Siamo grati ai dottori Aravinthan Samuel e Marc Gershow che hanno contribuito a sviluppare la versione iniziale dell'apparato comportamentale e a Matthew Batie che ha modificato l'apparato comportamentale. Questa ricerca è stata supportata da Trustee Grant del Cincinnati Children's Hospital, JST/PRESTO, March of Dimes e NIH R01 GM107582 to F.N.H.

1. Preparazione delle mosche
<ol><li>Esperimenti light dark (LD)
	<ol>
<li>Sollevare le mosche negli incubatori (25 °C/40-60% di umidità relativa (RH)) sotto cicli leggeri di 12 ore /buio di 12 ore (LD). L'intensità luminosa degli incubatori è di ~ 500-1.000 lux.</li>
		<li>Due incubatori sono necessari per completare i test comportamentali per un periodo di 24 ore. Entrambi gli incubatori dovrebbero avere una luce programmabile con funzioni ON OFF. Dovrebbero anche avere porte solide che non sono permeabili alla luce(cioè senza vetro o plexiglass). Nota: un incubatore deve essere designato come incubatore "giorno" e impostato su un ciclo LD di 12 ore di luce e 12 ore di buio. Il secondo incubatore deve essere designato come incubatore "notturno" e impostato sull'inverso del primo con 12 ore scure seguito da 12 ore di luce. L'incubatore notturno deve essere posizionato nella stanza accessibile al buio, in modo tale che le mosche che vivono le condizioni notturne siano facilmente accessibili per gli esperimenti.</li>
		<li>Posizionare le fiale di mosca negli incubatori diurni o notturni. Raccogli le mosche appena schiuse in una fiala fresca, 20-30 per saggio e tieni nella stessa incubatrice per 2-3 giorni.</li>
		<li>Dopo 2-3 giorni, utilizzare le mosche per il saggio comportamentale delle preferenze di temperatura.<ol>
<li>Per gli esperimenti diurni (tempo Zeitgeber (ZT) 0-12), raccogli le mosche dall'incubatore diurno.</li>
			<li>Poco prima degli esperimenti comportamentali, eserti le fiale di mosca raccolte dall'incubatrice del giorno.</li>
			<li>Per gli esperimenti notturni (ZT 13-24), raccogli le mosche dall'incubatore notturno.</li>
			<li>Proprio prima degli esperimenti comportamentali, eseminare le fiale di mosca raccolte dall'incubatrice notturna, avvolgere con un foglio di alluminio e posizionare in una scatola nella stanza buia sotto una lampada rossa. Nota: Poiché il saggio comportamentale di preferenza di temperatura viene eseguito al buio per gli esperimenti notturni, l'esposizione alla luce alle mosche deve essere prevenuta fino alla fine degli esperimenti comportamentali. Nota: Le mosche non devono essere esposte all'anidride carbonica il giorno in cui devono avvenire gli esperimenti.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Esperimenti di oscurità costante (DD)
	<ol>
<li>
Giorno del DD
		<ol>
<li>Un incubatore aggiuntivo è necessario per gli esperimenti del DD day, che ci riferiamo come un incubatore di "transizione" per il resto del manoscritto. L'incubatore di transizione deve essere posizionato nella stanza accessibile al buio, in modo tale che le mosche che sperimentano condizioni DD siano facilmente accessibili per gli esperimenti. Un programma di luce di esempio per un incubatore di transizione avrebbe la luce ON dalle 13:00 alle 19:00 e la luce SPENTA alle 19:00-13:00(Figura 1).</li>
			<li>Raccogli le mosche che sono state sollevate nell'incubatrice del giorno. Posizionare le fiale di volo nell'incubatore di transizione tra le 13:00 e le 19:00, quando la luce è attiva. In questo modo, le mosche sono adeguatamente esposte alla luce fino alle 19:00, quando la luce si spegne.</li>
			<li>Il giorno successivo, prima delle 13:00, in condizioni di buio, eserti le fiale di mosca dall'incubatrice di transizione, avvolgerle con un foglio di alluminio e posizionarle in una scatola. Tenere la scatola in qualsiasi incubatore per un altro giorno.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Notte DD
		<ol>
<li>Raccogli le mosche che sono state sollevate nell'incubatrice notturna al buio sotto una lampada rossa. Oppure raccogli le mosche quando la luce dell'incubatore notturno è on.</li>
			<li>Avvolgere le fiale raccolte con un foglio di alluminio al buio ogni volta che le luci sono spente e posizionare le fiale in una scatola. Tenere la scatola in qualsiasi incubatore per altri due giorni(figura 1B). Nota: Poiché il saggio comportamentale di preferenza di temperatura viene eseguito al buio per gli esperimenti notturni, l'esposizione alla luce alle mosche deve essere prevenuta fino alla fine degli esperimenti comportamentali.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Esperimenti di luce costante (LL)
	<ol>
<li>
LL Day
		<ol>
<li>Un incubatore extra è necessario per gli esperimenti ll day. Questo incubatore mantiene la condizione LL (25 °C, 800 lux), con la luce intensa continuamente.</li>
			<li>Raccogli le mosche che sono state allevate nell'incubatrice del giorno. Posizionare le fiale di mosca nell'incubatore LL in qualsiasi momento durante il loro "giorno".</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Notte LL
		<ol>
<li>Raccogli le mosche che sono state sollevate nell'incubatrice notturna. Trasferire le fiale di mosca dall'incubatore notturno all'incubatore LL durante il periodo in cui la luce nell'incubatore notturno è on. Nota: ad esempio, la luce si spegne alle 7 del mattino nell'incubatore notturno. Trasferire le fiale di mosca dall'incubatore notturno all'incubatore LL prima delle 7 del mattino e tenere le fiale nell'incubatore LL per altri 4 giorni. Nota: Al giorno 4 in condizioni LL, l'oscillazione dell'attività locomotoriaviene abolita 15,16, mentre il TPR è ancora sostenuto 3.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>2. L'apparato per il saggio comportamentale di preferenza della temperatura
