Questo lavoro è stato parzialmente supportato dal programma di ricerca intramurale del NIH, National Cancer Institute, Centro per la Ricerca sul Cancro; accordo di collaborazione di ricerca tra NSC e Calidris Therapeutics, American Cancer Society concessione IRG 97-152-17 di OT, e fondi federali dal National Cancer Institute, NIH, sotto HHSN26120080001E contratto.

1. Preparazione del lisato Questo protocollo è destinato cellule aderenti esprimono alcuna proteina GFP-fusa. Numero di cellule necessarie possono variare da un minimo di 10 6 di ben 20 x 10 6 cellule, a seconda del livello di espressione della proteina. Per esempio, lisato di cellule HEK overexpressing GFP-STAT3 è stato preparato trattando cellule coltivate in fiasche T75 10 vicino al 70% di confluenza con 1 ml di tampone di lisi. Tuttavia, questo lisato stati diluiti 150 volte per fornire il livello ottimale di fluorescenza per esperimento MST. Protocollo di lisi cellulare dipende fortemente dalle proprietà e la localizzazione intracellulare della proteina in esame. Se si utilizza un detersivo è indesiderabile a causa dell&#39;instabilità proteica, sonicazione descritta di seguito, potrebbe essere la scelta migliore. Diversi additivi possono essere aggiunti al tampone di lisi per prevenire reazioni di modificazione proteica: EDTA impedisce fosforilazione, vanadato sodico inibisce proteine ​​fosfatasi tirosina, cosìdium fluoruro è un inibitore di Ser / Thr fosfatasi. <ol><li> Preparare tampone di lisi. Per estrarre a-easy-proteine ​​citoplasmatiche la seguente composizione funziona bene: 25 mM Tris HCl, pH 8.0, e cocktail inibitore di proteasi diluita 100 volte (Sigma-Aldrich P2714, consistente in 2 mM AEBSF, 0.3 mM aprotinina, 130 pM Bestatina, 1 mM EDTA, 14 mM E-64, 1 mM leupeptina). In alternativa, per le proteine ​​meno solubili, si può usare tampone RIPA commerciale con inibitori della proteasi cocktail e detergenti non denaturanti. Tenere il tampone sul ghiaccio. </li><li> Lavare le cellule brevemente con PBS freddo utilizzando 10 ml di tampone per T75 pallone. Mantenere le cellule in ghiaccio per 5 minuti, o fino a quando le cellule iniziano staccandosi dal pallone. Raschiare le cellule con raschietto cella di staccare, se necessario. </li><li> Risospendere le cellule in 10 ml di PBS freddo ghiaccio e trasferimento ad un prechilled 14 ml a fondo sferico da centrifuga. </li><li> Cellule pellet per centrifugazione a 400-600 xga 4 ° C per 5 min. Combinare le cellule di diversi palloni, a questo punto if necessario. </li><li> Rimuovere PBS surnatante e risospendere pellet in 200 ml di tampone di lisi ghiacciato, il trasferimento di sospensione per un pre freddo 1,5 ml provetta Eppendorf. </li><li> Mantenere le cellule in ghiaccio per ridurre al minimo il surriscaldamento locale. Lyse cellule con 3x 10 sec impulsi di ultrasuoni al di ampiezza 30%, con un 2-3 mm punta pre-raffreddata. Tenere la punta sotto la superficie per ridurre al minimo la formazione di schiuma. Omettere questo passo quando si usano detergenti contenenti buffer e incubare in ghiaccio per 30 minuti, invece. </li><li> Correggere la soluzione lisato di contenere la concentrazione salina fisiologica (NaCl 100 mM), se necessario, con 5 M NaCl. </li><li> Raccogliere lisati mediante centrifugazione a circa 26.000 xga 4 ° C per 10 min. </li><li> Determinare la diluizione lisato ottimale (come descritto nella sezione 3 di seguito) e la quantità di lisato necessaria per una titolazione (in genere circa 300 ml di lisato pre-diluito). </li><li> Aliquotare il lisato e conservare a temperatura appropriata per la proteina in esame (-80 ° C, in molti casi). </li> &lt;/ Ol&gt; 2. MST Buffer selezione e preparazione <ol><li> Poiché le interazioni proteina-ligando dipendono dalle condizioni di buffer, MST composizione del tampone viene scelta in base alle proprietà di un particolare sistema. E &#39;generalmente vantaggioso testare almeno due differenti tamponi. </li><li> Preparare 2 5x buffer MST. Abbiamo avuto buone esperienze con queste due composizioni: HEPES (250 HEPES mM, pH 7.4, 25 mM MgCl2, 500 mM NaCl, 0.25% NP-40) e Tris HCl (250 mM Tris HCl, pH 7.4, 750 mM NaCl, 50 mM MgCl2; 0,05% Tween-20). L&#39;aggiunta di BSA (5% nella miscela finale vincolante) può aiutare a prevenire l&#39;adesione di proteine ​​per tubi di plastica e di vetro capillari. NaN 3 (0,5 mM) può anche essere incluso per prevenire la crescita di microrganismi. </li></ol> 3. Determinazione ottimale lisato di diluizione <ol><li> Selezionare la sorgente di eccitazione LED con la lunghezza d&#39;onda λ = 470 nm sullo strumento MST. </li><li> Caricare capillari con il cell estratto diluito 2 e 10x con tampone MST. </li><li> Eseguire l&#39;operazione di &quot;Trova Capillari&quot; sul software di controllo dello strumento MST. Il range ottimale di fluorescenza in lisato diluito è da 400 a 1.500 unità di fluorescenza. </li></ol> 4. Determinazione del legante ottimale range di concentrazione <ol><li> La più alta concentrazione del ligando deve essere almeno 20 volte superiore alla costante di dissociazione atteso. </li><li> La concentrazione minima ligando deve essere inferiore concentrazione molare della proteina fluorescente. </li></ol> Fare riferimento alla Technologies strumento Finder Concentrazione NanoTemper per il ligando concentrazione gamma di stima. 