, per lo più limitate da lunghi eventi lampeggianti. Video frequenza e la lunghezza può essere adattata per una data misura, che potrebbe richiedere più tracce per esempio. </li></ol> 5. Analisi MTT <ol><li> Selezionare il percorso della directory contenente i file video per valutare un dataset dato con Matlab o Octave. </li><li> Per avviare l&#39;analisi completamente automatizzato 1,35, digitare il comando detect_reconnex23 in Octave, o MTT23i in Matlab. Questo programma sta per &quot;versione 2.3, con interfaccia utente&quot; ed è disponibile per il download, insieme con la precedente versione 2.2. Si prima visualizza una interfaccia grafica che elenca tutti i parametri utilizzati, come mostrato in fig. 2. </li></ol> 6. Risultati rappresentativi MTT analizza automaticamente ogni video recorder, per fornire le tracce degli obiettivi individuati e stimati, integrati da ulteriorevestigations, come il rilevamento confinamento. Questo permette in ultima analisi, tracce di mappatura sulle immagini delle cellule (Fig. 1C e 3). Descrizione MTT L&#39;analisi MTT nucleo viene eseguita su ogni frame, invocando 3 compiti principali (Fig. 3): <ol><li> Rilevazione della presenza o assenza di un bersaglio (quantum dot-), scorrevole entro una sub-regione successivamente centrata attorno ad ogni pixel, dove sono confrontati due ipotesi: presenza sia di un segnale, con la PSF modellizzato come una bi-dimensionale gaussiana picco , o solo il rumore, con una soglia di allarme basso assicurando abbastanza falso, con meno di un riconoscimento spurio per fotogramma. Questo porta ad una mappa di probabilità di rivelazione. Ogni massimo locale viene considerato come un bersaglio putativo, assicurando che il suo livello di probabilità è superiore ad un valore minimo, impostato in base alla probabilità di falso allarme desiderata (PFA). Tale limite è fissato abbastanza basso di discriminare in modo efficiente SIGNalles dal rumore, evitando nel migliore dei rilevamenti spurie (PFA di 10 -6 per impostazione predefinita, per assicurare meno di un errore in 512 x 512 pixel le immagini), pur consentendo una probabilità sufficientemente elevata di rilevazione, raggiungendo il predetto teoricamente uno ottimale. Si noti che l&#39;esigenza di utilizzare un sub-regione implica che i bordi dell&#39;immagine (3 pixel, per una finestra predefinita di 7 x 7 pixel) non può essere valutato. </li><li> Stima, per ciascun bersaglio rilevato, dei parametri rilevanti, come sub-pixel posizione e l&#39;intensità di segnale. Per ogni obiettivo individuato, uno dei minimi quadrati di Gauss-Newton fit è accanto eseguita per stimare la posizione, la larghezza e l&#39;altezza del rilevato gaussiana. Questo fornisce in particolare la sub-pixel posizione del colorante (10 a 20 nm precisione per valori tipici SNR e coloranti immobili o lentamente diffusore, aumentando fino a circa 100 nm per coloranti diffondenti a 0,1 um 2 / s). </li><li> Riconnessione dei nuovi obiettivi con latracce già costruito nei fotogrammi precedenti. L&#39;insieme di nuovi bersagli è abbinato con la serie di tracce precedenti. Per questo scopo, al fine di assegnare ciascun bersaglio a una traccia, se possibile, tutte le informazioni disponibili statistiche ottenuto dalla fase di rilevamento viene utilizzato, non solo la posizione, ma anche l&#39;intensità, larghezza, lampeggiante e statistiche associate. Di conseguenza, gli obiettivi non sono solo assegnate al più vicino traccia: in caso di tracce che attraversano, intensità, velocità, larghezza e lampeggianti saranno prese in considerazione. Questo fornisce il punteggio riconnessione statisticamente ottimale. Questa strategia evita, quando possibile, di polarizzazione la riconnessione verso i vicini più prossimi. </li></ol> Picchi rilevati a posteriori può essere respinta se la loro stima o la riconnessione non riesce. Un test speciale gestisce l&#39;individuazione di nuovi picchi, che avrebbe avviato nuove tracce. Questo test utilizza un più spinto PFA (10 -7), poiché riconnessione un picco di una traccia può essere interpretato come un de facto o convalida<html> f la sua rilevanza (questo criterio essendo per definizione non si applica per i nuovi picchi). Traiettoria Analisi Possibile confinamento transitoria è prossima valutato da una funzione inversamente proporzionale alla diffusione locale 24-29. L&#39;applicazione di una soglia permette di definire confinato o meno episodi. Iterando questi su tutte le tracce, si può mappare membrana dinamica, in termini di confinamento transitoria / rallentare eventi. Questo può essere alternativamente rappresentato utilizzando il binario o valori discreti di questo indice confinamento. Per impostazione predefinita, esegue automaticamente MTT tali compiti, risparmiando 8 parametri di picco in un file di testo: numero di telaio, i e j posizione, intensità del segnale, il raggio, offset e lampeggia, per ogni fotogramma video (gruppo di 7 righe) e trace (colonna) . Questi parametri di output possono essere ricaricati in Matlab o Octave usando lo script fread_data_spt per ulteriori analisi delle tracce cioè o intensità di