Questo lavoro è stato supportato da fondi di avvio dall'Università del Nevada, Reno e da NIGMS del National Institute of Health, sotto concessione numero P20 GM103650.

1. costruire un Arena di comportamento e preparazione Hardware per abilitare optogenetica stimolazione in ambito di comportamento
<ol><li>Per costruire un arena di comportamento luce-sfavoriti, costruire una scatola con una dimensione di 89 x 61 x 66 cm3 (35" L x 24" W x 26" H) fatta di lastre acriliche in plexiglass colorato nero (3 mm di spessore) (Vedi Tabella materiali). Materiali per costruire tale scatola dovrebbero essere disponibile presso negozi di ferramenta locale. Posizionare la scatola su un tavolo nella sala comportamento (Figura 1A).</li>
	<li>Montare una telecamera monocromatica USB 3.0 CCD dotata di un filtro di IR lungo-passa 830 nm e una lente f 1.4 C-mount di 8 mm (Vedi Tabella materiali) al centro del soffitto della scatola nera. Posto due infrarossi LED strisce (Vedi Tabella materiali) sul piano del tavolo per illuminare le larve nell'arena scuro (Figura 1A).</li>
	<li>Per creare la piattaforma di LED, ottenere una lastra di alluminio quadrata 22 cm × 22 cm (preferibilmente spruzzo verniciato con una finitura nera opaca per eliminare eventuali riflessi). Al centro del piatto, utilizzando un coltello di metallo, tagliare un buco abbastanza grande per adattarsi intorno la telecamera CCD.</li>
	<li>Coprire la piastra metallica con luci di striscia di LED rosso (Vedi Tabella materiali). Saldare fili di luce di striscia di LED in serie e passare i cavi di striscia in un fotoaccoppiatore relè controllato da un microprocessore di 2B Raspberry Pi (Vedi Tabella materiali) (Figura 1B e 2).</li>
	<li>Installare e configurare il sistema operativo Ubuntu Mate/Raspian Jesse/Linux basato sul processore Raspberry Pi prima di collegare il relè opto per le strisce di LED. Collegare un alimentatore per alimentare le strisce di LED e l'optoisolatore (Figura 2) (Vedi Tabella materiali). Montare la piattaforma LED intorno alla telecamera CCD (Figura 1B). Nota: Ubuntu Mate v16.04 sistema operativo è liberamente disponibile. Una serie di semplici comandi basato su Python può essere facilmente adattata ai modelli di programma di stimoli luminosi LED (vedere file di sintassi).</li>
	<li>Garantire irraggiamento omogeneo nei vari punti all'arena di comportamento. Misurare l'irradianza assoluta presso la superficie dell'arena con l'aiuto di uno spettrometro e determinare che sia ~1.3 W/m2 su tutta la superficie dell'arena. Nota: A questa intensità, senza i cambiamenti significativi sono stati osservati di temperatura nel corso degli esperimenti. Un altro studio10 utilizzato un maggiore irraggiamento di ~1.9 W/m2 e non osservato nessun cambiamento nella temperatura nel corso degli esperimenti.</li>
</ol>2. preparazione di larve di Drosophila per analisi di comportamento
<ol><li>Mantenere le mosche sul cibo vola standard (Vedi Tabella materiali) a 25 ° C, 50-60% RH e un ciclo luce/buio di 12 h/12 h.</li>
	<li>
Al fine di esprimere CsChrimson in una singola coppia di ORNs, attraversare le femmine vergini da una linea UAS-IVS-CsChrimson ai maschi da una linea di OrX-Gal4 ('X' corrisponde a uno dei 21 del ricevitore di odore larvale (o) geni che sono espressi in modo univoco in ogni 21 paia di ORNs)9,11.
	<ol>
<li>In alternativa, per esprimere CsChrimson in tutti i 21 ORNs larvale, attraversare le femmine vergini da un UAS-IVS-CsChrimson linea ai maschi da una linea di Orco-Gal4 ('Orco' è il co-recettore che si esprime in tutti i 21 ORNs).</li>
		<li>Utilizzare UAS-IVS-CsChrimson linea di per sé come un controllo in questi esperimenti. Nota: Le scorte volare qui elencate sono tutti disponibili presso il centro di Stock di Drosophila Bloomington (Vedi Tabella materiali).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Una volta mosche maschii e femminili in una croce sono ammessi per accoppiarsi e deporre le uova per 48 h, trasferire gli adulti ad un flacone di fresco.
	<ol>
<li>Alla superficie del flaconcino cibo contenente le uova, aggiungere 400 µ l di una miscela contenente 400 µM all-trans retinico (ATR) dissolto in dimetilsolfossido (DMSO) e saccarosio 89mm disciolto in acqua distillata. Nota: La piccola quantità di saccarosio promuove alimentazione larvale della soluzione ATR. ATR è un cofattore necessario per aumentare di CsChrimson espressione9,10. ATR è sensibile alla luce.</li>
