Questo video fornirà una descrizione dettagliata, come eseguire un arto posteriore destro ortotopico, ratto trapiantato della coscia media. L'arto posteriore destro del ratto donatore viene amputato a livello della coscia media, quindi conservato sul ghiaccio. Anche l'arto posteriore destro del ratto ricevente viene amputato a livello della coscia media.
L'arto del ratto donatore viene quindi attaccato al ratto ricevente. Descriveremo come riattaccare i sistemi osseo, arteria, vena, nervosa, muscolare e cutanea. Il trapianto di arti, più specificamente, l'allotrapianto composito vascolarizzato, VCA, ha un'ampia promessa terapeutica.
Ma attualmente è limitato da tecniche, immunosoppressione e scarso recupero neuromotorio funzionale. Il nostro modello enfatizza meticolose tecniche microchirurgiche collaudate nel tempo, come l'anastomosi vascolare cucita a mano e la coaattamento neurale. Abbiamo eseguito più di 200 di questi interventi in più di un anno.
Sebbene ci sia una curva di apprendimento iniziale al microchirurgo iniziale, usando questo video per imparare il nostro metodo e il loro impegno nella pratica dedicata, qualsiasi microchirurgo sarà in grado di padroneggiare questo modello. Tutti gli esperimenti sono stati condotti in conformità con la guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio del National Institutes of Health, NIH, e sono stati approvati dal Northwestern University Animal Care and Use Committee. Le procedure specifiche sono state eseguite su un protocollo IS 00001663.
Selezionare un topo di età compresa tra 8 e 16 settimane di peso compreso tra 250 e 400 grammi al momento dell'intervento chirurgico. Indurre l'anestesia generale con il 5% di isoflurane attraverso un vaporizzatore prima di tagliare la pelliccia dell'arto posteriore del ratto. Utilizzando un cono del naso per mantenere l'anestesia tra il due e il 2,5% posizionare il topo sulla scheda operativa con un riscaldatore sotto.
Disinfettare la pelle senza peli con alcool sfregamento al 70% e proteggere il campo chirurgico con garza sterile. Utilizzando un microscopio microchirurgico appropriato e gli strumenti microchirurgici qui mostrati, insieme all'elettrocauteria bipolare e monopolare di facile accesso, sarai pronto per iniziare la dissezione. Usa le forbici per fare un'incisione circonferenziale e cutanea intorno all'arto posteriore destro.
Iniziare immediatamente nella piega inguinale all'incirca allo stesso livello del legamento inguinale ed estendere dorsalmente lateralmente per completare l'incisione circonferenziale. E poi esporre lo strato muscolare direttamente sotto l'incisione, sezionare e cauterizzare i vasi epigastrici superficiali, che portano dallo strato muscolare al lembo prossimale della pelle appena creato. Riflettere il lembo prossimale superomedialmente al legamento inguinale e il lembo della pelle distale inferolatermente al ginocchio.
Utilizzare un riavvolgitore a filo o una garza arrotolata per esporre il campo. Osservato che l'anatomia inguinale del ratto è simile all'uomo;dal laterale al mediale si trovano il nervo, l'arteria e la vena. Sezionare il nervo femorale, dividerlo bruscamente al legamento inguinale prossimale alla biforcazione, se possibile.
Ritrai il nervo diviso in modo inferiore, tenendolo al sicuro fuori strada, coperto sotto una garza umida. Rivolgendo l'attenzione all'arteria femorale e alla vena utilizzare cravatte di seta lunghe quattro centimetri 7-0 per ritrarre atraummaticamente i vasi invece di maneggiarli direttamente. Prestare molta attenzione ora migliorerà il risultato anastomotico finale.
Ligate tutti i rami dei vasi femorali con cravatte di seta 7-0. Dividi i rami tra i legami. I rami arteriosi e venosi che richiedono divisione includono l'iliaco circonflesso superficiale e i vasi muscolari.
L'iliac circonflesso superficiale è solitamente più grande e sembra immergersi in profondità come farebbe il femorale profunda negli esseri umani, ma il profunda è assente nel ratto. Rami più distale dei vasi femorali, come il genicolare più alto e il ramo safenoso di solito non richiedono divisione. Ora ligate l'arteria femorale con 7-0 cravatte di seta il più prossimali possibile al legamento inguinale e dividere tra i legami.
Simile all'arteria, ligate e dividere la vena femorale. Riflettere sia l'arteria che la vena in modo inferiore, in modo sicuro fuori strada, coperto sotto una garza umida insieme al nervo femorale coperto in precedenza. Sezionare i gruppi muscolari ventrali, facendo attenzione a cauterizzare qualsiasi vaso visibile che si presenta.