segnale, come esemplificato nella<html> &quot;Http://www.jove.com/files/ftp_upload/3599/MTT_example.txt&quot;&gt; script MTT_example in appendice. Ulteriori analisi portare a mappare le tracce su ciascuna cella (Fig. 1C e 3) e di fornire l&#39;istogramma della distribuzione dei parametri rilevanti (come intensità di punta, SNR o valori di diffusione locali). Per ogni file, media e deviazione standard di ogni parametro vengono salvate in un file di testo, insieme con l&#39;immagine degli istogrammi. Distribuzioni logaritmiche, come per spostamenti quadrati r 2, portare a media geometrica. Il coefficiente di diffusione D è calcolato da un fit lineare nel corso dei primi cinque punti della curva MSD. Questi valori forniscono una panoramica di un esperimento che coinvolge per esempio cinetica di reazioni cellulari o trattamenti farmaceutici / enzimatica che riguardano l&#39;organizzazione della membrana. Dal momento che MTT è un codice open-source, questo aspetto può essere facilmente adattato a qualsiasi indagine dedicata. 599fig1.jpg &quot;alt =&quot; Figura 1 &quot;/&gt; Figura 1. Monitoraggio recettori di membrana dinamica di MTT. (A) componenti di membrana, quali il EGFR, sono contrassegnati con i punti quantici accoppiati a frammenti Fab biotinilati (disegno schematico con scala approssimativamente corretta di ogni molecola). (B) Tipica immagine fluorescente acquisito da un live cellule COS-7, con 36 ms tempo di esposizione, raffiguranti diffrazione limitata picchi corrispondenti al recettore singolarmente etichettati. (C) Output dell&#39;analisi MTT mostra le traiettorie ricostituiti dei recettori ricoperti sull&#39;immagine brightfield della cella. <img src="/files/ftp_upload/3599/3599fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Parametri di ingresso MTT. Esecuzione MTT23i apre una interfaccia utente grafica che elenca tutti i parametri di input, i nomi ei valori di default, come descritto nella nostra precedente pubblicazione 1. Nei parametri dell&#39;algoritmo, spazio e tempo (Windows Search, raggio di picco, la massima diffusione<html> e lampeggiante) sono adimensionali in unità standard, pixel e cornici. Calibrazioni può essere applicato a posteriori per convertire i risultati di uscita. I valori di default, corrispondente ad un 512BFT Cascade con ingrandimento 100x, sono pixel size: 156 nm / pxl e il ritardo dei fotogrammi: 36 ms / frame. Gli investigatori dovrebbero ottimizzare alcuni parametri critici, come il massimo coefficiente di diffusione previsto (&quot;Diff max&quot;) e massima scomparsa lampeggiante (&quot;T off&quot;). Questi due limiti di spazio e tempo sono quasi gli unici che devono essere riesaminate in una data condizione sperimentale, gli altri vengono impostati su valori predefiniti robusti. Ad esempio, il numero di falsi allarmi è direttamente impostato per assicurare meno di un errore per milione di pixel, quindi, meno di uno per fotogramma, che è soddisfacente in molti casi. Tutti i parametri vengono salvati in un file di testo nella cartella di output, consentendo agli utenti di verificare a posteriori che le impostazioni sono state utilizzate per l&#39;analisi. s/ftp_upload/3599/3599fig3.jpg &quot;alt =&quot; Figura 3 &quot;/&gt; Figura 3. Grandi passi dell&#39;analisi MTT. Partire da una pila sperimentale di immagini di fluorescenza, picchi vengono sequenzialmente e rilevate automaticamente, stimato mediante un accoppiamento gaussiana e ricollegato più fotogrammi (prima gamma di operazioni, parte superiore del diagramma). Tracce può essere ulteriormente analizzati per confinamento putativo, per esempio, portando in definitiva a una mappa dinamica di descrittori pertinenti (seconda gamma di operazioni, parte inferiore). <img src="/files/ftp_upload/3599/3599fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Valenza etichettatura non ha alcun impatto MTT. Per valutare la possibile distorsione introdotta da artefatti etichettatura polivalente, l&#39;analisi MTT è stata effettuata per tenere traccia EGFR endogena codificate usando 2 diversi regimi, per generare e analizzare mappe di traiettorie. (A) recettori sono stati etichettati con biotinilato Fab e quantum-dots605-streptavidina, come descritto nel protocollo.In questo caso, il multi-valenza dei quantum-streptavidins punti e può provocare accoppiamento diversi recettori di un singolo colorante. (B) recettori sono stati etichettati con Fab direttamente accoppiato ad un colorante organico, Atto647N. In questo caso, un Fab, un recettore di conseguenza, possono essere accoppiati a più di un colorante. (C) Media quadrato spostamento (MSD) curva è stata calcolata per tutte le tracce per ogni cella, marcato sia con quantum-dot o coloranti ATTO (grafici a destra ea sinistra, rispettivamente). Coefficienti di diffusione sono stati calcolati dal fit lineare nel corso dei cinque primi punti della MSD (linea rossa tratteggiata). Ogni schema di etichettatura ha portato alla diffusione dei valori simili (grafico centrale). Qdot: quantum-dots605 (n = 5 celle), Atto: Atto647N (n = 7 cellule), NS: non significativo (Student t-test valore di p&gt; 0,05).