		<li>Una volta ATR è aggiunto le fiale di alimenti contenenti uova, incubare i flaconi al buio per 72 h. Nota: Mentre questo studio e sopra due studi non hanno osservato gli effetti sul comportamento larvale dovuta ATR alimentazione, si consiglia di controllare per gli effetti dell'ATR alimentazione sottoponendo le linee di test per la stessa quantità di miscela di cui sopra che non contengono ATR.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Estrarre le larve di terza-instar (~ 120 h dopo la deposizione delle uova) dalla superficie dell'alimento facendo galleggiare utilizzando una soluzione di saccarosio ad alta densità (15%). Utilizzando un P1000 micropipetta separare le larve galleggiano sulla superficie della soluzione di saccarosio in un becher di vetro da 1000 mL.</li>
	<li>Lavare le larve 3 – 4 volte scambiando 800 mL di acqua distillata di fresco in bicchiere di vetro ogni volta. Consentire le larve di riposare per 10 min prima di sottoporli a test comportamento.</li>
</ol>3. comportamento saggio
<ol><li>Mantenere costante la temperatura (tra 22 – 25 ° C) e umidità (tra 50 e 60% RH) nel comportamento locale.</li>
	<li>
Preparare larvale supporto strisciante di versare 150 mL di agarosio fuso (1,5%) in un quadrato di 22 x 22 cm di Petri. Una capsula di Petri è versato per ogni prova del test, prove di 8 – 10 per esperimento. Consentire l'agarosio solidificare e raffreddare per 1 – 2 h nei piatti Petri prima del loro utilizzo nell'analisi di comportamento.
	<ol>
<li>Trasferire non più di 20 delle larve di terza-instar preparate per il centro di Petri piatto (Figura 1C). Coprire il piatto di Petri con il suo coperchio. Posizionare la piastra di Petri nell'arena comportamento sotto la telecamera CCD. Nota: A seconda dell'esperimento, comportamento analisi vengono effettuate in genere per 3 – 5 min. Se un odorant viene utilizzato nell'analisi per fornire spunti di orientamento, è stato osservato che la pendenza risultante di odore rimane stabile per circa 5 min1. Tempi più lunghi di dosaggio non sono raccomandati. Non sono stati osservati effetti deleteri sulle larve a causa di disidratazione o da una prolungata esposizione di luce rossa 630 nm all'interno di questi intervalli di tempo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Girare ON the 850 nm infrarossi sorgente luminosa LED per visualizzare le larve nel video. Avviare la fotocamera CCD per registrare il movimento larvale.</li>
	<li>Utilizzando il software associato al processore di Raspberry Pi, programma la procedura per l'amministrazione di modelli appropriati di stimolazione di luce rossa. Nota: Una serie di semplici comandi basato su Python può essere facilmente adattata ai modelli di programma di stimoli luminosi LED (vedere file di sintassi).</li>
</ol>4. elaborazione dei dati e analisi
<ol><li>Importare i video registrati di ogni prova in qualsiasi software di programmazione disponibile come Matlab.</li>
	<li>Ottenere le coordinate XY di ogni larva in un film come funzione del tempo. Basato su limiti del software di monitoraggio, 15 – 20 terza-instar larve possono essere monitorate in un unico filmato1,8. Nota: Viene fornito un set di semplici codici Matlab ('Tracklarva') che può essere facilmente adattato per soddisfare le condizioni appropriate (vedere file di sintassi). Questo programma combina tutte le prove in un esperimento e uscite le coordinate XY di ogni larva per tutta la durata del test (Vedi la sintassi del codice qui sotto). In alternativa, uno può usare diversi programmi basati su open source che sono liberamente disponibili per i ricercatori. Ad es. JAABA (http://jaaba.sourceforge.net/)12.</li>
	<li>
Utilizzare le coordinate XY generate per tracciare traiettorie larvale e analizzare ulteriormente locomozione larvale.
	<ol>
<li>Per analisi di comportamento, è possibile utilizzare le statistiche navigazione quali velocità, percorso della curvatura, angolo di intestazione, per segmentare individuali larvale traiettorie in alternando sequenze di piste e si trasforma.</li>
		<li>Funzionamenti sono definiti come periodi continui di movimento in avanti. Turni separano esecuzioni successive. Giri vengono contrassegnati quando cambiamenti agli angoli di orientamento traiettoria erano > 45° (vedere file di sintassi).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Calcolare i valori medi di velocità di esecuzione, esecuzione lunghezza, direzione e altri parametri come richiesto. Nota: Viene fornito un set di sintassi semplice per estrarre 'corre' e 'si ferma' da larvale traiettorie (vedere file di sintassi). Semplice Matlab o Excel funzioni base possono essere applicate ai dati estratti per calcolare valori per 'velocità', 'Esegui lunghezza' ecc.</li>
	<li>Rappresentare i dati per ogni metrica comportamentale come media ± SEM</li>
</ol>