5. Preparazione del lisato e diluizioni Ligand <ol><li> Posizionare un rack tubo con un numero necessario (di solito 10-16) di 0,5 ml provette LoBind sul ghiaccio. Pipettare 25 ml di tampone MST al fondo di ogni provetta. Aggiungere 25 ml di soluzione madre ligando alla prima vascae (# 1, ligando più alta concentrazione) ed eseguire di serie di diluizioni doppie del ligando con il resto dei tubi. Tenere il rack con i campioni ligando su ghiaccio. </li><li> Cella disgelo lisato lentamente sul ghiaccio. </li><li> Diluire lisato cellulare con tampone MST per fornire il livello ottimale della proteina bersaglio fluorescente nelle reazioni di legame. Concentrazione proteica finale dovrebbe essere vicino al previsto K D o inferiore. Dovrebbe essere aggiustata per ottenere necessario numero di conteggi fluorescenza nella soluzione finale. Per la determinazione della concentrazione di GFP-STAT3 nel lisato, lo strumento è stato calibrato con un ausilio di fluoresceina. La concentrazione molare di GFP nel lisato è stato determinato usando rispettivamente il rapporto di fluoresceina e EGFP rese quantiche, 0,85 e 0,61. 15 </li></ol> 6. Microscala Thermophoresis Studi di rilegatura <ol><li> Selezionare la sorgente di eccitazione LED con λ = 470 nm sullo strumento MST. </li><li> Luogo provette da 0,5 ml LoBind nel tube cremagliera di fronte tubi con ligando campioni di diluizione in serie. Aggiungere con cautela 15 ml di lisato cellulare al fondo di ogni tubo. Provare a non toccare pareti del tubo per evitare la perdita del campione. </li><li> Aggiungere 15 microlitri di campione ligando con la più alta concentrazione (# 1) al tubo corrispondente # 1 con il lisato cellulare. Mescolare bene e cambiare una punta della pipetta. Ripetere questa fase con il resto dei tubi eccetto l&#39;ultima, che dovrebbe contenere alcun ligando. </li><li> Aggiungere 15 ml di tampone MST all&#39;ultima provetta e mescolare bene. </li><li> Riempire circa 2/3 della prima capillare con la miscela associazione dal tubo # 1, inclinarlo per spostare la soluzione verso il centro, e posizionare il capillare sul vassoio capillare nella posizione # 1 (la posizione più vicina all&#39;apertura vassoio) . Ripetere questa operazione con il resto capillari. Estremità del capillare possono essere collegati con la cera per gli esperimenti più lunghi. </li><li> Collocare il vassoio all&#39;interno dello strumento MST e chiudere la porta dello strumento. </li><li> Eseguire &quot;Trova Capillari&quot;comando per lasciare lo strumento trovare posizioni precise dei capillari e misurare la fluorescenza dei campioni. </li><li> In base all&#39;intensità del segnale di fluorescenza, regolare la potenza del LED (10-100%) per portarlo in 400-1,500 unità di intervallo. </li><li> Fare clic sul pulsante &quot;Start&quot; per eseguire l&#39;esperimento thermophoresis. Più di una potenza IR-laser può essere scelta per l&#39;esperimento per trovare il gradiente di temperatura ottimale per il particolare sistema. Raccogliere dati 2-3 piste per lo stesso insieme di capillari per garantire la riproducibilità delle misurazioni. Ci vogliono 10-12 minuti per eseguire una serie di 16 capillari. </li></ol> 7. Microscala Thermophoresis Data Analysis <ol><li> Aprire il software di analisi. </li><li> Caricare la cartella del progetto. Nel Informazioni Run Viewer apparso selezionare raccolti ad un laser di potenza specifiche curve thermophoretic IR. C&#39;è una possibilità di aprire tutte le tracce thermophoretic raccolti in diverse condizioni quali la potenza del laser a infrarossi, LED power, temperatura, concentrazione, ecc. in una sola volta e poi la scelta di eventuali curve di analisi da loro accensione e spegnimento (clicca sul nome del dell&#39;esperimento). </li><li> Nella finestra del grafico i punti di valutazione, selezionare l&#39;thermophoresis o thermophoresis con T-salto. Assicurarsi che le linee blu e rosse sono posizionati correttamente. Per ottenere i punti medi con deviazioni standard, selezionare &quot;Utilizza media&quot; o &quot;Distinguere corre&quot; per esecuzioni separate. </li><li> Per tracciare una costante forma di dissociazione, selezionare &quot;uso medio&quot;, inserire e fissare il valore di concentrazione molecola etichettato (controllare la piazza &quot;concentrazione&quot; in un menu a finestra in forma), e montare la curva. Il valore di K D con la sua deviazione standard compare in una informazione finestra pop-up separata. Per tracciare una misura con il metodo Hill, selezionare &quot;Media&quot;, metodo di Hill, e poi misura la curva. Il valore di affinità EC 50 con la sua deviazione standard è mostrato in questo caso. La caratteristica di K D o Hill &quot;confine&quot; può essere utilizzato anche quando la saturazionein uno stato vincolato non viene raggiunto. </li><li> Salvare i dati medi di adattarsi in un file di testo e trasferire in Excel. </li><li> Plot F norma (fluorescenza normalizzata), Af norma (differenza di fluorescenza normalizzato se diversi esperimenti sono confrontati), o frazione legata (vedere la formula seguente) come funzione della concentrazione molecola non marcato (titolato). </li></ol> Frazione legata (frazione di molecole in un complesso) = (Therm (C)-non legato) / (bound-legato), dove Therm (C) è thermophoresis misurato per la concentrazione di C, non legato è thermophoresis per lo stato non legato (quando le molecole sono non in un complesso), e legato viene thermophoresis per lo stato completamente legato.