<ol><li>Posizionare un coperchio in plexiglass (29 cm x 19,2 cm) (Figura 4) su una piastra di alluminio.</li>
	<li>Monitorare la temperatura dell'aria tra la piastra e il coperchio. Sei sonde di temperatura sono attaccate in varie posizioni all'interno del coperchio all'interno di una delle corsie(figura 2). Nota: assicurarsi che le sonde non tocchino né la piastra di alluminio né il coperchio in plexiglass. La temperatura dell'aria deve essere impostata su un gradiente da 18-32 °C.</li>
	<li>Posizionare l'apparecchio in una stanza ambientale mantenuta a 25 °C/65-75% RH. Questa stanza deve essere sigillata da qualsiasi luce esterna. Una stanza ambientale è normalmente dotata di ventilatori per mantenere una certa temperatura e umidità. Nota: l'aria proveniente dalla ventola probabilmente disturba un gradiente di temperatura stabile sull'apparecchio. Per evitare ciò, utilizziamo un foglio trasparente che copre l'area circostante l'apparato.</li>
	<li>Preparare un termometro e un igrometro per controllare la temperatura e l'umidità nella stanza ambientale. Nota: La luce influenza la preferenza di temperatura di Drosophila3. La stessa intensità di luce deve essere fornita sull'apparecchio in modo uniforme. L'intensità delle nostre luci della camera ambientale è di ~ 800 lux. Nota: Quando gli esperimenti comportamentali sono fatti, posizionare un tubo collegato dalserbatoio di CO 2 o fornire vicino al foro della parte superiore dell'apparato per anestetizzare e sbarazzarsi delle mosche.</li>
</ol>3. Preparazione di apparecchi per l'uso
<ol><li>Accendere l'apparecchio per almeno 30 minuti per stabilire correttamente il gradiente di temperatura sulla superficie della piastra (Figura 3).</li>
	<li>Rivestire la copertura dell'apparato comportamentale con idrorepellente per evitare che le mosche si arrampicano sulle pareti o sul soffitto della copertura. Pulire il idrorepellente in eccesso e lasciare asciugare il coperchio per 25-30 minuti.</li>
	<li>Rimuovere la condensa sulla piastra di alluminio. Posizionare il coperchio in plexiglass sulla piastra di alluminio e fissare con sei morsetti C(Figura 2). Nota: È molto importante che il coperchio sia sigillato bene, se necessario può essere utilizzato nastro a doppia lecca.</li>
	<li>Lasciare il coperchio per almeno 15 minuti. Il gradiente di temperatura dell'aria tra la piastra di alluminio e il coperchio viene creato da 18-32 °C.</li>
</ol>4. Test del comportamento delle preferenze di temperatura
<ol><li>Caricare le mosche nello spazio tra la piastra di alluminio e il coperchio in plexiglass dell'apparecchio attraverso piccoli fori al centro di ogni corsia del coperchio(figure 2 e 4). Coprire i fori con scivolamenti di copertura per evitare che le mosche fuoriesano.</li>
	<li>Per le condizioni di buio, spegnere tutte le luci nella stanza ambientale. Una lampada rossa può essere utilizzata quando le mosche sono posizionate nell'apparato. Assicurarsi che le mosche non siano esposte ad alcuna luce tranne una lampada rossa fino al termine degli esperimenti comportamentali.</li>
	<li>Per ogni prova, utilizzare 20-25 mosche adulte, che non devono essere riutilizzate nelle prove successive. Il saggio comportamentale viene eseguito per 30 minuti. Scatta alcune foto con o senza flash. Fare attenzione a non fare molto rumore o movimenti improvvisi durante gli esperimenti.</li>
	<li>Registrare la temperatura di tutte e sei le sonde sull'apparecchio. Prendi nota della temperatura ambiente e dell'umidità.</li>
	<li>Anestetizza le mosche nell'apparato con gas di anidride carbonica, allenta i morsetti, rimuovi il coperchio in plexiglass e rimuovi le mosche dalla piastra. Dopo ogni esperimento, le mosche vengono scartate. Pulire la condensa o l'umidità dalla piastra. Sostituire il coperchio sulla piastra e stringere con i morsetti in preparazione per l'esperimento successivo.</li>
	<li>Per avere una rappresentazione della preferenza di temperatura per tutto il giorno, il periodo di 24 ore è diviso in otto fusi orari, quattro durante il giorno e quattro di notte. Ad esempio, usiamo questi ZT o CT 1-3, 4-6, 7-9, 10-12, 13-15, 16-18, 19-21 e 22-24. Nota: poiché le variazioni del fenotipo causate dagli effetti di mascheramento sono previste subito dopo che la luce è accesa (ZT0) o OFF (ZT12), non esaminiamo il comportamento delle preferenze di temperatura durante questi periodi (ZT o CT 0-1, 11.5-13 e 23.5-24). Per rendere statisticamente validi i risultati, devono essere fatte almeno cinque prove in ciascun fuso orario.</li>
</ol>5. Analisi dei dati
<ol><li>Calcolare il gradiente di temperatura come segue: determinare dove sono posizionate le sonde di temperatura in base ai due righelli posizionati sul lato superiore e inferiore del coperchio in plexiglass lungo i bordi (Figura 2A).</li>
	<li>Si stima che il gradiente di temperatura tra le sonde di temperatura sia lineare. In base alla posizione delle sonde di temperatura, nonché alle corrispondenti temperature registrate, tracciare linee che rappresentano ogni grado di temperatura nella posizione appropriata sulle immagini. Contare il numero di mosche situate in ogni intervallo di grado. Escludere eventuali mosche sulle pareti o sul soffitto della copertura.</li>
	<li>Calcola la percentuale di mosche in ogni intervallo di temperatura di ogni corsia. Una temperatura media preferita è calcolata sommando i prodotti della percentuale di mosche e temperatura di ciascun intervallo, come mostrato di seguito: % di mosche x 18,5 °C + % di mosche x 19,5 °C + % di mosche x 20,5 °C ....+ % di mosche x 31,5 °C + % di mosche x 32,5 °C.</li>