<ol><li>Mathew, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+diversity+among+sensory+receptors+in+a+Drosophila+olfactory+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Functional diversity among sensory receptors in a Drosophila olfactory circuit.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 2134-2143 (2013).</li>
<li>Ramaekers, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glomerular+maps+without+cellular+redundancy+at+successive+levels+of+the+Drosophila+larval+olfactory+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Current+biology+%3A+CB%22%5BJournal%5D)">Glomerular maps without cellular redundancy at successive levels of the Drosophila larval olfactory circuit.</a> Current biology : CB. 15, 982-992 (2005).</li>
<li>Couto, A., Alenius, M., Dickson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular%2C+anatomical%2C+and+functional+organization+of+the+Drosophila+olfactory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Current+biology+%3A+CB%22%5BJournal%5D)">Molecular, anatomical, and functional organization of the Drosophila olfactory system.</a> Current biology : CB. 15, 1535-1547 (2005).</li>
<li>Kreher, S. A., Kwon, J. Y., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+basis+of+odor+coding+in+the+Drosophila+larva%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The molecular basis of odor coding in the Drosophila larva.</a> Neuron. 46, 445-456 (2005).</li>
<li>Kreher, S. A., Mathew, D., Kim, J., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translation+of+sensory+input+into+behavioral+output+via+an+olfactory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Translation of sensory input into behavioral output via an olfactory system.</a> Neuron. 59, 110-124 (2008).</li>
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<li>Monte, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+larval+olfactory+response+in+Drosophila+and+its+genetic+basis%5BTitle%5D)+AND+%22Behav+Genet%22%5BJournal%5D)">Characterization of the larval olfactory response in Drosophila and its genetic basis.</a> Behav Genet. 19, 267-283 (1989).</li>
<li>Gershow, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+airborne+cues+to+study+small+animal+navigation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">Controlling airborne cues to study small animal navigation.</a> Nature methods. 9, 290-296 (2012).</li>
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<li>Hernandez-Nunez, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse-correlation+analysis+of+navigation+dynamics+in+Drosophila+larva+using+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Reverse-correlation analysis of navigation dynamics in Drosophila larva using optogenetics.</a> eLife. 4, (2015).</li>
<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li>
<li>Kabra, M., Robie, A. A., Rivera-Alba, M., Branson, S., Branson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JAABA%3A+interactive+machine+learning+for+automatic+annotation+of+animal+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">JAABA: interactive machine learning for automatic annotation of animal behavior.</a> Nature methods. 10, 64-67 (2013).</li>
<li>Newquist, G., Novenschi, A., Kohler, D., Mathew, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+contributions+of+Olfactory+Receptor+Neurons+in+a+Drosophila+olfactory+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Differential contributions of Olfactory Receptor Neurons in a Drosophila olfactory circuit.</a> eNeuro. 3, (2016).</li>
<li>Schulze, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamical+feature+extraction+at+the+sensory+periphery+guides+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Dynamical feature extraction at the sensory periphery guides chemotaxis.</a> eLife. 4, (2015).</li>
<li>Tastekin, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+Subesophageal+Zone+in+Sensorimotor+Control+of+Orientation+in+Drosophila+Larva%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Role of the Subesophageal Zone in Sensorimotor Control of Orientation in Drosophila Larva.</a> Current Biology. 25, 1448-1460 (2015).</li>
<li>Famiglietti, E. V., Kolb, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+ON-and+OFF-center+responses+in+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structural basis for ON-and OFF-center responses in retinal ganglion cells.</a> Science. 194, 193-195 (1976).</li>
<li>Luo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bidirectional+thermotaxis+in+Caenorhabditis+elegans+is+mediated+by+distinct+sensorimotor+strategies+driven+by+the+AFD+thermosensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Bidirectional thermotaxis in Caenorhabditis elegans is mediated by distinct sensorimotor strategies driven by the AFD thermosensory neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 2776-2781 (2014).</li>
<li>Berck, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+wiring+diagram+of+a+glomerular+olfactory+system%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">The wiring diagram of a glomerular olfactory system.</a> eLife. 5, (2016).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Qui, abbiamo descritto un metodo che consente la misurazione di Drosophila comportamento larvale in risposta all'attivazione di optogenetica simultanea dei neuroni olfattivi. Precedentemente descritto larvale metodi1,di rilevamento8 utilizzano la tecnologia di consegna di odore diverso per attivare ORNs. Tuttavia, questi metodi non possono controllare per la specificità o un pattern temporale di attivazione ORN. Il nostro metodo supera questi deficit ut...

