Questa misura può aiutare a rispondere alle domande chiave. Nel campo dell'umanologia. Quella risposta in funzione dei macrofagi in condizioni fisiologiche di fine patologica.
Il principale vantaggio di questa tecnica è che il rivestimento in polietileneimina può essere efficacemente in vitro senza compromettere la cellula. Sotto dosi ottimali. Le implicazioni di questa tecnica si estendono verso la terapia e la diagnosi di molti disturbi infiammatori cronici e tumori.
Dove i macrofagi svolgono un ruolo essenziale nella patogenesi. A dimostrare la procedura sarà Na Jia. Uno studente laureato del mio laboratorio.
E Kaixuan Wang, uno studente laureato del laboratorio del dottor Xiaohua. Per preparare l'acido alleato modificato super paramagnetico ossido di ferro nanoparticelle o il primo di SPION aggiungere 28 grammi di faraone cloruro esaidrato. E 20 grammi di faraoni autoaidrato a un becher contenente 80 millilitri di acqua deionizzata.
E usa un condotto di vetro per introdurre azoto nella soluzione. Mescolando fino a quando la materia solida non si è sciolta. Riscaldare la miscela di reazione a 72 gradi Celsius mescolando a 800 rotazioni al minuto.
E aggiungere 40 millilitri di acqua al 28% di ammoniaca al becher. Dopo cinque minuti aggiungere nove millilitri di acido alleato goccia saggio. E mantenere la miscela a 72 gradi Celsius per tre ore con agitazione continua.
Alla fine dell'incubazione raffreddare la soluzione risultante a temperatura ambiente. E far precipitare la miscela tramite separazione magnetica secondo protocolli standard. Quindi lavare lo SPION contenente precipitato tre volte con alcol etilico assoluto.
E asperse il precipitato in 100 millilitri di n-esano. Per preparare l'acido acrilico dimercapto modificato spion aggiungere 800 milligrammi di acido alleato modificato SPION. Disperso in 200 millilitri di n-esano e 400 milligrammi di acido acrilico dimercapto dispersi in 200 millilitri di acetone in un pallone a tre colli in un bagno d'acqua a 60 gradi Celsius.
Aggiungere quindi 200 microlitri di trietilammina cadere saggiamente al pallone mescolando a 1000 rotazioni al minuto e reflusso. Un precipitato nero può essere ottenuto mediante separazione magnetica dopo cinque ore. Quindi utilizzare idrossido di tetrametilammonio per regolare il pH della soluzione per la dispersione omogenea degli SPION idrofili in acqua deionizzata.
Degenerato polietileneimina rivestito spion aggiungere l'acido acrilico dimercapto modificato la soluzione colloidale di SPION cadere saggio in una soluzione di polietileneimina da 10 kilodalton. In un pallone a tre colli da 500 millilitri sotto agitazione meccanica a 1000 rotazioni al minuto per due ore. Al termine dell'incubazione aggiungere la soluzione risultante a un tubo di ultra filtrazione con un peso molecolare tagliato di 100 kilodalton e un contenuto di 15 millilitri.
Centrafutilizzare il campione fino a quando la soluzione rimanente raggiunge un volume di millilitro. Aggiungere acqua deionizzata alla soluzione per riportare il volume a 15 millilitri. E centrafuse e reidratare la soluzione altre dieci volte come appena dimostrato.
Quindi filtrare la soluzione attraverso un filtro da 22 micron per la conservazione a quattro gradi Celsius. Per preparare le nanoparticelle di siRNA aggiungere prima tre microlitri di soluzioni di siRNA 20 micromolare preparate al momento a cinque tubi microcentroafusi liberi di RNA etichettati. E aggiungere 0, 8, 1,6, 3,2 e 6,4 microgrammi di POlietileneimina SPION ai tubi etichettati rispettivamente zero, uno, due, quattro e otto.
Dopo la miscelazione con pipettazione delicata, incubare i campioni per 30 minuti a temperatura ambiente per consentire la forma dei complessi siRNA SPION in polietileneimina. E preparare un gel di agarosio al tre per cento con I purity agarose. Al termine dell'incubazione aggiungere un microlitro di tampone di carico di DNA 6X per cinque microlitri di campione a ciascun tubo e mescolare con attenzione.