	<li>Calcola la temperatura media preferita in ogni fuso orario: il comportamento delle preferenze di temperatura viene eseguito >5 volte durante ogni fuso orario (ZT 1-3, 4-6, 7-9, 10-12, 13-15, 16-18, 19-21 e 22-24). Per calcolare la temperatura media preferita in ogni fuso orario, la temperatura media preferita di ogni prova viene calcolata in media insieme. Le barre di errore .m s.e. sono uguali all'errore tra le versioni di valutazione.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Krauchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+thermophysiological+cascade+leading+to+sleep+initiation+in+relation+to+phase+of+entrainment.">The thermophysiological cascade leading to sleep initiation in relation to phase of entrainment.</a> Sleep Med. Rev. 11, 439-451 (2007).</li><li>Krauchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+sleep-wake+cycle+reconsidered+from+a+thermoregulatory+point+of+view.">The human sleep-wake cycle reconsidered from a thermoregulatory point of view.</a> Physiol. Behav. 90, 236-245 (2007).</li><li>Kaneko, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+Rhythm+of+Temperature+Preference+and+Its+Neural+Control+in+Drosophila.">Circadian Rhythm of Temperature Preference and Its Neural Control in Drosophila.</a> Curr. Biol. 22, 1851-1857 (2012).</li><li>Allada, R., Chung, B. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+organization+of+behavior+and+physiology+in+Drosophila.">Circadian organization of behavior and physiology in Drosophila.</a> Annu. Rev. Physiol. 72, 605-624 (2010).</li><li>Garrity, P. A., Goodman, M. B., Samuel, A. D., Sengupta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Running+hot+and+cold:+behavioral+strategies,+neural+circuits,+and+the+molecular+machinery+for+thermotaxis+in+C.+elegans+and+Drosophila..">Running hot and cold: behavioral strategies, neural circuits, and the molecular machinery for thermotaxis in C. elegans and Drosophila..</a> Genes Dev. 24, 2365-2382 (2010).</li><li>Hamada, F. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+internal+thermal+sensor+controlling+temperature+preference+in+Drosophila.">An internal thermal sensor controlling temperature preference in Drosophila.</a> Nature. 454, 217-220 (2008).</li><li>Hong, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cAMP+signalling+in+mushroom+bodies+modulates+temperature+preference+behaviour+in+Drosophila.">cAMP signalling in mushroom bodies modulates temperature preference behaviour in Drosophila.</a> Nature. 454, 771-775 (2008).</li><li>Dillon, M. E., Wang, G., Garrity, P. A., Huey, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review:+Thermal+preference+in+Drosophila.">Review: Thermal preference in Drosophila.</a> J. Therm. Biol. 34, 109-119 (2009).</li><li>Viswanath, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opposite+thermosensor+in+fruitfly+and.">Opposite thermosensor in fruitfly and.</a> Nature. 423, 822-823 (2003).</li><li>Gallio, M., Ofstad, T. A., Macpherson, L. J., Wang, J. W., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+coding+of+temperature+in+the+Drosophila+brain.">The coding of temperature in the Drosophila brain.</a> Cell. 144, 614-624 (2011).</li><li>Stevenson, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relative+importance+of+behavioral+and+physiological+adjustments+controlling+body+temperature+in+terrestrial+ectotherms.">The relative importance of behavioral and physiological adjustments controlling body temperature in terrestrial ectotherms.</a> Am. Nat. 126 (3), (1985).</li><li>Refinetti, R., Menaker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+circadian+rhythm+of+body+temperature.">The circadian rhythm of body temperature.</a> Physiol. Behav. 51, 613-637 (1992).</li><li>Duffy, J. F., Dijk, D. J., Klerman, E. B., Czeisler, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Later+endogenous+circadian+temperature+nadir+relative+to+an+earlier+wake+time+in+older+people.">Later endogenous circadian temperature nadir relative to an earlier wake time in older people.</a> Am. J. Physiol. 275, 1478-1487 (1998).</li><li>Saper, C. B., Lu, J., Chou, T. C., Gooley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hypothalamic+integrator+for+circadian+rhythms.">The hypothalamic integrator for circadian rhythms.</a> Trends Neurosci. 28, 152-157 (2005).</li><li>Konopka, R. J., Pittendrigh, C., Orr, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+behaviour+associated+with+altered+homeostasis+and+photosensitivity+of+Drosophila+clock+mutants.">Reciprocal behaviour associated with altered homeostasis and photosensitivity of Drosophila clock mutants.</a> J. Neurogenet. 6, 1-10 (1989).</li><li>Qiu, J., Hardin, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=per+mRNA+cycling+is+locked+to+lights-off+under+photoperiodic+conditions+that+support+circadian+feedback+loop+function.">per mRNA cycling is locked to lights-off under photoperiodic conditions that support circadian feedback loop function.</a> Mol. Cell Biol. 16, 4182-4188 (1996).</li><li>Crocker, A., Sehgal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+sleep.">Genetic analysis of sleep.</a> Genes Dev. 24, 1220-1235 (1220).</li><li>Hendricks, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rest+in+Drosophila+is+a+sleep-like+state.">Rest in Drosophila is a sleep-like state.</a> Neuron. 25, 129-138 (2000).</li><li>Shaw, P. J., Cirelli, C., Greenspan, R. J., Tononi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlates+of+sleep+and+waking+in+Drosophila+melanogaster.">Correlates of sleep and waking in Drosophila melanogaster.</a> Science. 287, 1834-1837 (2000).</li><li>Parisky, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDF+cells+are+a+GABA-responsive+wake-promoting+component+of+the+Drosophila+sleep+circuit.">PDF cells are a GABA-responsive wake-promoting component of the Drosophila sleep circuit.</a> Neuron. 60, 672-682 (2008).</li></ol>