Informazioni olfattive in ambiente di una larva di Drosophila sono percepite dal solo 21 ORNs funzionalmente distinte, le attività di cui in definitiva determinare comportamento larvale1,2,3,4. Ancora, relativamente piccolo è conosciuto circa la logica con cui informazioni sensoriali sono codificate nelle attività di questi 21 ORNs. C'è quindi la necessità di misurare sperimentalmente i contributi funzionali di ogni ORN larvale di comportamento.
Anche se il profilo di risposta sensoriale di tutto il repertorio di Drosophila larvale ORNs è stato studiato in dettaglio1,4,5, i contributi dei singoli ORNs al circuito olfattivo e quindi a comportamento di navigazione rimangono in gran parte sconosciuti. Difficoltà negli studi di comportamento larvale, finora, a causa dell'incapacità spazialmente e temporalmente attivare singole ORNs. Un pannello di odorizzazione che specificamente attivare 19 del 21 ORNs larvale di Drosophila è stata recentemente descritta1. Ogni odorant nel pannello, a basse concentrazioni, suscita una risposta fisiologica solo da sue cognate ORN. Tuttavia, a concentrazioni più elevate che sono normalmente utilizzati per le analisi di comportamento convenzionale, ogni odorant suscita risposte fisiologiche da più ORNs1,5,6. Ulteriormente, odoranti in questo pannello hanno variato le volatilità che complicano l'interpretazione degli studi di comportamento che dipendono dalla formazione di odore stabile pendenze7,8. Infine, gli stimoli d'avvenimento di odore hanno naturalmente un componente temporale che è difficile da replicare in condizioni di laboratorio. Pertanto è importante sviluppare un metodo che può misurare il comportamento larvale durante l'attivazione simultanea di ORNs individuali in modo spaziale e temporale.
Qui, dimostriamo che un metodo che presenta i vantaggi sopra precedentemente descritto rilevamento larvale dosaggi1,8. L'analisi di rilevamento descritto in Gershow et al. utilizza valvole controllate elettronicamente per mantenere un gradiente stabile di odore nel comportamento arena8. Tuttavia, a causa del livello di ingegneria complesso coinvolto costruire il setup di stimolo di odore, questo metodo è difficile da replicare in altri laboratori. Ulteriormente, i problemi relazionati all'utilizzo odoranti specificamente attivare singole ORNs rimangono irrisolti. L'analisi di rilevamento descritto in Mathew et al. utilizza un sistema di consegna di odore più semplice, ma la pendenza risultante di odore è dipenda dalla volatilità dei test odorant ed è instabile per lunghi periodi di analisi1. Così, sostituendo gli stimoli odore con stimoli leggeri, il nostro metodo ha i vantaggi della specificità e preciso controllo temporale di attivazione ORN e non è dipendente da formazione di gradienti di odore di diversi punti di forza.
Il nostro metodo è facile da configurare ed è adatto per i ricercatori interessati a misurare gli aspetti della navigazione larvale della drosofila . Questa tecnica potrebbe essere adattata ad altri sistemi di modello purché il ricercatore è in grado di guidare l'espressione di CsChrimson in neuron(s) del loro sistema preferito di scelta. CsChrimson è una versione del rhodopsin canale rosso-spostato. Si attiva a lunghezze d'onda che è invisibili al sistema fototassi di larva. Siamo quindi in grado di manipolare l'attività dei neuroni con specificità, affidabilità e riproducibilità9. Modificando l'usanza scritto software per tenere conto di modifiche delle dimensioni degli oggetti, questo metodo potrebbe essere facilmente adattato per la ricerca per indicizzazione larve di altre specie di insetti.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Video camera to capture larval movement&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CCD Camera&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>106215</td><td></td></tr><tr><td>M52 to M55 Filter Thread Adapter</td><td>Edmund Optics</td><td>59-446</td><td></td></tr><tr><td>2&quot; Square Threaded Filter Holder for Imaging Lenses&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>59-445</td><td></td></tr><tr><td>RG-715, 2&quot; Sq. Longpass Filter</td><td>Edmund Optics</td><td>46-066</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Electronics for optogenetic setup&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Raspberry Pi 2B</td><td>RASPBERRY-PI.org</td><td>RPI2-MODB-V1.2</td><td></td></tr><tr><td>3 Channel programmable power supply</td><td>newegg.com</td><td>9SIA3C62037092</td><td></td></tr><tr><td>8 Channel optocoupler relay</td><td>amazon.com</td><td>6454319</td><td></td></tr><tr><td>630nm Quad-row LED strip lights</td><td>environmentallights.com</td><td>red3528-450-reel</td><td></td></tr><tr><td>850nm LED strips</td><td>environmentallights.com</td><td>wp-4000K-CC5050-60x2-kit</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Software&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ubuntu MATE v16.04</td><td>Nubuntu</td><td>https://github.com/yslo/nubuntu</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Other items&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plexiglass black acrylic</td><td>Home Depot</td><td>MC1184848bl</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Fly food and other reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nutrifly fly food</td><td>Genesee Scientific</td><td>66-112</td><td></td></tr><tr><td>Agarose powder</td><td>Genesee Scientific</td><td>20-102</td><td></td></tr><tr><td>22cm X 22cm square petri-dish</td><td>VWR Inc.</td><td>25382-327</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>84097</td><td></td></tr><tr><td>All trans-retinal</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2500</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Flies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;UAS-IVS-CsChrimson&amp;nbsp;&lt;/em&gt;</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>55134</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Orco-Gal4&lt;/em&gt;</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>26818</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Or42a-Gal4&lt;/em&gt;</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>9970</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Or7a-Gal4&lt;/em&gt;</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>23907</td><td></td></tr></tbody></table>