Quindi caricare tutti i campioni sul gel. Ed eseguire l'elettroforesi a cinque volt per centimetro. Fino a quando il colorante blu bromofenolo migra due terzi della lunghezza sul gel.
Un giorno prima della trasfezione lavare un microfago di topo come raw264.7 coltura cellulare con PBS. E trattare le cellule con un millilitro del 25% di tripside per cinque-dieci minuti a 37 gradi Celsius in un incubatore di anidride carbonica al cinque%. Quando la maggior parte delle cellule si è staccata.
Disattivare la tripina con cinque millilitri di DMEN completo. Quindi convogliare la soluzione più volte per disperdere eventuali cluster di celle. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo sterile conackel da 15 millilitri per la centrifugazione.
Quindi sospendere di nuovo le cellule in cinque millilitri di DMEN fresco completo per il conteggio. Diluire le cellule a 4,5 per dieci fino alla quarta cellule per millilitro di concentrazione completa di DMEN. E aggiungere due millilitri di mezzo ad ogni pozzo di un piatto di sei pozza per un'incubazione 24 ore su 24 nell'incubatrice di coltura cellulare.
Il giorno successivo preparare il rapporto appropriato delle nanoparticelle di siRNA SPION in un tubo di microcentrifugo a flusso di RNA da 1,5 millilitri con miscelazione delicata come appena dimostrato. E aggiungere il volume appropriato di polietileneimina SPION siRNA nanoparticella complesso ad ogni pozzo che è stato sostituito con un millilitro di mezzo fresco. Preparare complessi di POlietileneimina SPION si.
in questo caso possono essere utilizzati molti altri mesi di polietileneimina SPION riducendo così al minimo la loro potenziale tossicità. Quindi ruotare attentamente la piastra per ottenere una distribuzione uniforme delle nanoparticelle attraverso i fondi del pozzo. Riportare la piastra all'incubatore di coltura cellulare fino al successivo aggiornamento cellulare o all'analisi della carenza di knockdown genico.
I POlietilenimina SPION con un potenziale zeta di 30,5 e 37 millivolt non presentano un'apparente tossicità citografica a concentrazioni fino a 30 microgrammi di ferro per millilitro. Che è circa due volte il noleggio rispetto alla concentrazione normalmente utilizzata per la trasfezione cellulare. Il potenziale zeta di POlietileneimina SPION di 48 millivolt tuttavia è tossico.
Anche alla dose più bassa esaminata. Come analizzato dalla citometria a flusso, oltre il 90% delle cellule può essere transetto con complessi di siRNA SPION in polietileneimina etichettati fluorescentmente a 15 microgrammi di ferro per millilitro. La valutazione degli effetti delle concentrazioni di siRNA SPION in polietileneimina sull'internalizzazione cellulare mediante frantumazione della colorazione blu rivela una colorazione minimamente rilevabile a 7,5 microgrammi di ferro per millilitro.
Ma punti chiaramente visibili a 15 microgrammi di ferro per millilitro che non aumentano a concentrazioni più elevate di ferro probabilmente a causa della saturazione dell'assorbimento del siRNA di POlietileneimina SPION. I macrofagi peritoneali trasfettato con siRNA specifico che ospita polietileneimina SPION presentano una significativa diminuzione dei livelli di mRNA di catrame rispetto al siRNA non specifico. Suggerendo che il siRNA può fuggire dalle vescicole endocitiche nel citoplasma per raggiungere il meccanismo di interferenza dell'RNA.
Inoltre, dopo l'iniezione endovenosa di una singola dose di complessi di nanoparticelle di polietileneimina SPION siRNA, l'analisi flocentimetrica delle cellule positive CD11b e CD3 rivela un assorbimento più efficiente delle nanoparticelle da parte di CD11b che esprime macrofagi rispetto alle cellule positive cd3 in qualsiasi momento in tutti gli organi esaminati. Durante il tentativo di questa procedura è importante ricordare di preparare i polietilenimina SPION con un potenziale dati medio non superiore a 37 millivolt e di preparare i complessi di siRNA SPION in polietileneimina sui bassi rapporti ferro/siRNA. Questa tecnica confronta la necessità per i ricercatori di esplorare il potenziale terapeutico di targeting del macrofago nei motori animali di malattie umane come e cancro.