<ol>
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I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAT3+suppresses+transcription+of+proapoptotic+genes+in+cancer+cells+with+the+involvement+of+its+N-terminal+domain.">STAT3 suppresses transcription of proapoptotic genes in cancer cells with the involvement of its N-terminal domain.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , (2013).</li><li>Patterson, G., Day, R. N., Piston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+protein+spectra.">Fluorescent protein spectra.</a> J. Cell Sci. 114, 837-838 (2001).</li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione. Il contenuto di questa pubblicazione non riflettono necessariamente le opinioni o le politiche del Dipartimento di Salute e Servizi Umani, né menzione di nomi commerciali, prodotti commerciali, o organizzazioni implica l&#39;approvazione da parte del Governo degli Stati Uniti.

Espressione e purificazione di proteine ​​è un passo laboriosa e costosa, che è, tuttavia, necessario per la determinazione delle interazioni &#39;K D dal metodo più usato. Applicazione del MST permette di evitare la purificazione di proteine ​​così in modo significativo semplificare ed accelerare la caratterizzazione quantitativa delle interazioni. Esso presenta vantaggi particolarmente significativo nel caso di-to-esprimere difficili e purificare proteine, quali le proteine ​​di membrana e f...

Caratterizzazione quantitativa di affinità di interazioni intermolecolari è importante in molti settori della ricerca biomedica. Legame costante di dissociazione (K D) è essenziale non solo nella scoperta della droga, ma è anche un parametro importante caratterizzazione di ogni interazione binaria in qualsiasi sistema biologico. Metodi biochimici utilizzati per il rilevamento di interazioni proteina-proteina, come la immunoprecipitazione e lievito schermi a due ibridi, non ci informano su quanto stretto sono quelle interazioni, mentre affinità definisce se questo particolare complesso esiste in determinate condizioni in vivo. Nel processo di scoperta di nuovi farmaci, lo sviluppo del saggio di legame è uno dei più necessaria e spesso i passi più in termini di tempo. Metodi più utilizzati per la determinazione K D includono polarizzazione di fluorescenza, 1 tecnologia risonanza plasmonica di superficie (SPR), vincolante radioligando 2, 3 isotermica di titolazione calorimetria, 4 Equilibrium dialisi (ED), 5 ultrafiltrazione (UF), 5 e ultracentrifugazione (UC). 6 Tutte richiedono notevoli quantità di proteina purificata bersaglio. Thermophoresis microscala (MST) è un metodo rapido sviluppo che rileva la regia movimento delle molecole in un gradiente di temperatura microscopico. Eventuali modifiche del guscio di idratazione biomolecole comportano un cambiamento relativo di movimento lungo il gradiente di temperatura. 7 MST viene utilizzato per determinare affinità di legame ed è stato applicato per lo studio legame alle proteine ​​fluorescente o ligandi fluorescenti ligando ad una proteina bersaglio. 8, 9 MST consente di misurare direttamente interazioni in soluzione, senza la necessità di immobilizzazione di una superficie (immobilizzazione tecnologia senza). Praticamente, qualsiasi associazione è accompagnato da un cambiamento nel segnale MST, anche se la dimensione del cambiamento differisce da sistema a sistema in modo significativo. Per la rilevazione di movimento molecola da MST, devono essere fluorescenzant. Questo importante limitazione del metodo può essere trasformato in un vantaggio. Se una proteina è espressa come una fusione GFP in qualsiasi sistema, sarà la sola molecola fluorescente e quindi può essere studiata senza separazione dal lisato cellulare o sistema di espressione acellulare. Generazione di lisati cellulari che permettono di condizioni vincolanti con manufatti minimali è la grande sfida. Qui si descrive un protocollo di cellule lisate e sperimentare MST che può essere utilizzato per molte proteine ​​solubili e di membrana. Proteine ​​STAT sono latenti fattori di trascrizione attivati ​​da citoplasmatici fosforilazione della tirosina in risposta a segnali extracellulari e sono coinvolti in molti processi biologici tra immunità, ematopoiesi, infiammazione e sviluppo. 