tracking drosophila larval behavior in response to optogenetic stimulation of olfactory neurons

La capacità degli insetti di navigare verso le fonti di odore si basa sulle attività del loro primo ordine neuroni olfattivi (ORNs). Mentre una notevole quantità di informazioni è stata generata per quanto riguarda ORN risposte a odoranti, il ruolo di specifici ORNs in risposte comportamentali di guida rimane capito male. Complicanze nelle analisi di comportamento derivano a causa della diversa volatilità di odorizzazione che attivano ORNs singole, multiple ORNs attivato dal singolo odoranti e la difficoltà nella replica naturalmente osservate variazioni temporali in stimoli olfattivi utilizzando metodi convenzionali odore-consegna in laboratorio. Qui, descriviamo un protocollo che analizza il comportamento larvale della drosofila in risposta alla stimolazione simultanea optogenetica di sua ORNs. La tecnologia optogenetica qui permette per la specificità di attivazione ORN e un controllo preciso del pattern temporale di attivazione ORN. Corrispondente movimento larvale viene tenuta traccia, digitalmente registrati e analizzati utilizzando scritta software personalizzata. Sostituendo gli stimoli odore con stimoli leggeri, questo metodo consente un controllo più preciso di attivazione ORN individuale al fine di studiare il suo impatto sul comportamento larvale. Il nostro metodo potrebbe essere esteso a studiare l'impatto dei neuroni di proiezione di secondo ordine (PNs) così come i neuroni locali (LNs) sul comportamento larvale. Questo metodo permetterà dunque una dissezione completa della funzione olfattiva circuito e complemento studi sulle attività del neurone olfattivo come traducono risposte di comportamento.

Per illustrare la specificità di attivazione ORN, il nostro metodo è stato applicato con successo per determinare l'impatto di due differenti ORN (ORN::7a & ORN::42a) (ORNs che esprimono Or7a o Or42a) attivazione sul comportamento larvale (Figura 3). Coerente con gli studi recenti di quell'individuo ORNs larvale sono funzionalmente distinte1,10,13, nostri dati rapp...

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Monitoraggio del comportamento larvale della Drosophila in risposta alla stimolazione optogenetica dei neuroni olfattivi | Neuroscienze | Video

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

Questo protocollo analizza il comportamento di navigazione di Drosophila larva in risposta alla stimolazione simultanea optogenetica dei suoi neuroni olfattivi. Luce di lunghezza d'onda di 630 nm viene utilizzata per attivare i singoli neuroni olfattivi, esprimendo una rodopsina canale rosso-spostato. Larvale movimento viene registrato contemporaneamente, registrato in digitale e analizzati utilizzando il software personalizzato.

Il comportamento larvale della drosofila in risposta alla stimolazione optogenetica dei neuroni olfattivi di rilevamento

The ability of insects to navigate toward odor sources is based on the activities of their first-order olfactory receptor neurons (ORNs). While a ...