Non c'è nulla da rivelare.

Qui, illustriamo i dettagli dell'apparato comportamentale delle preferenze di temperatura e l'analisi del comportamento TPR. Drosophila mostra le caratteristiche salienti, robuste e riproducibili della TPR controllata dall'orologio. Tuttavia, i nostri dati suggeriscono che almeno due fattori, luce ambientale ed età, disturbano significativamente i fenotipi comportamentali TPR.
Osserviamo che la luce influisce significativamente sulla preferenza di temperatura in Drosophila. ...

La temperatura è un segnale ambientale onnipresente. Gli animali mostrano una varietà di comportamenti al fine di evitare temperature dannose e cercarli comodi. La drosofila mostra un robusto comportamento di preferenza dellatemperatura 6,7. Quando le mosche vengono rilasciate in un gradiente di temperatura da 18-32 °C, le mosche evitano temperature sia calde che fredde e infine scelgono una temperatura preferita di 25 °C al mattino3. I sensori di temperatura calda sono un insieme di neuroni termosensoriali, neuroni AC, che esprimono il canale del potenziale del recettore transitorio drosophila (TPR), TRPA16,9. I sensori di temperatura fredda si trovano nei segmenti 3rd antennal, poiché l'ablazione dei segmenti 3rd antennal causa la mancanza di evitare la temperatura fredda6. Recentemente, la proteina TRPP Brivido (Brv) è stata identificata10. Poiché Brv è espresso nei segmenti 3rd antennal e media il rilevamento a freddo, Brv è una possibile molecola di rilevamento a freddo, che è fondamentale per il comportamento di preferenza della temperatura. In somma, le mosche usano questi due sensori di temperatura per evitare le temperature calde e fredde e trovare una temperatura preferita.
Mentre i mammiferi generano calore per regolare la loro temperatura corporea, gli ectotermi generalmente adattano le loro temperature corporee alla temperaturaambiente 11. Alcuni ectotermi sono noti per mostrare un comportamento quotidiano di TPR che si ritiene sia una strategia per gli ectotermi per regolare il loro BTR12. Per determinare se le mosche mostravano TPR, abbiamo ripetuto l'analisi comportamentale delle preferenze di temperatura in vari punti durante un intervallo di 24 ore. Abbiamo scoperto che drosophila esibisce un TPR giornaliero, che è basso al mattino e alto la sera e segue un modello simile a quello del BTR nell'uomo13.
In Drosophila, ci sono ~150 neuroni dell'orologio nel cervello. I neuroni dell'orologio che regolano l'attività locomotoria sono chiamati oscillatori M ed E. Tuttavia, è interessante notare che gli oscillatori M ed E non regolano la TPR, invece, abbiamo mostrato che i neuroni dell'orologio DN2 nel cervello regolano la TPR ma non l'attività locomotoria. Questi dati indicano che il TPR è regolato indipendentemente dall'attività locomotoria. In particolare, il BTR dei mammiferi è anche regolato indipendentemente dall'attività locomotoria. Studi di ablazione sui ratti mostrano che il BTR è controllato attraverso specifici neuroni SCN che prendono di mira un sottoinsieme diverso di neuroni di zona subparaventricolare rispetto a quelli che controllano l'attivitàlocomotoria 14. Pertanto, i nostri dati considerano la possibilità che il BTR dei mammiferi e il TPR della mosca siano evolutivamente conservati3, poiché sia il TPR a mosca che il BTR dei mammiferi mostrano ritmi di temperatura circadiani dipendenti dall'orologio, che sono regolati indipendentemente dall'attività locomotoria.
Qui descriviamo i dettagli su come analizzare il saggio comportamentale TPR in Drosophila. Questo metodo consente l'indagine non solo del meccanismo molecolare e dei circuiti neurali della TPR, ma anche di come il cervello integra diversi segnali ambientali e orologi biologici interni.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="578">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:172px;">Bright Lab Jr. Safelight</td>
			<td style="width:109px;">Amazon</td>
			<td style="width:153px;">#B00013J8UY</td>
			<td style="width:144px;">Red light for dark rooms</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:172px;">Rain X</td>
			<td style="width:109px;">SOPUS products</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:144px;">Water repellent: Apply the plexiglass cover</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:172px;">C-Clamp</td>
			<td style="width:109px;">Home Depot</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:144px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:172px;">Temperature/hygrometer</td>
			<td style="width:109px;">Fisher</td>
			<td style="width:153px;">15-077-963</td>
			<td style="width:144px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:172px;"></td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:144px;"></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:172px;">Peltier devices</td>
			<td style="width:109px;">TE Technology, Inc.</td>
			<td style="width:153px;">HP-127-1.4-1.15-71P</td>
			<td style="width:144px;"></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:172px;">Thermometer</td>
			<td style="width:109px;">Fluke</td>
			<td style="width:153px;">Fluke 52II</td>
			<td style="width:144px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:172px;">Bench top controller</td>
			<td style="width:109px;">Oven Industries</td>
			<td style="width:153px;">5R6-570-15R and 5R6-570-24R</td>
			<td style="width:144px;"></td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:172px;">Temperature sensor probe</td>
			<td style="width:109px;">Oven Industries</td>
			<td style="width:153px;">TR67-32</td>
			<td style="width:144px;"></td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:172px;">Generic 480 Watt ATX power supply</td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:144px;">computer cooling system</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:172px;">MCR220-QP-RES Dual 120 mm Radiator with reservoir&#160;</td>
			<td style="width:109px;">Swiftech</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:144px;">computer cooling system</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:172px;">MCP350 In-Line 12V DC pump</td>
			<td style="width:109px;">Swiftech</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:144px;">computer cooling system</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:172px;">MCW50 graphics Card liquid cooler</td>
			<td style="width:109px;">Swiftech</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:144px;">computer cooling system</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:172px;">Scythe Kaze-Jyuni SY1225SL12SH fan</td>
			<td style="width:109px;">Crazy PC</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:144px;">computer cooling system</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