10 Nei mammiferi, la famiglia STAT costituito STAT 1, 2, 3, 4 , 5A, 5B e 6. All Stats attivati ​​sono noti per legarsi alla stessa sequenza di DNA, così chiamato motivi GAS, IFN-gamma attivato sequenza. Tuttavia, la transcrieffetti facoltativo, di diverse statistiche sono molto diversi. 11 Nonostante il coinvolgimento in molti processi patologici e ampi studi che producono oltre 17.000 pubblicazioni, la K D di interazioni STAT con diverse sequenze di DNA non sono stati determinati. Solo affinità relativa delle diverse statistiche varianti del motivo GAS è stato caratterizzato. 11 Difficoltà di espressione e purificazione di proteine ​​sono i principali ostacoli nella caratterizzazione di STAT &#39;DNA selettività vincolante. Anche se la maggior parte degli studi si sono concentrati sul ruolo delle stats &quot;attivato&quot;, che divenne sinonimo di fattore di trascrizione Tyr-fosforilata, il ruolo del non-fosforilata Stats (U-stats) nella regolazione della trascrizione sta emergendo rapidamente. 12 Tuttavia, questi meccanismi sono poco conosciute, e non era chiaro se U-stats in realtà si legano al DNA o di agire attraverso le interazioni con altri fattori di trascrizione. Abbiamo recentemente dimostrato che l&#39;U-STAT3 può legarsi al DNA sequenzialeCES diverso da motivi a gas con ancora maggiore affinità. 13 La scoperta ha implicazioni significative per la nostra comprensione delle funzioni biologiche di questa importante proteina. Abbiamo applicato thermophoresis microscala per determinare affinità relative di STAT3 a GAS e AT-ricco oligonucleotide S 100 (Figura 4). Protocollo pressoché identico è stato utilizzato per la determinazione K D per il legame di un ligando diverso STAT3, un inibitore lipopeptide. 14 N. vincolante per un fattore di trascrizione correlato, GFP-STAT1 che è stato utilizzato come controllo negativo si poteva individuare confermando selettività di interazione. 14

<table border="1">
	<tbody>
 <tr>
 <td>Name of the Reagent/material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue Number</td>
 <td>Comments </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RIPA buffer</td>
 <td>Millipore</td>
 <td>20-188</td>
 <td>Other manufacturer's buffers work as well</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Protease inhibitors cocktail</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P2714</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Monolith NT.115</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>G008</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Monolith NT.115 Capillary Tray</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>T001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Monolith NT.115 Standard Treated Capillaries</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>K002</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NT Control software</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>2.0.2.29</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NT Analysis software</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>1.4.27</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Table-top refrigerated centrifuge</td>
 <td>Eppendorf </td>
 <td>5417R</td>
 <td>Other microtube refrigerated centrifuges</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Protein LoBind Tube 0.5 ml</td>
 <td>Eppendorf </td>
 <td>22431064</td>
 <td></td>
 </tr>
	 </tbody>
 </table>

protein purification-free method of binding affinity determination by microscale thermophoresis

Caratterizzazione quantitativa delle interazioni della proteina è essenziale in praticamente ogni campo delle scienze della vita, in particolare di scoperta di nuovi farmaci. La maggior parte dei metodi attualmente disponibili di determinazione K D richiedono accesso purificata proteina di interesse, di generazione che può essere lunga e costosa. Abbiamo sviluppato un protocollo che consente di determinare l&#39;affinità di legame per thermophoresis microscala (MST) senza purificazione della proteina bersaglio da lisati cellulari. Il metodo prevede sovraespressione della proteina GFP-fuso e lisi cellulare in condizioni non denaturanti. Applicazione del metodo di STAT3-GFP espresso transitoriamente in cellule HEK293 permesso di determinare per la prima volta l&#39;affinità del fattore di trascrizione ben studiato per oligonucleotidi con sequenze differenti. Il protocollo è semplice e può avere una varietà di applicazione per studiare le interazioni delle proteine ​​con piccole molecole, peptidi, DNA, RNA, e proteins.