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7.2K Views.  University of Nevada. Questo protocollo analizza il comportamento di navigazione di Drosophila larva in risposta alla stimolazione simultanea optogenetica dei suoi neuroni olfattivi. Luce di lunghezza d'onda di 630 nm viene utilizzata per attivare i singoli neuroni olfattivi, esprimendo una rodopsina canale rosso-spostato. Larvale movimento viene registrato contemporaneamente, registrato in digitale e analizzati utilizzando il software personalizzato.

Video: Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

High-resolution Measurement of Odor-Driven Behavior in Drosophila Larvae

Olfactory responses in Drosophila larvae have been traditionally studied in Petri dishes comprising a single peripheral odor source. In this behavioral paradigm, the experimenter usually assumes that the rapid diffusion of odorant molecules from the source leads to the creation of a stable gradient in the dish. To establish a quantitative correlation between sensory inputs and behavioral responses, it is necessary to achieve a more thorough characterization of the odorant stimulus conditions. In this video article, we describe a new method allowing the construction of odorant gradients with stable and controllable geometries. We briefly illustrate how these gradients can be used to screen for olfactory defects (full and partial anosmia) and to study more subtle features of chemotaxis behavior.

In this video article, we describe a new method allowing the construction of odorant gradients with stable and controllable geometries. We briefly illustrate how these gradients can be used to screen for olfactory defects (full and partial anosmia) and to study more subtle features of chemotaxis behavior.

Ad alta risoluzione misurazione del comportamento Odor-Driven in Larve Drosophila

Olfactory responses in Drosophila larvae have been traditionally studied in Petri dishes comprising a single peripheral odor source. In this behavioral ...

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Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory bulb1-5. Olfactory information in the external world is transmitted to the antennal lobe by olfactory sensory neurons (OSNs), which segregate to distinct regions of neuropil called glomeruli according to the specific olfactory receptor they express. Here, OSN axons synapse with both local interneurons (LNs), whose processes can innervate many different glomeruli, and projection neurons (PNs), which convey olfactory information to higher olfactory brain regions.
Optical imaging of the activity of OSNs, LNs and PNs in the antennal lobe - traditionally using synthetic calcium indicators (e.g. calcium green, FURA-2) or voltage-sensitive dyes (e.g. RH414) - has long been an important technique to understand how olfactory stimuli are represented as spatial and temporal patterns of glomerular activity in many species of insects6-10. Development of genetically-encoded neural activity reporters, such as the fluorescent calcium indicators G-CaMP11,12 and Cameleon13, the bioluminescent calcium indicator GFP-aequorin14,15, or a reporter of synaptic transmission, synapto-pHluorin16 has made the olfactory system of the fruitfly, Drosophila melanogaster, particularly accessible to neurophysiological imaging, complementing its comprehensively-described molecular, electrophysiological and neuroanatomical properties2,4,17. These reporters can be selectively expressed via binary transcriptional control systems (e.g. GAL4/UAS18, LexA/LexAop19,20, Q system21) in defined populations of neurons within the olfactory circuitry to dissect with high spatial and temporal resolution how odor-evoked neural activity is represented, modulated and transformed22-24.
Here we describe the preparation and analysis methods to measure odor-evoked responses in the Drosophila antennal lobe using G-CaMP25-27. The animal preparation is minimally invasive and can be adapted to imaging using wide-field fluorescence, confocal and two-photon microscopes.

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

We describe an established technique to measure and analyze odor-evoked calcium responses in the antennal lobe of living Drosophila melanogaster.

Imaging di calcio di cattivi odori evocati risposte nel Drosophila Lobe antenne

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory ...

Neuroscienze

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

A growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive manipulation of the neural activity of specific neurons in Drosophila melanogaster1. Chief among these are optogenetic tools, which enable the activation or silencing of specific neurons in the intact and freely moving animal using bright light. Channelrhodopsin (ChR2) is a light-activated cation channel that, when activated by blue light, causes depolarization of neurons that express it. ChR2 has been effective for identifying neurons critical for specific behaviors, such as CO2 avoidance, proboscis extension and giant-fiber mediated startle response2-4. However, as the intense light sources used to stimulate ChR2 also stimulate photoreceptors, these optogenetic techniques have not previously been used in the visual system. Here, we combine an optogenetic approach with a mutation that impairs phototransduction to demonstrate that activation of a cluster of loom-sensitive neurons in the fly's optic lobe, Foma-1 neurons, can drive an escape behavior used to avoid collision. We used a null allele of a critical component of the phototransduction cascade, phospholipase C-&beta;, encoded by the norpA gene, to render the flies blind and also use the Gal4-UAS transcriptional activator system to drive expression of ChR2 in the Foma-1 neurons. Individual flies are placed on a small platform surrounded by blue LEDs. When the LEDs are illuminated, the flies quickly take-off into flight, in a manner similar to visually driven loom-escape behavior. We believe that this technique can be easily adapted to examine other behaviors in freely moving flies.