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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+tracking:+effects+of+corrals.">Single-particle tracking: effects of corrals.</a> Biophys. J. 69, 389-398 (1995).</li><li>Serge, A., Fourgeaud, L., Hemar, A., Choquet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+activation+and+homer+differentially+control+the+lateral+mobility+of+metabotropic+glutamate+receptor+5+in+the+neuronal+membrane.">Receptor activation and homer differentially control the lateral mobility of metabotropic glutamate receptor 5 in the neuronal membrane.</a> J. Neurosci. 22, 3910-3920 (2002).</li><li>Simson, R., Sheets, E. D., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+temporary+lateral+confinement+of+membrane+proteins+using+single-particle+tracking+analysis.">Detection of temporary lateral confinement of membrane proteins using single-particle tracking analysis.</a> Biophys. J. 69, 989-993 (1995).</li><li>Jacobson, K., Dietrich, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Looking+at+lipid+rafts.">Looking at lipid rafts.</a> Trends Cell Biol. 9, 87-91 (1999).</li><li>Kusumi, A., Sako, Y., Yamamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confined+lateral+diffusion+of+membrane+receptors+as+studied+by+single+particle+tracking+(nanovid+microscopy).+Effects+of+calcium-induced+differentiation+in+cultured+epithelial+cells.">Confined lateral diffusion of membrane receptors as studied by single particle tracking (nanovid microscopy). Effects of calcium-induced differentiation in cultured epithelial cells.</a> Biophys. J. 65, 2021-2040 (1993).</li><li>Livneh, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+deletions+in+the+cytoplasmic+kinase+domain+of+the+epidermal+growth+factor+receptor+do+not+affect+its+laternal+mobility.">Large deletions in the cytoplasmic kinase domain of the epidermal growth factor receptor do not affect its laternal mobility.</a> J. Cell Biol. 103, 327-331 (1986).</li><li>Medintz, I. L., Uyeda, H. T., Goldman, E. R., Mattoussi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantum+dot+bioconjugates+for+imaging,+labelling+and.">Quantum dot bioconjugates for imaging, labelling and.</a> 4, 435-446 (2005).</li><li>Wu, X., Bruchez, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+cellular+targets+with+semiconductor+quantum+dot+conjugates.">Labeling cellular targets with semiconductor quantum dot conjugates.</a> Methods Cell Biol. 75, 171-183 (2004).</li><li>Mohammadi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aggregation-induced+activation+of+the+epidermal+growth+factor+receptor+protein+tyrosine+kinase.">Aggregation-induced activation of the epidermal growth factor receptor protein tyrosine kinase.</a> Biochemistry. 32, 8742-8748 (1993).</li><li>Howarth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monovalent,+reduced-size+quantum+dots+for+imaging+receptors+on+living+cells.">Monovalent, reduced-size quantum dots for imaging receptors on living cells.</a> Nat. Methods. 5, 397-399 (2008).</li><li>Bertaux, N., Marguet, D., Rigneault, H., Serg&#233;, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple-target+tracing+(MTT)+algorithm+probes+molecular+dynamics+at+cell+surface.">Multiple-target tracing (MTT) algorithm probes molecular dynamics at cell surface.</a> Protocol Exchange. , (1038).</li><li>Groc, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+trafficking+of+neurotransmitter+receptor:+comparison+between+single-molecule/quantum+dot+strategies.">Surface trafficking of neurotransmitter receptor: comparison between single-molecule/quantum dot strategies.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 12433-12437 (2007).</li><li>Cui, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+at+a+time,+live+tracking+of+NGF+axonal+transport+using+quantum+dots.">One at a time, live tracking of NGF axonal transport using quantum dots.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 13666-13671 (2007).</li><li>He, H. T., Marguet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+nanodomains+in+living+cell+membrane+by+fluorescence+correlation+spectroscopy.">Detecting nanodomains in living cell membrane by fluorescence correlation spectroscopy.</a> Annu. Rev. Phys. Chem. 62, 417-436 (2011).</li><li>Cebecauer, M., Spitaler, M., Serge, A., Magee, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signalling+complexes+and+clusters:+functional+advantages+and+methodological+hurdles.">Signalling complexes and clusters: functional advantages and methodological hurdles.</a> J. Cell. Sci. 123, 309-320 (2010).</li><li>Kao, H. P., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+of+single+fluorescent+particles+in+three+dimensions:+use+of+cylindrical+optics+to+encode+particle+position.">Tracking of single fluorescent particles in three dimensions: use of cylindrical optics to encode particle position.</a> Biophys. J. 67, 1291-1300 (1994).</li></ol>

Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

In una singola particella di monitoraggio, oltre agli aspetti cellulari e microscopia, l&#39;analisi rappresenta una parte sostanziale del lavoro. Questo risolve l&#39;algoritmo utilizzato per eseguire le tre compiti principali: rilevazione, stima e ricollegando i picchi su ogni frame. Ma l&#39;aspetto conseguente di questo lavoro risiede nell&#39;elaborazione lo stesso algoritmo, che potrebbe essere necessario essere adattato per qualsiasi nuova inchiesta dedicata, essenzialmente per gli ultimi, i passaggi aggiuntivi (...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Quantità </td></tr><tr><td> Cos-7 linea cellulare </td><td> ATCC </td><td> CRL-1651 </td><td> 5000 cellule / pozzetto </td></tr><tr><td> HBSS senza Ca 2 + </td><td> GIBCO </td><td> 14175 </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> 0,05% tripsina EDTA </td><td> GIBCO </td><td> 25300 </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> 8-ben Lab-tek </td><td> NUNC </td><td> 155441 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> QDot-605 streptavidina </td><td> Invitrogen </td><td> Q10101MP </td><td> 20 mM </td></tr><tr><td colspan="4"> Fab biotinilato (per la sintesi Fab, vedere il riferimento 21) </td></tr><tr><td> Fab da mAb 108 </td><td> ATCC </td><td> HB-9764 </td><td> 200 pg </td></tr><tr><td> NHS-Biotina<html></td><td> Thermo Scientific </td><td> 21435 </td><td> 18,5 mcg </td></tr><tr><td colspan="4"> Completa media </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> GIBCO </td><td> 41965 </td><td> 500 ml </td></tr><tr><td> Siero fetale bovino </td><td> SIGMA </td><td> F7524 </td><td> 50 ml </td></tr><tr><td> L-Glutammina </td><td> GIBCO </td><td> 25030 </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> GIBCO </td><td> 15630 </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> Sodio piruvato </td><td> GIBCO </td><td> 11360 </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td colspan="4"> Imaging media </td></tr><tr><td> HBSS con Ca 2 + </td><td> GIBCO </td><td> 14025 </td><td> 25 ml </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> GIBCO </td><td> 15630 </td><td> 250 pl </td></tr></tbody></table>1 &quot;&gt; <tbody><tr><td> Attrezzatura </td><td> Azienda </td><td> Riferimento </td></tr><tr><td> Microscopio invertito </td><td> Nikon </td><td> Eclipse TE2000U </td></tr><tr><td> Lampada fluorescente </td><td> Nikon </td><td> Intensilight C-HGFIE </td></tr><tr><td> 1,3 NA obiettivo 100x </td><td> Nikon </td><td> Pianificare Fluor 1,30 </td></tr><tr><td> 1,49 NA obiettivo 100x </td><td> Nikon </td><td> APO TIRF 1,49 </td></tr><tr><td> Macchina fotografica </td><td> Roper Scientific </td><td> Cascade 512 B </td></tr><tr><td> Box termostatato </td><td> Vita Imaging Servizi </td><td> The Box </td></tr></tbody></table> Appendice: Script esempio di analisi supplementari MTT Funzione MTT_example (file_name) %% Sulla base esempi che mostrano come recuperare i risultati di output MTT %%% Per tracciare ogni trace per la costruzione e l&#39;istogramma %%% Di intensità di fluorescenza se nargin &lt;1% non file_name fornito? file = dir (&#39;* STK.&#39;); se IsEmpty (files), disp (&#39;nessun dato in corrente dir&#39;), di ritorno, fine . file_name = file (1) nome, default%: primo file stk disp ([&#39;utilizzando&#39; file_name &#39;di default&#39;]) fine file_param = [file_name &#39;_tab_param.dat&#39;];% del file di output %% Di carico di dati cd (&#39;output23&#39;)% o (&#39;output22&#39;), in base alla versione utilizzata % Disclaimer: versione 2.2 genera solo 7 parametri, % Un parametro aggiuntivo, il rumore, è stato aggiunto nella versione 2.3 % Per leggere tutti i parametri in una volta, in una singola tabella Tab_param% = fread_all_param (file_param); % Tab_i = tab_param (2:08: fine, :); tab_j = ... % Per leggere tutti i parametri (ad eccezione frame_number) in tabelle separate % [Tab_i, tab_j, tab_alpha, tab_radius, tab_offset, tab_blk, tab_noise] = fread_all_data_spt (file_param); tab_i = fread_data_spt (file_param, 3); indice è del 3% perché il numero di traccia e numero di telaio, non informativo, vengono scartate! tab_j = fread_data_spt (file_param, 4); tab_alpha = fread_data_spt (file_param, 5); tab_blk = fread_data_spt (file_param, 8); % Loop% su tracce N_traces size = (tab_i, 1); Le tabelle sulla N_traces sono linee di colonne N_frames per ITRC = 1: N_traces No_blk_index = tab_blk (ITRC, :)&gt; 0; sulla procedura non solo lampeggianti plot (tab_i (ITRC, No_blk_index), tab_j (ITRC, No_blk_index)) &amp; Nbsp; xlabel (&#39;i (pixel)&#39;), ylabel (&#39;j (pixel)&#39;) title ([&#39;trace #&#39; num2str (ITRC)]) disp (&#39;Si prega di premere un tasto per la traccia successiva&#39;), pausa fine % Istogramma% Fluo N_datapoints = sum (tab_blk (:)&gt; 0); sulla procedura non solo lampeggianti hist (tab_alpha (tab_blk&gt; 0), 2 * sqrt (N_datapoints))% con 2sqrt (N) bidoni xlabel (&#39;intensità (au)&#39;), ylabel (&#39;presenza&#39;) titolo (&#39;istogramma dell&#39;intensità di fluorescenza particelle&#39;)

mapping molecular diffusion in the plasma membrane by multiple-target tracing (mtt)