Misurando l&#39;affinità di non fosforilata STAT3 legame proteico oligonucleotidi. Cellule HEK293 esprimenti STAT3-GFP sono stati utilizzati come fonte di fluorescente STAT3 per saggio di legame al DNA. I lisati cellulari sono stati preparati usando tampone RIPA (20x10 6 cellule / ml). Per studi di legame, i lisati sono stati diluiti con 150x MST tampone di legame al DNA per fornire il livello ottimale della proteina fluorescente nella reazione di legame (circa 20 n...

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Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Thermophoresis microscala (MST) può essere ampiamente usato per la determinazione di affinità di legame senza purificazione della proteina bersaglio da lisati cellulari. Il protocollo prevede sovraespressione della proteina GFP-fusa, lisi cellulare in condizioni non denaturanti, e la rilevazione di segnale MST in presenza di concentrazioni variabili di ligando.

Protein Purification-libera Metodo di Binding Affinity Determinazione Thermophoresis microscala

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

protein-purification-free-method-binding-affinity-determination

Research

JoVE Journal

Biology

30.3K Views.  National Cancer Institute. Thermophoresis microscala (MST) può essere ampiamente usato per la determinazione di affinità di legame senza purificazione della proteina bersaglio da lisati cellulari. Il protocollo prevede sovraespressione della proteina GFP-fusa, lisi cellulare in condizioni non denaturanti, e la rilevazione di segnale MST in presenza di concentrazioni variabili di ligando.

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Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often used for protein analysis. The Thermo Scientific NanoDrop 2000c Spectrophotometer solves this issue with an innovative sample retention system that holds microvolume samples between two measurement surfaces using the surface tension properties of liquids, enabling the quantification of samples in volumes as low as 0.5-2 &mu;L. The elimination of cuvettes or capillaries allows real time changes in path length, which reduces the measurement time while greatly increasing the dynamic range of protein concentrations that can be measured. The need for dilutions is also eliminated, and preparations for sample quantification are relatively easy as the measurement surfaces can be simply wiped with laboratory wipe. This video article presents modifications to traditional protein concentration determination methods for quantification of microvolume amounts of protein using A280 absorbance readings or the BCA colorimetric assay.

Microvolume samples are quantified by a spectrophotometer system that uses natural surface tension to retain samples without the use of cuvettes or capillaries. The dynamic range of protein concentrations and speed by which they can be measured are greatly increased with this method.

Microvolumi Concentrazione Determinazione delle proteine ​​con il NanoDrop 2000c Spettrofotometro

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often ...

Ricerca

Biologia

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis 

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), a plant cysteine protease, by real-time label-free analysis using Biacore X100. Several cystatin B variants with point mutations in areas of interaction with papain, are produced. For each cystatin B variant we determine its specific binding concentration using calibration-free concentration analysis (CFCA) and compare the values obtained with total protein concentration as determined by A280. After that, the kinetics of each cystatin B variant binding to papain is measured using single-cycle kinetics (SCK). We show that one of the four cystatin B variants we examine is only partially active for binding. This partial activity, revealed by CFCA, translates to a significant difference in the association rate constant (ka) and affinity (KD), compared to the values calculated using total protein concentration. Using CFCA in combination with kinetic analysis in a structure-function study contributes to obtaining reliable results, and helps to make the right interpretation of the interaction mechanism.

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis

We apply label-free protein interaction analysis using Biacore X100 for structure-function analysis of the binding of several cystatin B mutants to papain through kinetic characterization. Calibration-free concentration analysis (CFCA) measures the concentration of protein with retained binding activity without the need for a standard curve. We show that confirmation of concentrations using CFCA increases the reliability of the kinetic analysis and that kinetic constants can reliably be determined even if the activity of a recombinant protein is reduced.

L&#39;importanza della concentrazione della proteina corretta per Cinetica e determinazione affinità nella struttura-funzione di analisi

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), ...

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude stringent methods for the isolation and identification of protein networks around a protein of interest. The use of chemical crosslinkers allows the selective stabilization of labile interactions, thus bypassing biochemical limitations for purification. Here we present a protocol amenable for cells in culture that uses a homobifunctional crosslinker with a spacer arm of 12 &Aring;, dithiobis-(succinimidyl proprionate) (DSP). DSP is cleaved by reduction of a disulphide bond present in the molecule. Cross-linking combined with immunoaffinity chromatography of proteins of interest with magnetic beads allows the isolation of protein complexes that otherwise would not withstand purification. This protocol is compatible with regular western blot techniques and it can be scaled up for protein identification by mass spectrometry1.
Stephanie A. Zlatic and Pearl V. Ryder contributed equally to this work.

