Sincronizzare la Drosophila per definire i tempi circadiani è il primo passo nello studio di eventi che controllano o rispondono all'orologio biologico. La sincronizzazione di tutti i modelli seguirà lo stesso approccio di base. Ci sono molti passaggi per farlo pratico e può sembrare travolgente metterli tutti insieme.
Aspettatevi di provare un paio di volte prima che si senta naturale. Mantieni le temperature stabili e voglio che la luce si esimi durante i tre minuti. Preparare il fly food in un Crock-Pot a 121 gradi Celsius, mescolando man mano che vengono aggiunti gli ingredienti.
Coprire il Crock-Pot e portare il contenuto a ebollizione, mescolando il contenuto ogni 10 minuti. Dopo 20 minuti a ebollizione, spegnere il fuoco e aggiungere 83,6 millilitri di acqua al Crock-Pot. Lasciare il coperchio spento mentre il cibo si raffredda.
Mentre il cibo si raffredda, mescolarlo ogni 10 minuti per evitare di consentire la forma di una pellicola sulla parte superiore. Misurare anche la temperatura ogni 10 minuti con un termometro in vetro. Una volta che il cibo si è raffreddato a meno di 60 gradi Celsius, aggiungere Tegosept e acido propionico, come descritto nel manoscritto.
Mescolare bene e regolare il Crock-Pot per mantenere una temperatura, solo pochi gradi inferiore a 60 gradi Celsius. Utilizzare una pompa peristaltica per distribuire il cibo a mosca. Per fiale strette, pompare 10 millilitri e per bottiglie inferiori quadrate da sei oncia, pompare 60 millilitri.
Conservare le mosche di tipo selvatico a 25 gradi Celsius per 10-12 giorni, fino a quando circa 200 pupe sono attaccate all'interno della bottiglia. Per rimuovere gli adulti dalla bottiglia, puntarli in una nuova bottiglia e utilizzare l'estremità opaca di un pennello numero zero per spingere tutti gli adulti rimanenti. Pulire il pennello con il 70% di etanolo prima e dopo l'uso.
Incubare le pupe a 25 gradi Celsius per consentire alla prossima generazione di emergere. Dopo tre giorni, le mosche avranno da zero a tre giorni. Ricorda che la temperatura, la luce e persino la tua scelta di cibo influenzeranno l'intrappolamento.
Assicurati di tenerli, ogni controllo durante l'esperimento. Nei punti di tempo designati per la raccolta, utilizzare un cuscinetto per anestesia di anidride carbonica per immobilizzare le mosche e raccogliere 100 maschi e 100 femmine. Le mosche femminili sono molto più grandi dei maschi.
Le mosche possono anche essere differenziate esaminando i genitali. I maschi hanno genitali scuri arrotondati, mentre le femmine hanno genitali più chiari e appuntiti. Posizionare maschi e femmine in fiale separate con 100 femmine per flaconcino e 50 maschi per flaconcino.
Le interazioni sociali maschili portano a molti decessi quando ci sono 100 individui in una fiala. Per consentire l'intrappolamento circadiano, posizionare le fiale in incubatori regolati dalla luce per tre o cinque giorni. Per produrre mosche per l'intrappolamento futuro, posizionare 25 delle femmine rimanenti e da cinque a sette dei maschi rimanenti in una nuova bottiglia.
Incubare la bottiglia a 25 gradi Celsius. Per ogni 100 mosche che verranno raccolte. Preparare una fiala stretta aggiungendo 4,8 millilitri di fissatore.
Posiziona le fiale strette in un secchio di ghiaccio e porta il secchio, gli asciugamani di carta, il foglio e il nastro adesivo nell'incubatrice. Per raccogliere le mosche, posizionare un imbuto nella fiala stretta, quindi rimuovere il cappuccio dalla fiala delle mosche e invertirlo rapidamente nell'imbuto. Tocca delicatamente per aiutare a guidare le mosche nel flaconcino del fissatore.
Quando raccogli i maschi, combina due fiale da 50 mosche in un unico flaconcino stretto. Avvolgere le fiale per ZT13 e ZT19 in un foglio. Dopo aver trasferito le mosche, nastro i tappi in posizione per evitare fuoriuscite.
Posizionare i flaconcini sul miscelatore di nutating a 165 giri/min e quattro gradi Celsius per quattro ore. Le mosche non sono più sensibili alla luce, quindi, la lamina può essere rimossa per verificare che le mosche siano sommerse nel fissatore. Dopo aver rimosso le fiale dal miscelatore di nutating, rimuovere la formaldeide, quindi lavare le mosche tre volte con 3000 microlitri di 1X PBS, invertendo il flaconcino durante ogni lavaggio.
Conservare le fiale a quattro gradi Celsius, in attesa della futura immunofluorescenza. La luce e l'oscurità erano usate per intrappolare le mosche verso i cicli circadiani. L'intrappolamento è stato verificato mediante immunoblotting e l'analisi dell'immunofluorescenza della proteina del periodo, un marcatore per l'intrappolamento circadiano.
L'immunoblotting di estratti di cellule intere, preparati da teste di mosche intrappolate, mostra un modello canonico di mobilità e intensità delle proteine del periodo. L'immunofluorescenza dei cervelli intrappolati, raccolta a ZT1, mostra proteine d'epoca in modello caratteristico. Questo metodo è un punto di partenza per immunofluorescente, immunoplotting, immunoprecipitazione, analisi comportamentale e qualsiasi altra tecnica che potresti voler usare per confrontare come cambia il percorso mentre l'orologio biologico ticchetta.
Con la capacità di intrappolare il tuo organismo modello, puoi chiedere se il tuo percorso preferito cambia nel tempo e se gli effetti nel tuo percorso preferito possono portare all'interruzione del biologico. Una serie di malattie sono peggiorate quando l'orologio biologico viene interrotto. L'individuazione dei meccanismi di base ci aiuterà a creare farmaci più efficaci per le persone affette da malattie, come il morbo di Alzheimer e il morbo di Parkinson.