design and analysis of temperature preference behavior and its circadian rhythm in drosophila

L'orologio circadiano regola molti aspetti della vita, tra cui il sonno, l'attività locomotoria e i ritmi della temperatura corporea (BTR)1,2. Recentemente abbiamo identificato un nuovo output circadiano drosophila, chiamato ritmo di preferenza della temperatura (TPR), in cui la temperatura preferita nelle mosche aumenta durante il giorno e cade durante la notte 3. Sorprendentemente, il TPR e l'attività locomotoria sono controllati attraverso distinti neuronicircadiani 3. L'attività locomotoria della Drosophila è una nota produzione comportamentale circadiana e ha fornito forti contributi alla scoperta di molti geni e meccanismi dell'orologio circadiano dei mammifericonservati 4. Pertanto, la comprensione del TPR porterà all'identificazione di meccanismi circadiani molecolari e cellulari finora sconosciuti. Qui descriviamo come eseguire e analizzare il test TPR. Questa tecnica non solo consente di sezionare i meccanismi molecolari e neurali del TPR, ma fornisce anche nuove intuizioni sui meccanismi fondamentali delle funzioni cerebrali che integrano diversi segnali ambientali e regolano i comportamenti degli animali. Inoltre, i nostri dati pubblicati di recente suggeriscono che il TPR fly condivide le caratteristiche con il mammifero BTR3. I drosofili sono ectotermi, in cui la temperatura corporea è tipicamente regolata dal punto di vista comportamentale. Pertanto, il TPR è una strategia utilizzata per generare una temperatura corporea ritmica in questemosche 5-8. Crediamo che un'ulteriore esplorazione della Drosophila TPR faciliterà la caratterizzazione dei meccanismi alla base del controllo della temperatura corporea negli animali.

Un esempio del ritmo delle preferenze di temperatura è illustrato nella figura 5. Se la procedura di comportamento viene eseguita con successo, le mosche dovrebbero mostrare un TPR in cui preferiscono una bassa temperatura al mattino e una temperatura più alta la sera. L'aumento di ~ 1-1,5 ° C durante il giorno nella preferenza per la temperatura dovrebbe essere osservato nel corso della giornata, indipendentemente dallo sfondo genetico, poiché abbiamo dimostrato che le mosche w1118</e...

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Design and Analysis of Temperature Preference Behavior and its Circadian Rhythm in Drosophila

Recentemente abbiamo identificato un nuovo uscita circadiana Drosophila, ritmo di preferenza della temperatura (TPR), in cui la temperatura preferita nelle mosche aumenta durante il giorno e cade durante la notte. Il TPR è regolato indipendentemente da un'altra uscita circadiana, l'attività locomotoria. Qui descriviamo la progettazione e l'analisi del TPR in Drosophila.

Progettazione e analisi del comportamento delle preferenze di temperatura e del suo ritmo circadiano in Drosophila

The circadian clock regulates many aspects of life, including sleep, locomotor activity, and body temperature (BTR) rhythms1,2. We recently identified a ...

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Design and Analysis of Temperature Preference Behavior and its Circadian Rhythm in Drosophila

Unit 1

Alternative Signaling Routes in Gene Expression

SCIENTISTS IN ACTION

8.0K Views.  Cincinnati Childrens Hospital Medical Center. Recentemente abbiamo identificato un nuovo uscita circadiana Drosophila, ritmo di preferenza della temperatura (TPR), in cui la temperatura preferita nelle mosche aumenta durante il giorno e cade durante la notte. Il TPR è regolato indipendentemente da un'altra uscita circadiana, l'attività locomotoria. Qui descriviamo la progettazione e l'analisi del TPR in Drosophila.