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The cell permeable crosslinker DSP [dithiobis-(succinimidyl propionate)] stabilizes transient and labile interactions in vivo, which allows their isolation using stringent protein complex purification techniques. Here we present a technique for crosslinking cells grown in culture followed by isolation of protein complexes by immunoprecipitation.

Isolamento di Labile Multi-proteina complessi da In vivo Controllato Cellular Cross-Linking e Immuno-magnetica Cromatografia di affinità

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

PAR-CliP - A Method to Identify Transcriptome-wide the Binding Sites of RNA Binding Proteins

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ribonucleoprotein complexes (miRNPs) that are often expressed in a cell-type dependently. To understand how the interplay of these RNA-binding factors affects the regulation of individual transcripts, high resolution maps of in vivo protein-RNA interactions are necessary1.
A combination of genetic, biochemical and computational approaches are typically applied to identify RNA-RBP or RNA-RNP interactions. Microarray profiling of RNAs associated with immunopurified RBPs (RIP-Chip)2 defines targets at a transcriptome level, but its application is limited to the characterization of kinetically stable interactions and only in rare cases3,4 allows to identify the RBP recognition element (RRE) within the long target RNA. More direct RBP target site information is obtained by combining in vivo UV crosslinking5,6 with immunoprecipitation7-9 followed by the isolation of crosslinked RNA segments and cDNA sequencing (CLIP)10. CLIP was used to identify targets of a number of RBPs11-17. However, CLIP is limited by the low efficiency of UV 254 nm RNA-protein crosslinking, and the location of the crosslink is not readily identifiable within the sequenced crosslinked fragments, making it difficult to separate UV-crosslinked target RNA segments from background non-crosslinked RNA fragments also present in the sample.
We developed a powerful cell-based crosslinking approach to determine at high resolution and transcriptome-wide the binding sites of cellular RBPs and miRNPs that we term PAR-CliP (Photoactivatable-Ribonucleoside-Enhanced Crosslinking and Immunoprecipitation) (see Fig. 1A for an outline of the method). The method relies on the incorporation of photoreactive ribonucleoside analogs, such as 4-thiouridine (4-SU) and 6-thioguanosine (6-SG) into nascent RNA transcripts by living cells. Irradiation of the cells by UV light of 365 nm induces efficient crosslinking of photoreactive nucleoside-labeled cellular RNAs to interacting RBPs. Immunoprecipitation of the RBP of interest is followed by isolation of the crosslinked and coimmunoprecipitated RNA. The isolated RNA is converted into a cDNA library and deep sequenced using Solexa technology. One characteristic feature of cDNA libraries prepared by PAR-CliP is that the precise position of crosslinking can be identified by mutations residing in the sequenced cDNA. When using 4-SU, crosslinked sequences thymidine to cytidine transition, whereas using 6-SG results in guanosine to adenosine mutations. The presence of the mutations in crosslinked sequences makes it possible to separate them from the background of sequences derived from abundant cellular RNAs.
Application of the method to a number of diverse RNA binding proteins was reported in Hafner et al.18

RNA transcripts are subject to extensive posttranscriptional regulation that is mediated by a multitude of trans-acting RNA-binding proteins (RBPs). Here we present a generalizable method to identify precisely and on a transcriptome-wide scale the RNA binding sites of RBPs.

PAR-Clip - un metodo per identificare trascrittoma livello i siti di legame delle proteine ​​RNA binding

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ...

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification procedures. As an alternative, lipids can be coated on flat surfaces as used for lipid ELISA and Plasmon resonance spectroscopy. However, surface coating lipids do not form microdomain structures, which may be important for the lipid binding properties. Further, these methods do not allow for the purification of larger amounts of proteins binding to their target lipids.
 To overcome these limitations of testing lipid protein interaction and to purify lipid binding proteins we developed a novel method termed lipid vesicle-mediated affinity chromatography using magnetic-activated cell sorting (LIMACS). In this method, lipid vesicles are prepared with the target lipid and phosphatidylserine as the anchor lipid for Annexin V MACS. Phosphatidylserine is a ubiquitous cell membrane phospholipid that shows high affinity to the protein Annexin V. Using magnetic beads conjugated to Annexin V the phosphatidylserine-containing lipid vesicles will bind to the magnetic beads. When the lipid vesicles are incubated with a cell lysate the protein binding to the target lipid will also be bound to the beads and can be co-purified using MACS. This method can also be used to test if recombinant proteins reconstitute a protein complex binding to the target lipid. 
 We have used this method to show the interaction of atypical PKC (aPKC) with the sphingolipid ceramide and to co-purify prostate apoptosis response 4 (PAR-4), a protein binding to ceramide-associated aPKC. We have also used this method for the reconstitution of a ceramide-associated complex of recombinant aPKC with the cell polarity-related proteins Par6 and Cdc42. Since lipid vesicles can be prepared with a variety of sphingo- or phospholipids, LIMACS offers a versatile test for lipid-protein interaction in a lipid environment that resembles closely that of the cell membrane. Additional lipid protein complexes can be identified using proteomics analysis of lipid binding protein co-purified with the lipid vesicles.