Il nostro obiettivo è quello di ottenere una descrizione completa dei processi molecolari che si verificano a membrane cellulari in diverse funzioni biologiche. Il nostro obiettivo è di caratterizzare la complessa organizzazione e le dinamiche della membrana plasmatica a livello di singola molecola, mediante lo sviluppo di strumenti analitici dedicati al Single-Particle Tracking (SPT) ad alta densità: Multipli-Target Tracing (MTT) 1. Singola molecola videomicroscopia, offrendo millisecondo e la risoluzione nanometrica 1-11, consente una rappresentazione dettagliata di organizzazione della membrana 12-14 mappare con precisione da descrittori quali la localizzazione delle cellule recettori, la mobilità, parto o interazioni. Abbiamo rivisitato SPT, sia sperimentalmente che algoritmicamente. Aspetti sperimentali incluso ottimizzare la configurazione e l&#39;etichettatura delle cellule, con particolare attenzione al raggiungimento della densità di etichettatura più alto possibile, al fine di fornire una fotografia dinamica di dinamica molecolare unos avviene all&#39;interno della membrana. Problemi algoritmici in questione ogni passo utilizzare per la ricostruzione delle traiettorie: picchi di rilevazione, la stima e la riconnessione, affrontato da specifici strumenti di analisi delle immagini 15,16. Implementazione deflazione dopo che il rilevamento consente picchi di salvataggio inizialmente nascosta da vicini, i picchi più forti. Da notare, migliorando il rilevamento influisce direttamente riconnessione, la riduzione delle lacune all&#39;interno di traiettorie. Le prestazioni sono state valutate con simulazioni Monte-Carlo per la densità e l&#39;etichettatura diversi valori di rumorosità, che in genere rappresentano i due principali limiti per le misure parallele ad alta risoluzione spazio-temporale. La precisione nanometrica 17 ottenuta per singole molecole, utilizzando successive on / off o photoswitching ottica non lineare, in grado di fornire osservazioni esaustive. Questa è la base di metodi nanoscopia 17 come STORM 18, PALM 19,20, RESOLFT 21 o STED 22,23, which possono spesso richiedere campioni di immagini fisse. Il compito centrale è l&#39;individuazione e la stima dei picchi di diffrazione limitata provenienti dalle singole molecole. Quindi, fornendo adeguati presupposti, quali la gestione di un costante precisione di posizione invece del moto browniano, MTT è semplicemente adatto per le analisi nanoscopica. Inoltre, MTT possono fondamentalmente essere utilizzato in qualsiasi scala: non solo per le molecole, ma anche per cellule o animali, per esempio. Quindi, MTT è un algoritmo di rilevamento potente che trova applicazioni su scala molecolare e cellulare.

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Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing MTT

Multiple-bersaglio tracciatura è un algoritmo casalingo sviluppato per il monitoraggio singolarmente molecole marcate nella membrana plasmatica di cellule viventi. In modo efficiente la rilevazione, la stima e la rintracciabilità nel tempo molecole ad alta densità fornire una user-friendly, strumento completo per studiare la dinamica della membrana su scala nanometrica.

Mappatura diffusione molecolare nella membrana plasmatica da parte di più-Target Tracing (MTT)

Our goal is to obtain a comprehensive description of molecular processes occurring at cellular membranes in different biological functions. We aim at ...

mapping-molecular-diffusion-plasma-membrane-multiple-target-tracing

Research

JoVE Journal

Biology

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing (MTT)

17.1K Views.  Parc scientifique de Luminy. Multiple-bersaglio tracciatura è un algoritmo casalingo sviluppato per il monitoraggio singolarmente molecole marcate nella membrana plasmatica di cellule viventi. In modo efficiente la rilevazione, la stima e la rintracciabilità nel tempo molecole ad alta densità fornire una user-friendly, strumento completo per studiare la dinamica della membrana su scala nanometrica.

