Questo protocollo descrive una serie di tecniche all'interno di un flusso di lavoro continuo che possono essere utilizzate per valutare gli effetti in vivo dei candidati regolatori delle metastasi del melanoma, ma anche delle metastasi di altre neoplasie solide. Il vantaggio principale del nostro flusso di lavoro sistematico è una maggiore riproducibilità dei dati grazie a modelli e tecniche in vivo robusti e standardizzati. Questa pipeline offre un percorso per la scoperta del target e lo sviluppo della terapia testando i candidati dedotti dai dati Omics o dai saggi in vitro in un ambiente in vivo.
La curva di apprendimento associata alle tecniche presentate in questo protocollo viene abbreviata utilizzando i materiali forniti e seguendo la descrizione dettagliata durante la pratica dei passaggi. Ad aiutare a dimostrare la procedura saranno Orlando Aristizabal, uno scienziato ricercatore in The Preclinical Imaging Core e Ran Moubarak, un istruttore nel mio laboratorio. Per le iniezioni intradermiche, anestetizzare e radere un topo di otto-10 settimane all'interno di un armadietto di biosicurezza mantenendo le condizioni asettiche.
Quindi afferrare e ritrarre la pelle all'indietro contro la traiettoria della pugnalata dell'ago e utilizzando un ago per siringa da insulina da 31 millimetri di lunghezza, perforare delicatamente la pelle ad angolo acuto con la smussatura rivolta verso l'alto. Iniettare lentamente 30 microlitri della sospensione delle cellule tumorali, fino a quando non si osserva una ruota a forma di cupola. Monitorare la progressione della crescita del tumore, la perdita di peso e lo stato di salute generale.
Durante queste sessioni di monitoraggio, prendere misure con pinze e utilizzare le dimensioni di lunghezza e larghezza del tumore per calcolare il volume. Per le iniezioni intracardiache, trasferire un mouse anestetizzato sulla piattaforma riscaldata della macchina ad ultrasuoni. Quindi utilizzando il nastro ipoallergenico, fissare il mouse al cono del naso.
Rasare il torace con una lama di rasoio dritta o una lama di bisturi, inclinata ad un angolo di 30 gradi e pulire la pelle intorno all'area della procedura con il 10% di iodio povidone. Quindi, posizionare la sonda ad ultrasuoni al centro del torace sul lato sinistro del mouse per catturare una finestra orizzontale orientata per ottenere una vista in sezione trasversale del ventricolo sinistro. Con l'asse lungo della sonda rivolto verso l'alto, fissare la sonda con un angolo di 50 gradi e la piattaforma riscaldata con un angolo di 20 gradi, quindi bloccare la sonda e il telaio di supporto nella posizione.
Mentre si lavora all'interno dell'armadio di sicurezza, aspirare la sospensione cellulare in una siringa tubercolarina da un millilitro con un ago da 30 gauge da un pollice. Rimuovere eventuali bolle d'aria presenti nella siringa. Bloccare la siringa nell'iniettore stereotassico.
E poi sotto la guida ecografica, far avanzare l'ago attraverso la parete toracica nel ventricolo sinistro del cuore e iniettare lentamente da 100 a 250 microlitri della sospensione delle cellule tumorali. Per la chirurgia di sopravvivenza in fasi, posizionare il topo anestetizzato sul tampone riscaldante e pulire la pelle intorno all'area della procedura con una soluzione di iodio povidone al 10%. Dopo aver indossato sterili dispositivi di protezione individuale e guanti, posare un drappo sterile sul corpo dell'animale.
Successivamente, usando le forbici dell'iride o un bisturi, incidere la pelle, mantenendo un margine di resezione da cinque a sette millimetri dal bordo del tumore. In caso di tumori intradermici, resecare il tumore insieme alla pelle circonferenziale. Per i tumori sottocutanei, sezionare e rimuovere il tumore sotto la pelle.
Dopo la resezione del tumore, chiudere la ferita con un dispositivo di pinzatura da nove millimetri. Per l'imaging in vivo, somministrare il substrato di d-luciferina al topo mediante iniezione intraperitoneale con una siringa da insulina da un millilitro e un ago da 28 gauge, quindi anestetizzare il mouse e posizionarlo in un cono nasale all'interno dello scanner di imaging a bioluminescenza. Avviare lo strumento premendo inizializza e impostare il tempo di esposizione su auto.
Per acquisire un'immagine vuota per la sottrazione dello sfondo, fare clic su Acquisisci e salvare l'immagine al termine della sequenza di acquisizione. Per l'analisi dei dati e lo stesso software di imaging in vivo, passare alla cartella in cui vengono salvate le immagini e aprire le immagini di tutti i mouse di un esperimento. Impostare le unità su radianza e assicurarsi che la casella di controllo che indica l'individuo non sia selezionata in quanto ciò precluderà la normalizzazione del segnale tra i gruppi.
Successivamente, utilizzando la regione di interesse o lo strumento di disegno roi, disegna ROI circolari per la regione del cervello e ROI rettangolari per il corpo, escludi le orecchie e il naso nel ROI del cervello in quanto tendono a emettere luminanza non specifica. Per ridurre al minimo i pregiudizi, disegna i ROI sulle fotografie dei mouse senza il segnale luminescente sovrapposto, quindi seleziona misura i ROI per quantificare il segnale ed esporta i dati in un foglio di calcolo. Analizza le differenze tra i gruppi tracciando il flusso luminescente totale nelle regioni del corpo di interesse.
Dopo una colorazione NuMA utilizzando il software, disegnare un ROI per includere tutte le cellule colorate NuMA all'interno del tessuto dell'organo, ad eccezione di altri parenchima d'organo e spazi vuoti. Regolare le impostazioni per classificare le cellule NuMA positive e NuMA negative utilizzando controlli positivi e negativi appropriati per ciascun organo. Utilizzare un algoritmo software consolidato per quantificare il numero totale di percentuali di cellule NuMA positive per ciascun campione.
Le immagini di bioluminescenza, campo luminoso, fluorescenza ex vivo e colorazione di ematossilina ed eosina illustrano l'approccio su più fronti per l'analisi degli effetti dei geni candidati sulle metastasi del melanoma. Il silenziamento della fucosiltransferasi ha compromesso la disseminazione metastatica delle cellule di melanoma. Le sezioni polmonari macchiate di NuMA di cellule di melanoma infettate dal virus Linda di controllo e con un soppressore di metastasi che esprime il virus Linda sono mostrate qui.
Le cellule di melanoma metastatico sono etichettate come verdi e l'area dell'organo è delimitata da una linea tratteggiata verde. Mantenere una corretta tensione nella pelle durante l'esecuzione di iniezioni intradermiche, evitare l'embolia aerea durante la preparazione delle siringhe e ottenere margini di resezione adeguati che non dovrebbero interferire con la locomozione dell'animale o predisporlo a complicazioni della ferita, contribuire a migliorare il tasso di successo e la riproducibilità. L'ulteriore impiego dell'imaging multiplex per esaminare la filtrazione immunitaria, il sequenziamento dell'RNA a singola cellula per l'analisi dell'espressione genica e la trascrittomica spaziale potrebbero fornire vie complementari per esaminare l'eterogeneità intratumorale.
La combinazione di tecniche descritte in questo protocollo ci ha aiutato a identificare nuovi regolatori nelle metastasi cerebrali del melanoma, come il ruolo del melanoma secreto amiloide-beta nel sopprimere la neuroinfiammazione e promuovere le metastasi cerebrali.