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High-resolution Measurement of Odor-Driven Behavior in Drosophila Larvae

Olfactory responses in Drosophila larvae have been traditionally studied in Petri dishes comprising a single peripheral odor source. In this behavioral paradigm, the experimenter usually assumes that the rapid diffusion of odorant molecules from the source leads to the creation of a stable gradient in the dish. To establish a quantitative correlation between sensory inputs and behavioral responses, it is necessary to achieve a more thorough characterization of the odorant stimulus conditions. In this video article, we describe a new method allowing the construction of odorant gradients with stable and controllable geometries. We briefly illustrate how these gradients can be used to screen for olfactory defects (full and partial anosmia) and to study more subtle features of chemotaxis behavior.

In this video article, we describe a new method allowing the construction of odorant gradients with stable and controllable geometries. We briefly illustrate how these gradients can be used to screen for olfactory defects (full and partial anosmia) and to study more subtle features of chemotaxis behavior.

Ad alta risoluzione misurazione del comportamento Odor-Driven in Larve Drosophila

Olfactory responses in Drosophila larvae have been traditionally studied in Petri dishes comprising a single peripheral odor source. In this behavioral ...

Ricerca

Biologia

Lens Transplantation in Zebrafish and its Application in the Analysis of Eye Mutants

The lens plays an important role in the development of the optic cup[1,2]. Using the zebrafish as a model organism, questions regarding lens development can be addressed. The zebrafish is useful for genetic studies due to several advantageous characteristics, including small size, high fecundity, short lifecycle, and ease of care. Lens development occurs rapidly in zebrafish. By 72 hpf, the zebrafish lens is functionally mature [3]. Abundant genetic and molecular resources are available to support research in zebrafish. In addition, the similarity of the zebrafish eye to those of other vertebrates provides basis for its use as an excellent animal model of human defects[4-7]. Several zebrafish mutants exhibit lens abnormalities, including high levels of cell death, which in some cases leads to a complete degeneration of lens tissues [8]. To determine whether lens abnormalities are due to intrinsic causes or to defective interactions with the surrounding tissues, transplantation of a mutant lens into a wild-type eye is performed. Using fire-polished metal needles, mutant or wild-type lenses are carefully dissected from the donor animal, and transferred into the host. To distinguish wild-type and mutant tissues, a transgenic line is used as the donor. This line expresses membrane-bound GFP in all tissues, including the lens. This transplantation technique is an essential tool in the studies of zebrafish lens mutants.

Lens development involves interactions with other tissues. Several zebrafish eye mutants are characterized by an abnormally small lens size. Here we demonstrate a lens transplantation experiment to determine whether this phenotype is due to intrinsic causes or defective interactions with tissues that surround the lens.

Lens trapianto in Zebrafish e la sua applicazione nell&#39;analisi dei Mutanti Eye

The lens plays an important role in the development of the optic cup[1,2]. Using the zebrafish as a model organism, questions regarding lens development ...

Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

The spindle assembly checkpoint (SAC) mechanism is an active signal, which monitors the interaction between chromosome kinetochores and spindle microtubules to prevent anaphase onset until the chromosomes are properly connected. Cells use this mechanism to prevent aneuploidy or genomic instability, and hence cancers and other human diseases like birth defects and Alzheimer's1. A number of the SAC components such as Mad1, Mad2, Bub1, BubR1, Bub3, Mps1, Zw10, Rod and Aurora B kinase have been identified and they are all kinetochore dynamic proteins2. Evidence suggests that the kinetochore is where the SAC signal is initiated. The SAC prime regulatory target is Cdc20. Cdc20 is one of the essential APC/C (Anaphase Promoting Complex or Cyclosome) activators3 and is also a kinetochore dynamic protein4-6. When activated, the SAC inhibits the activity of the APC/C to prevent the destruction of two key substrates, cyclin B and securin, thereby preventing the metaphase to anaphase transition7,8. Exactly how the SAC signal is initiated and assembled on the kinetochores and relayed onto the APC/C to inhibit its function still remains elusive.
Drosophila is an extremely tractable experimental system; a much simpler and better-understood organism compared to the human but one that shares fundamental processes in common. It is, perhaps, one of the best organisms to use for bio-imaging studies in living cells, especially for visualization of the mitotic events in space and time, as the early embryo goes through 13 rapid nuclear division cycles synchronously (8-10 minutes for each cycle at 25 &deg;C) and gradually organizes the nuclei in a single monolayer just underneath the cortex9.
Here, I present a bio-imaging method using transgenic Drosophila expressing GFP (Green Fluorescent Protein) or its variant-targeted proteins of interest and a Leica TCS SP2 confocal laser scanning microscope system to study the SAC function in flies, by showing images of GFP fusion proteins of some of the SAC components, Cdc20 and Mad2, as the example.

Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

The kinetochore is where the SAC initiates its signal monitoring the mitotic segregation of the sister chromatids. A method is described to visualize the recruitment and turnover of one of the kinetochore proteins and its coordination with the chromosome motion in Drosophila embryos using a Leica laser scanning confocal system.

Studiare Checkpoint mitotica illustrando un comportamento dinamico delle proteine ​​cinetocoro e Motion cromosoma in Living<em&gt; Drosophila</em&gt; Embrioni sinciziale

The spindle assembly checkpoint (SAC) mechanism is an active signal, which monitors the interaction between chromosome kinetochores and spindle ...