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Measuring Near Plasma Membrane and Global Intracellular Calcium Dynamics in Astrocytes

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, increasing evidence suggests that astrocytes may also actively participate in brain function through functional interactions with neurons.  However, many fundamental aspects of astrocyte biology remain controversial, unclear and/or experimentally unexplored. One important issue is the dynamics of intracellular calcium transients in astrocytes. This is relevant because calcium is well established as an important second messenger and because it has been proposed that astrocyte calcium elevations can trigger the release of transmitters from astrocytes. However, there has not been any detailed or satisfying description of near plasma membrane calcium signaling in astrocytes. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy is a powerful tool to analyze physiologically relevant signaling events within about 100 nm of the plasma membrane of live cells. Here, we use TIRF microscopy and describe how to monitor near plasma membrane and global intracellular calcium dynamics almost simultaneously. The further refinement and systematic application of this approach has the potential to inform about the precise details of astrocyte calcium signaling. A detailed understanding of astrocyte calcium dynamics may provide a basis to understand if, how, when and why astrocytes and neurons undergo calcium-dependent functional interactions.

We describe how to measure near membrane and global intracellular calcium dynamics in cultured astrocytes using total internal reflection and epifluorescence microscopy.

Misura Vicino membrana plasmatica e Global Dynamics calcio intracellulare negli astrociti

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, ...

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Biologia

Measuring Plasma Membrane Protein Endocytic Rates by Reversible Biotinylation

Plasma membrane proteins are a large, diverse group of proteins comprised of receptors, ion channels, transporters and pumps.  Activity of these proteins is responsible for a variety of key cellular events, including nutrient delivery, cellular excitability, and chemical signaling.  Many plasma membrane proteins are dynamically regulated by endocytic trafficking, which modulates protein function by altering protein surface expression.  The mechanisms that facilitate protein endocytosis are complex and are not fully understood for many membrane proteins.  In order to fully understand the mechanisms that control the endocytic trafficking of a given protein, it is critical that the protein s endocytic rate be precisely measured.  For many receptors, direct endocytic rate measurements are frequently achieved utilizing labeled receptor ligands.  However, for many classes of membrane proteins, such as transporters, pumps and ion channels, there is no convenient ligand that can be used to measure the endocytic rate.  In the present report, we describe a reversible biotinylation method that we employ to measure the dopamine transporter (DAT) endocytic rate.  This method provides a straightforward approach to measuring internalization rates, and can be easily employed for trafficking studies of most membrane proteins.

Regulated endocytosis governs the cell surface expression levels of the majority of membrane proteins. Here we utilize reducible, membrane impermeant biotinylation reagents to measure the endocytic rate of the dopamine transporter (DAT), a polytopic membrane protein. The method facilitates a straightforward approach to measuring the endocytic rate of most plasma membrane proteins.

Misurazione delle proteine ​​plasmatiche Tariffe endocitico membrana da biotinilazione reversibile

Plasma membrane proteins are a large, diverse group of proteins comprised of receptors, ion channels, transporters and pumps.  Activity of these proteins ...

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces glucose uptake by insulin-sensitive tissues, most notably the brain, skeletal muscle, and adipocytes. Patients suffering from type-2 diabetes and/or obesity often develop insulin resistance and are unable to control their glucose homeostasis. New insights into the mechanisms of insulin resistance may provide new treatment strategies for type-2 diabetes.
The GLUT family of glucose transporters consists of thirteen members distributed on different tissues throughout the body1. Glucose transporter type 4 (GLUT4) is the major transporter that mediates glucose uptake by insulin sensitive tissues, such as the skeletal muscle. Upon binding of insulin to its receptor, vesicles containing GLUT4 translocate from the cytoplasm to the plasma membrane, inducing glucose uptake. Reduced GLUT4 translocation is one of the causes of insulin resistance in type-2 diabetes2,3.
The translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane can be visualized by immunocytochemistry, using fluorophore-conjugated GLUT4-specific antibodies.
Here, we describe a technique to quantify total amounts of GLUT4 translocation to the plasma membrane of cells during a chosen duration, using flow cytometry. This protocol is rapid (less than 4 hours, including incubation with insulin) and allows the analysis of as few as 3,000 cells or as many as 1 million cells per condition in a single experiment. It relies on anti-GLUT4 antibodies directed to an external epitope of the transporter that bind to it as soon as it is exposed to the extracellular medium after translocation to the plasma membrane.

This protocol describes a rapid technique to quantify the translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane of cells by flow cytometry.

Misurazione quantitativa della traslocazione GLUT4 sulla membrana plasmatica mediante citometria di flusso

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are implicated in a multitude of malfunctions and diseases. However, a structural and functional understanding of membrane proteins is strongly lagging behind that of their soluble partners, mainly, due to difficulties associated with their solubilization and generation of diffraction quality crystals. Crystallization in lipidic mesophases (also known as in meso or LCP crystallization) is a promising technique which was successfully applied to obtain high resolution structures of microbial rhodopsins, photosynthetic proteins, outer membrane beta barrels and G protein-coupled receptors. In meso crystallization takes advantage of a native-like membrane environment and typically produces crystals with lower solvent content and better ordering as compared to traditional crystallization from detergent solutions. The method is not difficult, but requires an understanding of lipid phase behavior and practice in handling viscous mesophase materials. Here we demonstrate a simple and efficient way of making LCP and reconstituting a membrane protein in the lipid bilayer of LCP using a syringe mixer, followed by dispensing nanoliter portions of LCP into an assay or crystallization plate, conducting pre-crystallization assays and harvesting crystals from the LCP matrix. These protocols provide a basic guide for approaching in meso crystallization trials; however, as with any crystallization experiment, extensive screening and optimization are required, and a successful outcome is not necessarily guaranteed.