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

Genetically encoded optogenetic tools enable noninvasive manipulation of specific neurons in the Drosophila brain. Such tools can identify neurons whose activation is sufficient to elicit or suppress particular behaviors. Here we present a method for activating Channelrhodopsin2 that is expressed in targeted neurons in freely walking flies.

Stimolazione Optogenetic del comportamento in Fuga<em&gt; Drosophila melanogaster</em

A  growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive  manipulation of the neural activity of specific neurons in ...

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Drosophila larval locomotion is a splendid model system in developmental and physiological neuroscience, by virtue of the genetic accessibility of the underlying neuronal components in the circuits1-6. Application of optogenetics7,8 in the larval neural circuit allows us to manipulate neuronal activity in spatially and temporally patterned ways9-13. Typically, specimens are broadly illuminated with a mercury lamp or LED, so specificity of the target neurons is controlled by binary gene expression systems such as the Gal4-UAS system14,15. In this work, to improve the spatial resolution to "sub-genetic resolution", we locally illuminated a subset of neurons in the ventral nerve cord using lasers implemented in a conventional confocal microscope. While monitoring the motion of the body wall of the semi-intact larvae, we interactively activated or inhibited neural activity with channelrhodopsin16,17 or halorhodopsin18-20, respectively. By spatially and temporally restricted illumination of the neural tissue, we can manipulate the activity of specific neurons in the circuit at a specific phase of behavior. This method is useful for studying the relationship between the activities of a local neural assembly in the ventral nerve cord and the spatiotemporal pattern of motor output.

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Here we describe a protocol for optogenetic manipulation of motoneuronal activity while monitoring changes in motor output (muscle contraction) in semi-intact Drosophila larvae using lasers within a conventional confocal microscope. This technique enables researchers to achieve local perturbation of neural activity in a few neuromeres to elucidate the dynamics of motor circuits.

Optogenetic Perturbazione di attività neurale con illuminazione laser in semi-intatte<em&gt; Drosophila</em&gt; Larve in Motion

Drosophila larval locomotion is a splendid model system in developmental and physiological neuroscience, by virtue of the genetic accessibility of the ...

Analisi del comportamento di foraggiamento indotto dallo zucchero in Drosophila

Tracking Sugar-Elicited Local Searching Behavior in Drosophila

Foraging behavior is essential for the survival of organisms as it enables them to locate and acquire essential food resources. In Drosophila, hunger triggers a distinct search behavior following the consumption of small quantities of a sugar solution. This report presents a simple experimental setup to study sugar-elicited search behavior with the aim of uncovering the underlying mechanisms. Minute quantities of concentrated sugar solution elicit sustained searching behavior in flies. The involvement of path integration in this behavior has been established, as flies utilize their trajectory to return to the sugar location. The most recent findings provide evidence of temporal modulation in the initiation and intensity of the search behavior after sugar intake. We have also used this setup for artificial activation of specific taste-receptor neurons in the pharynx, which elicits the search behavior. The Drosophila neurogenetic toolkit offers a diverse array of tools and techniques that can be combined with the sugar-elicited search behavior paradigm to study the neural and genetic mechanisms underlying foraging. Understanding the neural basis of hunger-driven searching behavior in flies contributes to the field of neurobiology as a whole, offering insights into the regulatory mechanisms that govern feeding behaviors not only in other organisms but also in humans.

Autore in primo piano: Esplorare i percorsi comportamentali attraverso intuizioni interspecie nel foraggiamento e nella comunicazione

This protocol describes a behavioral assay for recording sugar-elicited search behavior using Drosophila melanogaster. The assay can be utilized to study feeding and foraging-related behaviors, as well as the underlying neuronal mechanisms.

Monitoraggio del comportamento di ricerca locale indotto dallo zucchero in Drosophila

Foraging behavior is essential for the survival of organisms as it enables them to locate and acquire essential food resources. In Drosophila, hunger ...

Comportamento

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

In their natural environment, insects such as the vinegar fly Drosophila melanogaster are bombarded with a huge amount of chemically distinct odorants. To complicate matters even further, the odors detected by the insect nervous system usually are not single compounds but mixtures whose composition and concentration ratios vary. This leads to an almost infinite amount of different olfactory stimuli which have to be evaluated by the nervous system.
To understand which aspects of an odor stimulus determine its evaluation by the fly, it is therefore desirable to efficiently examine odor-guided behavior towards many odorants and odor mixtures. To directly correlate behavior to neuronal activity, behavior should be quantified in a comparable time frame and under identical stimulus conditions as in neurophysiological experiments. However, many currently used olfactory bioassays in Drosophila neuroethology are rather specialized either towards efficiency or towards resolution.
Flywalk, an automated odor delivery and tracking system, bridges the gap between efficiency and resolution. It allows the determination of exactly when an odor packet stimulated a freely walking fly, and to determine the animal&#180;s dynamic behavioral reaction.