Extraction and Analysis of Cortisol from Human and Monkey Hair

The stress hormone cortisol (CORT) is slowly incorporated into the growing hair shaft of humans, nonhuman primates, and other mammals. We developed and validated a method for CORT extraction and analysis from rhesus monkey hair and subsequently adapted this method for use with human scalp hair. In contrast to CORT &#34;point samples&#34; obtained from plasma or saliva, hair CORT provides an integrated measure of hypothalamic-pituitary-adrenocortical (HPA) system activity, and thus physiological stress, during the period of hormone incorporation. Because human scalp hair grows at an average rate of 1 cm/month, CORT levels obtained from hair segments several cm in length can potentially serve as a biomarker of stress experienced over a number of months.
In our method, each hair sample is first washed twice in isopropanol to remove any CORT from the outside of the hair shaft that has been deposited from sweat or sebum. After drying, the sample is ground to a fine powder to break up the hair&#39;s protein matrix and increase the surface area for extraction. CORT from the interior of the hair shaft is extracted into methanol, the methanol is evaporated, and the extract is reconstituted in assay buffer. Extracted CORT, along with standards and quality controls, is then analyzed by means of a sensitive and specific commercially available enzyme immunoassay (EIA) kit. Readout from the EIA is converted to pg CORT per mg powdered hair weight. This method has been used in our laboratory to analyze hair CORT in humans, several species of macaque monkeys, marmosets, dogs, and polar bears. Many studies both from our lab and from other research groups have demonstrated the broad applicability of hair CORT for assessing chronic stress exposure in natural as well as laboratory settings.

Cortisol (CORT) accumulates in the growing hair shaft of humans and nonhuman primates. We describe methods for extracting and analyzing hair CORT with high precision and sensitivity. Measurement of hair CORT is particularly well-suited for assessing chronic stress over periods of weeks to months.

Estrazione e analisi di cortisolo da umani e Monkey Capelli

The stress hormone cortisol (CORT) is slowly incorporated into the growing hair shaft of humans, nonhuman primates, and other mammals. We developed and ...

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both the female and male germ lines of Drosophila have contributed greatly to the current understanding of meiosis as well as stem cell biology. Excellent protocols are available in the literature for the isolation and imaging of Drosophila ovaries&#160;and testes3-12. Herein, methods for the dissection and preparation of Drosophila testes for microscopic analysis are described with an accompanying video demonstration. A protocol for isolating testes from the abdomen of adult males and preparing slides of live tissue for analysis by phase-contrast microscopy as well as a protocol for fixing and immunostaining testes for analysis by fluorescence microscopy are presented. These techniques can be applied in the characterization of Drosophila mutants that exhibit defects in spermatogenesis as well as in the visualization of subcellular localizations of proteins.

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Methods for isolating and preparing Drosophila testes samples (live and fixed) for imaging by phase-contrast and fluorescence microscopy are described herein.&#160;

L&#39;analisi citologica della spermatogenesi: Preparati Live e fisse di<em&gt; Drosophila</em&gt; Testicoli

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both ...

Rapid Analysis of Circadian Phenotypes in Arabidopsis Protoplasts Transfected with a Luminescent Clock Reporter

The plant circadian clock allows the anticipation of daily changes to the environment. This anticipation aids the responses to temporally predictable biotic and abiotic stress. Conversely, disruption of circadian timekeeping severely compromises plant health and reduces agricultural crop yields. It is therefore imperative that we understand the intricate regulation of circadian rhythms in plants, including the factors that affect motion of the transcriptional clockwork itself.
Testing circadian defects in the model plant Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) traditionally involves crossing specific mutant lines to a line rhythmically expressing firefly luciferase from a circadian clock gene promoter. This approach is laborious, time-consuming, and could be fruitless if a mutant has no circadian phenotype. The methodology presented here allows a rapid initial assessment of circadian phenotypes. Protoplasts derived from mutant and wild-type Arabidopsis are isolated, transfected with a rhythmically expressed luminescent reporter, and imaged under constant light conditions for 5 days. Luminescent traces will directly reveal whether the free-running period of mutant plants is different from wild-type plants. The advantage of the method is that any Arabidopsis line can efficiently be screened, without the need for generating a stably transgenic luminescent clock marker line in that mutant background.

The circadian clock regulates about a third of the Arabidopsis transcriptome, but the percentage of genes that feed back into timekeeping remains unknown. Here we visualize a method to rapidly assess circadian phenotypes in any mutant line of Arabidopsis using luminescent imaging of a circadian reporter transiently expressed in protoplasts.

Analisi Rapida di fenotipi circadiani in Arabidopsis protoplasti transfettate con un luminescenti Clock Reporter

The plant circadian clock allows the anticipation of daily changes to the environment. This anticipation aids the responses to temporally predictable ...