The protocols describe the essential steps for obtaining diffraction quality crystals of a membrane protein starting from reconstitution of the protein in a lipidic cubic phase (LCP), finding initial conditions with LCP-FRAP pre-crystallization assays, setting up LCP crystallization trials and harvesting crystals.

Cristallizzazione delle proteine ​​di membrana lipidica in Mesophases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs. Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and specific carrier of vitamin A in the blood. Here we describe an optimized technique to produce and purify holo-RBP and two real-time monitoring techniques to study the transport of vitamin A by the high-affinity RBP receptor STRA6. The first technique makes it possible to produce a large quantity of high quality holo-RBP (100%-loaded with retinol) for vitamin A transport assays. High quality RBP is essential for functional assays because misfolded RBP releases vitamin A readily and bacterial contamination in RBP preparation can cause artifacts. Real-time monitoring techniques like electrophysiology have made critical contributions to the studies of membrane transport. The RBP receptor-mediated retinol transport has not been analyzed in real time until recently. The second technique described here is the real-time analysis of STRA6-catalyzed retinol release or loading. The third technique is real-time analysis of STRA6-catalyzed retinol transport from holo-RBP to cellular retinol binding protein I (CRBP-I). These techniques provide high sensitivity and resolution in revealing RBP receptor's vitamin A uptake mechanism.

Here we describe an optimized technique to produce high-quality vitamin A/RBP complex and two real-time monitoring techniques to study vitamin A transport by STRA6, the RBP receptor.

Analisi in tempo reale di Trasporti retinolo da parte del recettore di membrana di proteine ​​plasmatiche Retinol Binding

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs.  Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and ...

Easy Measurement of Diffusion Coefficients of EGFP-tagged Plasma Membrane Proteins Using k-Space Image Correlation Spectroscopy

Lateral diffusion and compartmentalization of plasma membrane proteins are tightly regulated in cells and thus, studying these processes will reveal new insights to plasma membrane protein function and regulation. Recently, k-Space Image Correlation Spectroscopy (kICS)1&#160;was developed to enable routine measurements of diffusion coefficients directly from images of fluorescently tagged plasma membrane proteins, that avoided systematic biases introduced by probe photophysics. Although the theoretical basis for the analysis is complex, the method can be implemented by nonexperts using a freely available code to measure diffusion coefficients of proteins. kICS calculates a time correlation function from a fluorescence microscopy image stack after Fourier transformation of each image to reciprocal (k-) space. Subsequently, circular averaging, natural logarithm transform and linear fits to the correlation function yields the diffusion coefficient. This paper provides a step-by-step guide to the image analysis and measurement of diffusion coefficients via kICS.
First, a high frame rate image sequence of a fluorescently labeled plasma membrane protein is acquired using a fluorescence microscope. Then, a region of interest (ROI) avoiding intracellular organelles, moving vesicles or protruding membrane regions is selected. The ROI stack is imported into a freely available code and several defined parameters (see Method section) are set for kICS analysis. The program then generates a &#34;slope of slopes&#34; plot from the k-space time correlation functions, and the diffusion coefficient is calculated from the slope of the plot. Below is a step-by-step kICS procedure to measure the diffusion coefficient of a membrane protein using the renal water channel aquaporin-3 tagged with EGFP as a canonical example.

This paper provides a step by step guide to the fluctuation analysis technique k-Space Image Correlation Spectroscopy (kICS) for measuring diffusion coefficients of fluorescently labeled plasma membrane proteins in live mammalian cells.

Facile Misura di diffusione Coefficienti di EGFP-tagged plasma proteine ​​di membrana Uso k-spazio Spettroscopia di correlazione Immagine

Lateral diffusion and compartmentalization of plasma membrane proteins are tightly regulated in cells and thus, studying these processes will reveal new ...

Imaging Plasma Membrane Deformations With pTIRFM

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during the fusion of vesicle and plasma membranes. These rapid and localized changes are achieved by dynamic interactions between lipids and specialized proteins that control membrane curvature. The absence of such interactions would not only have devastating consequences for vesicle fusion, but a host of other cellular functions that involve control of membrane shape. In recent years, the identity of a number of proteins with membrane-shaping properties has been determined. What remains missing is a roadmap of when, where, and how they act as fusion and content release progress.
Our understanding of the molecular events that enable membrane remodeling has historically been limited by a lack of analytical methods that are sensitive to membrane curvature or have the temporal resolution to track rapid changes. PTIRFM satisfies both of these criteria. We discuss how pTIRFM is implemented to visualize and interpret rapid, submicron changes in the orientation of chromaffin cell membranes during dense core vesicle (DCV) fusion. The chromaffin cells we use are isolated from bovine adrenal glands. The membrane is stained with a lipophilic carbocyanine dye,1,1&#39;-dioctadecyl-3,3,3&#39;,3&#39;-tetramethylindodicarbocyanine, 4-chlorobenzenesulfonate, or&#160;diD. DiD intercalates in the membrane plane with a &#34;fixed&#34; orientation and is therefore sensitive to the polarization of the evanescent field. The diD-stained cell membrane is sequentially excited with orthogonal polarizations of a 561&#160;nm laser (p-pol, s-pol). A 488&#160;nm laser is used to visualize vesicle constituents and time the moment of fusion. Exocytosis is triggered by locally perfusing cells with a depolarizing KCl solution. Analysis is performed offline using custom-written software to understand how diD emission intensity changes relate to fusion pore dilation.