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting LIMACS: a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

To test the interaction of a protein with its target lipid we used MACS and Annexin V-conjugated magnetic beads and lipid vesicles synthesized from the target lipid and Annexin V-binding phosphatidylserine. Proteins bound to the target lipid are co-purified and analyzed after elution from the beads.

Vescicole lipidiche-mediata Cromatografia di affinità mediante Magnetic separazione delle cellule attivate (LIMACS): un nuovo metodo per l&#39;analisi delle interazioni proteina-lipide

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification ...

Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a demand for general methods that do not require target protein specific optimization1 . To achieve this, purification tags that genetically can be fused to the gene of interest are commonly used2 . The most widely used affinity handle is the hexa-histidine tag, which is suitable for purification under both native and denaturing conditions3 . The metabolic burden for producing the tag is low, but it does not provide as high specificity as competing affinity chromatography based strategies1,2.
Here, a bispecific purification tag with two different binding sites on a 46 amino acid, small protein domain has been developed. The albumin-binding domain is derived from Streptococcal protein G and has a strong inherent affinity to human serum albumin (HSA). Eleven surface-exposed amino acids, not involved in albumin-binding4 , were genetically randomized to produce a combinatorial library. The protein library with the novel randomly arranged binding surface (Figure 1) was expressed on phage particles to facilitate selection of binders by phage display technology. Through several rounds of biopanning against a dimeric Z-domain derived from Staphylococcal protein A5, a small, bispecific molecule with affinity for both HSA and the novel target was identified6 .
The novel protein domain, referred to as ABDz1, was evaluated as a purification tag for a selection of target proteins with different molecular weight, solubility and isoelectric point. Three target proteins were expressed in Escherishia coli with the novel tag fused to their N-termini and thereafter affinity purified. Initial purification on either a column with immobilized HSA or Z-domain resulted in relatively pure products. Two-step affinity purification with the bispecific tag resulted in substantial improvement of protein purity. Chromatographic media with the Z-domain immobilized, for example MabSelect SuRe, are readily available for purification of antibodies and HSA can easily be chemically coupled to media to provide the second matrix.
This method is especially advantageous when there is a high demand on purity of the recovered target protein. The bifunctionality of the tag allows two different chromatographic steps to be used while the metabolic burden on the expression host is limited due to the small size of the tag. It provides a competitive alternative to so called combinatorial tagging where multiple tags are used in combination1,7.

A novel and highly efficient two-step affinity chromatography protocol has been developed and is described in detail. The method is based on a small purification tag with two inherent affinities and is applicable to a wide range of target proteins with different properties.

Purificazione delle proteine ​​ortogonali Facilitato da una piastrina Affinity Bispecific

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein partners. There are many approaches that allow the identification of interacting partners, including the yeast two hybrid system, as well as pull down assays using recombinant proteins and immunoprecipitation of endogenous proteins followed by mass spectrometry identification1. Recent studies have highlighted the utility of double-affinity tag mediated purification, coupled with two specific elution steps in the identification of interacting proteins. This approach, termed Tandem Affinity Purification (TAP), was initially used in yeast2,3 but more recently has been adapted to use in mammalian cells4-8.
As proof-of-concept we have established a tandem affinity purification (TAP) method using the well-characterized eukaryotic translation initiation factor eIF4E9,10.The cellular translation factor eIF4E is a critical component of the cellular eIF4F complex involved in cap-dependent translation initiation10. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence8. To forgo the need for the generation of clonal cell lines, we developed a rapid system that relies on the expression of the TAP-tagged bait protein from an episomally maintained plasmid based on pMEP4 (Invitrogen). Expression of tagged murine eIF4E from this plasmid was controlled using the cadmium chloride inducible metallothionein promoter.
Lysis of the expressing cells and subsequent affinity purification via binding to rabbit IgG agarose, TEV protease cleavage, binding to streptavidin linked agarose and subsequent biotin elution identified numerous proteins apparently specific to the eIF4E pull-down (when compared to control cell lines expressing the TAP tag alone). The identities of the proteins were obtained by excision of the bands from 1D SDS-PAGE and subsequent tandem mass spectrometry. The identified components included the known eIF4E binding proteins eIF4G and 4EBP-1. In addition, other components of the eIF4F complex, of which eIF4E is a component were identified, namely eIF4A and Poly-A binding protein. The ability to identify not only known direct binding partners as well as secondary interacting proteins, further highlights the utility of this approach in the characterization of proteins of unknown function.