Observation and Quantification of Mating Behavior in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

A method for observing and quantifying the mating behavior of the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, was established under a stereomicroscope. To improve the mating efficiency of B. Xylophilus and to increase the chances of mating observation, virgin adults were cultured and used for the investigation. Eggs were obtained by keeping the nematodes in water and allowing the females to lay eggs for 10 min. The second-stage juveniles (J2) were synchronized by incubating the eggs for 24 h at 25 &#176;C in the dark, and the early J4 were obtained by culturing the J2 with grey mold, Botrytis cinerea, for another 52 h. At this time point, most J4 nematodes could be clearly distinguished as being male or female using their genital morphology. The male and female J4 were collected and cultured separately in two different Petri dishes for 24 h to get virgin adult nematodes. A virgin male and a virgin female were paired in a drop of water in the well of a concave slide. The mating behavior was filmed with a video recorder under a stereomicroscope. The whole period of the mating process was 82.8 &#177;3.91 min (mean &#177;SE) and could be divided into 4 different phases: searching, contacting, copulating, and lingering. The mean minutes of duration were 21.8 &#177; 2.0, 28.0 &#177; 1.9, 25.8 &#177; 0.7 and 7.2 &#177; 0.5, respectively. Eleven sub-behaviors were described: cruising, approaching, encountering, touching, hooping, locating, attaching, ejaculating, separating, quiescence, and roaming. Interestingly, obvious intra-sexual competition was observed when one female was grouped with 3 males or one male with 3 females. This protocol is useful and valuable, not only in investigating the mating behavior of B. xylophilus, but also in acting as a reference for ethological studies of other nematodes.

Observation and Quantification of Mating Behavior in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

A protocol for investigating the mating behavior of the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, is presented. Behavioral features of B. xylophilus are described in the mating process.

Osservazione e quantificazione di comportamento di accoppiamento nel nematode del pino,<em&gt; Bursaphelenchus xylophilus</em

A method for observing and quantifying the mating behavior of the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, was established under a stereomicroscope. ...

Analysis of Arabidopsis thaliana Growth Behavior in Different Light Qualities

Plant biologists often need to observe the growth behavior of their chosen species. To this end, the plants need constant environmental and stable light conditions, which are preferably variable in quantity and quality so that studies under different setups can be conducted. These requirements are met by climatic chambers featuring light emitting diodes (LED) lights, which can &#8211; in contrast to fluorescent lights &#8211; be set to different wavelengths. LEDs are energy conserving and emit virtually no heat even at light intensities, which often constitutes a problem with other light sources. The presented protocol provides a step-by-step guidance of how to program a climatic chamber equipped with variable LED lights as well as describing several approaches for in depth analysis of growth phenotypes. Depending on the experimental set-up various characteristics of the growing plants can be observed and analyzed. Here we describe how to determine fresh weight, leaf area, photosynthetic activity, and stomatal density. We demonstrate that in order to obtain reliable data and draw valid conclusions it is mandatory to use a sufficient number of individuals for statistical evaluation. Taking too few plants for this kind of analysis results in high statistical errors and consequently in less clear interpretations of the data.

Analysis of Arabidopsis thaliana Growth Behavior in Different Light Qualities

Here, we present a protocol for studying plant growth behavior and especially phenotypes in a reproducible manner. We show how to provide variable and at the same time stable light conditions. Proper analyses depend on sufficient sample numbers and valid statistical evaluations.

Analisi del comportamento di crescita di Arabidopsis thaliana in diverse qualità di luce

Plant biologists often need to observe the growth behavior of their chosen species. To this end, the plants need constant environmental and stable light ...

Circadian Entrainment of Drosophila Melanogaster

Nearly universal among organisms, circadian rhythms coordinate biological activity to earth&#39;s orbit around the sun. To identify factors creating this rhythm and to understand the resulting outputs, entrainment of model organisms to defined circadian time-points is required. Here we detail a procedure to entrain many Drosophila to a defined circadian rhythm. Furthermore, we detail post-entrainment steps to prepare samples for immunofluorescence, nucleic acid, or protein extraction-based analysis.

Here, we detail how to synchronize Drosophila to a circadian day. This is the first, and most important step necessary for studying biological rhythms and chronobiology.

Ingresso circadiano della Drosophila Melanogaster

Nearly universal among organisms, circadian rhythms coordinate biological activity to earth&#39;s orbit around the sun. To identify factors creating this ...

Dissecting, Fixing, and Visualizing the Drosophila Pupal Notum

The pupae of Drosophila melanogaster are immobile for several days during metamorphosis, during which they develop a new body with a thin transparent adult integument. Their immobility and transparency make them ideal for in vivo live imaging experiments. Many studies have focused on the dorsal epithelial monolayer of the pupal&#160;notum because of its accessibility and relatively large size. In addition to the studies of epithelial mechanics and development, the notum has been an ideal tissue to study wound healing. After an injury, the entire epithelial repair process can be captured by live imaging over 6-12 h. Despite the popularity of the notum for live imaging, very few published studies have utilized fixed notum samples. Fixation and staining are common approaches for nearly all other Drosophila tissues, taking advantage of the large repertoire of simple cellular stains and antibodies. However, the pupal notum is fragile and prone to curling and distortion after removal from the body, making it challenging to complement live imaging. This protocol offers a straightforward method for fixing and staining the pupal notum, both intact and after laser-wounding. With this technique, the ventral side of the pupa is glued down to a coverslip to immobilize the pupa, and the notum is carefully removed, fixed, and stained. The notum epithelium is mounted on a slide or between two coverslips to facilitate imaging from the tissue&#39;s dorsal or ventral side.

Dissecting, Fixing, and Visualizing the Drosophila Pupal Notum

The present protocol details the preparation and visualization of fixed tissue of the Drosophila pupal notum. It can be used for either intact or wounded tissue, and the original architecture of the tissue is preserved. The procedures for dissecting, fixing, and staining are all described in this article.

Dissezione, fissaggio e visualizzazione della Drosophila Pupal Notum

The pupae of Drosophila melanogaster are immobile for several days during metamorphosis, during which they develop a new body with a thin transparent ...