Polarization-based Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (pTIRFM) enables real-time detection of cell membrane dynamics. This article describes the implementation of pTIRFM for the study of membrane remodeling during regulated exocytosis. The technique is generalizable to other processes in cell biology that directly or indirectly involve changes in membrane shape.

Imaging Plasma membrana Deformazioni Con pTIRFM

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ concentration. To do this, mitochondria utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester Ca2+. The influx of Ca2+ into the mitochondria stimulates three rate-limiting dehydrogenases of the citric acid cycle, increasing electron transfer through the oxidative phosphorylation (OXPHOS) complexes. This stimulation maintains &#916;&#936;m, which is temporarily dissipated as the positive calcium ions cross the mitochondrial inner membrane into the mitochondrial matrix.
We describe here a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using confocal microscopy. By permeabilizing the cells, mitochondrial Ca2+ can be measured using the fluorescent Ca2+ indicator Fluo-4, AM, with measurement of &#916;&#936;m using the fluorescent dye tetramethylrhodamine, methyl ester, perchlorate (TMRM). The benefit of this system is that there is very little spectral overlap between the fluorescent dyes, allowing accurate measurement of mitochondrial Ca2+ and &#916;&#936;m simultaneously. Using the sequential addition of Ca2+ aliquots, mitochondrial Ca2+ uptake can be monitored, and the concentration at which Ca2+ induces mitochondrial membrane permeability transition and the loss of &#916;&#936;m determined.

Mitochondria can utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester calcium (Ca2+), allowing them to shape cytosolic Ca2+ signaling within the cell. We describe a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using fluorescent dyes and confocal microscopy.

Misurazione simultanea di mitocondriale calcio e mitocondriale potenziale di membrana in cellule vive di Microscopia fluorescente

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins

This method provides a fast approach for the determination of plasma membrane partitioning of any fluorescently-tagged peripherally-associated protein using the profiles of fluorescence intensity across the plasma membrane. Measured fluorescence profiles are fitted by a model for membrane and cytoplasm fluorescence distribution along a line applied perpendicularly to the cell periphery. This model is constructed from the fluorescence intensity values in reference cells expressing a fluorescently-tagged marker for cytoplasm and with FM 4-64-labeled plasma membrane. The method can be applied to various cell types and organisms; however, only plasma membranes of non-neighboring cells can be evaluated. This fast microscopy-based method is suitable for experiments, where subtle and dynamic changes of plasma membrane-associated markers are expected and need to be quantified, e.g., in the analysis of mutant versions of proteins, inhibitor treatments, and signal transduction observations. The method is implemented in a multi-platform R package that is coupled with an ImageJ macro that serves as a user-friendly interface.

Here, we present a protocol to perform a quantitative analysis of the level of plasma-membrane association for fluorescently-tagged peripherally-associated protein. The method is based on the computational decomposition of membrane and cytoplasmic component of signal observed in cells labeled with plasma membrane fluorescent marker.

Determinazione della membrana plasmatica di partizionamento per marginalmente-associated Proteins

This method provides a fast approach for the determination of plasma membrane partitioning of any fluorescently-tagged peripherally-associated protein ...

Characterization of MLKL-mediated Plasma Membrane Rupture in Necroptosis

Necroptosis is a programmed cell death pathway triggered by activation of receptor interacting protein kinase 3 (RIPK3), which phosphorylates and activates the mixed lineage kinase-like domain pseudokinase, MLKL, to rupture or permeabilize the plasma membrane. Necroptosis is an inflammatory pathway associated with multiple pathologies including autoimmunity, infectious and cardiovascular diseases, stroke, neurodegeneration, and cancer. Here, we describe protocols that can be used to characterize MLKL as the executioner of plasma membrane rupture in necroptosis. We visualize the process of necroptosis in cells using live-cell imaging with conventional and confocal fluorescence&#160;microscopy, and in fixed cells using electron microscopy, which together revealed the redistribution of MLKL from the cytosol to the plasma membrane prior to induction of large holes in the plasma membrane. We present in vitro nuclear magnetic resonance (NMR) analysis using lipids to identify putative modulators of MLKL-mediated necroptosis. Based on this method, we identified quantitative lipid-binding preferences and phosphatidyl-inositol phosphates (PIPs) as critical binders of MLKL that are required for plasma membrane targeting and permeabilization in necroptosis.

We report methods for characterization of MLKL-mediated plasma membrane rupture in necroptosis including conventional and confocal live-cell microscopy imaging, scanning electron microscopy, and NMR-based lipid binding.