Tandem affinity purification is a robust approach for the identification of protein binding partners. As proof of concept, this methodology was applied to the well-characterized translation initiation factor eIF4E to co-precipitate the host cell factors involved in translation initiation. This method is easily adapted to any cellular or viral protein.

Individuazione di partner proteine ​​interagenti mediante Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs. Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and specific carrier of vitamin A in the blood. Here we describe an optimized technique to produce and purify holo-RBP and two real-time monitoring techniques to study the transport of vitamin A by the high-affinity RBP receptor STRA6. The first technique makes it possible to produce a large quantity of high quality holo-RBP (100%-loaded with retinol) for vitamin A transport assays. High quality RBP is essential for functional assays because misfolded RBP releases vitamin A readily and bacterial contamination in RBP preparation can cause artifacts. Real-time monitoring techniques like electrophysiology have made critical contributions to the studies of membrane transport. The RBP receptor-mediated retinol transport has not been analyzed in real time until recently. The second technique described here is the real-time analysis of STRA6-catalyzed retinol release or loading. The third technique is real-time analysis of STRA6-catalyzed retinol transport from holo-RBP to cellular retinol binding protein I (CRBP-I). These techniques provide high sensitivity and resolution in revealing RBP receptor's vitamin A uptake mechanism.

Here we describe an optimized technique to produce high-quality vitamin A/RBP complex and two real-time monitoring techniques to study vitamin A transport by STRA6, the RBP receptor.

Analisi in tempo reale di Trasporti retinolo da parte del recettore di membrana di proteine ​​plasmatiche Retinol Binding

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs.  Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and ...

A Protocol for Phage Display and Affinity Selection Using Recombinant Protein Baits

Using recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules is an efficient means to discover interactions. The technique has largely been used to discover protein-protein interactions but the bait molecule to be challenged need not be restricted to proteins. The protocol presented here has been optimized to allow a modest number of baits to be screened in replicates to maximize the identification of independent clones presenting the same protein. This permits greater confidence that interacting proteins identified are legitimate interactors of the bait molecule. Monitoring the phage titer after each affinity selection round provides information on how the affinity selection is progressing as well as on the efficacy of negative controls. One means of titering the phage, and how and what to prepare in advance to allow this process to progress as efficiently as possible, is presented. Attributes of amplicons retrieved following isolation of independent plaque are highlighted that can be used to ascertain how well the affinity selection has progressed. Trouble shooting techniques to minimize false positives or to bypass persistently recovered phage are explained. Means of reducing viral contamination flare up are discussed.

Phage display is a powerful technique to capture proteins or protein moieties that interact with an immobilized molecule of interest. Once a decision of the type of phage cDNA library to create and screen has been made, the protocol described here permits efficient affinity selection leading to identification of interactors.

Un protocollo per Phage Display e affinità selezione con esche proteina ricombinante

Using  recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by  a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules ...

A Sensitive and Specific Quantitation Method for Determination of Serum Cardiac Myosin Binding Protein-C by Electrochemiluminescence Immunoassay

Biomarkers are becoming increasingly more important in clinical decision-making, as well as basic science. Diagnosing myocardial infarction (MI) is largely driven by detecting cardiac-specific proteins in patients' serum or plasma as an indicator of myocardial injury. Having recently shown that cardiac myosin binding protein-C (cMyBP-C) is detectable in the serum after MI, we have proposed it as a potential biomarker for MI. Biomarkers are typically detected by traditional sandwich enzyme-linked immunosorbent assays. However, this technique requires a large sample volume, has a small dynamic range, and can measure only one protein at a time.	
Here we show a multiplex immunoassay in which three cardiac proteins can be measured simultaneously with high sensitivity. Measuring cMyBP-C in uniplex or together with creatine kinase MB and cardiac troponin I showed comparable sensitivity. This technique uses the Meso Scale Discovery (MSD) method of multiplexing in a 96-well plate combined with electrochemiluminescence for detection. While only small sample volumes are required, high sensitivity and a large dynamic range are achieved. Using this technique, we measured cMyBP-C, creatine kinase MB, and cardiac troponin I levels in serum samples from 16 subjects with MI and compared the results with 16 control subjects. We were able to detect all three markers in these samples and found all three biomarkers to be increased after MI. This technique is, therefore, suitable for the sensitive detection of cardiac biomarkers in serum samples.

Measuring biomarkers in complex biological samples is increasingly guiding clinical decision-making. We describe a highly sensitive method to simultaneously measure cardiac myosin binding protein-C, creatine kinase MB, and cardiac troponin I in serum samples from subjects with myocardial infarction and healthy control subjects.

Un metodo di quantificazione sensibile e specifico per la determinazione del siero miosina cardiaca Binding Protein-C da elettrochemiluminescenza immunoenzimatico

Biomarkers are becoming increasingly more  important in clinical decision-making, as well as basic science. Diagnosing  myocardial infarction (MI) is ...