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

The automated tracking system Flywalk is used for high-resolution quantification of odor-guided behavior in Drosophila melanogaster.

Ad alta risoluzione quantificazione del comportamento Odor-guidata<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Utilizzo della<em&gt; Flywalk</em&gt; Paradigm

In their natural environment, insects such as the vinegar fly Drosophila melanogaster are bombarded with a huge amount of chemically distinct odorants. To ...

Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer

A key challenge in neurobiology is to understand how neural circuits function to guide appropriate animal behaviors. Drosophila melanogaster is an excellent model system for such investigations due to its complex behaviors, powerful genetic techniques, and compact nervous system. Laboratory behavioral assays have long been used with Drosophila to simulate properties of the natural environment and study the neural mechanisms underlying the corresponding behaviors (e.g. phototaxis, chemotaxis, sensory learning and memory)1-3. With the recent availability of large collections of transgenic Drosophila lines that label specific neural subsets, behavioral assays have taken on a prominent role to link neurons with behaviors4-11. Versatile and reproducible paradigms, together with the underlying computational routines for data analysis, are indispensable for rapid tests of candidate fly lines with various genotypes. Particularly useful are setups that are flexible in the number of animals tested, duration of experiments and nature of presented stimuli. The assay of choice should also generate reproducible data that is easy to acquire and analyze. Here, we present a detailed description of a system and protocol for assaying behavioral responses of Drosophila flies in a large four-field arena. The setup is used here to assay responses of flies to a single olfactory stimulus; however, the same setup may be modified to test multiple olfactory, visual or optogenetic stimuli, or a combination of these. The olfactometer setup records the activity of fly populations responding to odors, and computational analytical methods are applied to quantify fly behaviors. The collected data are analyzed to get a quick read-out of an experimental run, which is essential for efficient data collection and the optimization of experimental conditions.

Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer

We describe here a behavioral setup and data analysis method for assaying olfactory responses of up to 100 vinegar flies (Drosophila melanogaster). This system may be used with single or multiple olfactory stimuli, and adaptable for optogenetic activation or silencing of neuronal subsets.

Comportamenti olfattive analizzati da Computer di monitoraggio di<em&gt; Drosophila</em&gt; In un Olfattometro quattro quadranti

A key challenge in neurobiology is to understand how neural circuits function to guide appropriate animal behaviors. Drosophila melanogaster is an ...

Light Spot-Based Assay for Analysis of Drosophila Larval Phototaxis

The larvae of Drosophila melanogaster show obvious light-avoiding behavior during the foraging stage. Drosophila larval phototaxis can be used as a model to study animal avoidance behavior. This protocol introduces a light-spot assay to investigate larval phototactic behavior. The experimental set-up includes two main parts: a visual stimulation system that generates the light spot, and an infrared light-based imaging system that records the process of larval light avoidance. This assay allows tracking of the behavior of larva before entering, during encountering, and after leaving the light spot. Details of larval movement including deceleration, pause, head casting, and turning can be captured and analyzed using this method.

Light Spot-Based Assay for Analysis of Drosophila Larval Phototaxis

This protocol introduces a light-spot assay to investigate Drosophila larval phototactic behavior. In this assay, a light spot is generated as light stimulation, and the process of larval light avoidance is recorded by an infrared light-based imaging system.

Analisi basata su macchie di luce per l'analisi di Drosophila Larval Phototaxis

The larvae of Drosophila melanogaster show obvious light-avoiding behavior during the foraging stage. Drosophila larval phototaxis can be used as a model ...

Il comportamento larvale della drosofila in risposta alla stimolazione optogenetica dei neuroni olfattivi di rilevamento

Riepilogo

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Ad alta risoluzione misurazione del comportamento Odor-Driven in Larve Drosophila

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Stimolazione Optogenetic del comportamento in Fuga

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Monitoraggio del comportamento di ricerca locale indotto dallo zucchero in Drosophila

Monitoraggio del comportamento di ricerca locale indotto dallo zucchero in Drosophila

Monitoraggio del comportamento di ricerca locale indotto dallo zucchero in Drosophila

Ad alta risoluzione quantificazione del comportamento Odor-guidata

Comportamenti olfattive analizzati da Computer di monitoraggio di

Analisi basata su macchie di luce per l'analisi di Drosophila Larval Phototaxis