L'attenzione all'emostasi ora ridurrà al minimo la perdita di sangue del ricevente durante la riprofusione in seguito. In profondità ai gruppi muscolari ventrali, identificare e dividere bruscamente il nervo sciatico prossimale ai suoi rami. Tutti e tre i rami sciatici sono solitamente visibili, tibiali, peroneali e surali.
Tutti e tre dovrebbero essere conservati nell'arto del donatore. Un quarto ramo cutaneo non è tipicamente visto in questa dissezione. Termina di dividere i restanti gruppi muscolari ventrali e dorsali a livello della coscia media con un'emostasi meticolosa.
Potrebbe essere necessario ritrarre l'arto medialmente per completare la divisione dei muscoli. Traseliare l'osso del femore a medio albero utilizzando una sega rotante cordless portatile. L'arto è ora libero dal donatore.
Dopo aver rimosso l'innesto degli arti dal donatore, tagliare le estremità legate alla seta dall'arteria femorale laterale dell'innesto e dai ceppi delle vene, riafaperturando così i vasi. Inserire un angiocatetere calibro 24 nel ceppo dell'arteria di innesto e lavare l'innesto con 250 unità internazionali di eparina diluite in 5 millilitri di soluzione salina normale ghiacciata, facendo attenzione a vederlo scorrere fuori dalla vena aperta. Lentamente, sciacquare delicatamente l'innesto per circa tre minuti.
L'eccesso di lavaggio forzato può danneggiare l'endotelio. Posizionare l'innesto in un piatto salino refrigerato annidato in un secchio di ghiaccio fino al trapianto. Eutanasia del ratto donatore con toracotomia bilaterale.
L'intervento chirurgico al ricevente inizia in modo simile alla chirurgia del donatore, anestetizzando il topo, tagliando la pelliccia, facendo un'incisione circonferenziale nella piega inguinale, riflettendo i lembi della pelle, sezionando il nervo femorale, l'arteria e la vena. E legare gli stessi vasi di ramo descritti in precedenza. Tuttavia, durante questa operazione, dividere il nervo femorale più distally che per il donatore, ma prossimamente alla biforcazione, se possibile.
Dividere e liberare l'arteria e la vena femorale e bloccarle prossimalmente rispettivamente a livello del legamento inguinale con morsetti bulldog microchirurgici. Continuare l'intervento come descritto in precedenza, dividendo i muscoli avallanti ventrali della coscia a livello della coscia media con un'emostasi meticolosa, mentre si ritrae l'arto medialmente se necessario. Identificare e dividere il nervo sciatico prossimale al punto di diramazione e traseleggere il femore a medio albero utilizzando la sega rotante.
Rimuovere l'arto posteriore destro nativo del destinatario e smaltire in modo appropriato in conformità con le linee guida locali del comitato per la cura e l'uso degli animali. In questa fase è molto importante abbassare l'isoflurane all'1,5 per cento attraverso il cono del naso. Troppa anestesia durante questa parte meno dolorosa della procedura porterà alla morte del topo.
È tempo di coapt le ossa insieme. Utilizzando la sega rotante portatile, radere eventuali irregolarità sia dal donatore che dalle estremità del femore ricevente. Tagliare l'estremità del mozzo di un ago calibro 18, che diventerà l'asta intramidollare del femore.
Prima di manipolare l'osso, applicare una piccola quantità di cera ossea sull'estremità del taglio del femore per ridurre il sanguinamento del midollo durante il processo di alesatura. Coapt il donatore e le ossa femorali riceventi usando l'ago calibro 18 come asta intramidollare. Una certa forza è necessaria, ma non alesare nessuna delle due ossa al punto da fratturare la corteccia.
Se necessario, rimuovere l'ago e tagliarlo a una lunghezza inappropriata in modo che entrambe le ossa si adattino senza intoppi sull'ago senza che l'ago si mostri tra l'osso. Posizionare un piccolo supporto come un cuscinetto di garza o una piccola roccia o modellare l'argilla sotto l'arto donatore per tenerlo fuori dalla tensione. Riapprossimare i gruppi muscolari ventrali con da otto a 10 semplici suture di poliglactina interrotte da 5 a 0 in modo che l'innesto non ruoti attorno all'ago del femore.
Questo dà stabilità agli arti per l'anastomosi. Ora inizia l'anastomosi. Irrigare periodicamente l'innesto e il campo chirurgico con soluzione salina ghiacciata per una migliore visualizzazione e ridurre le lesioni da riperfusione ischemica.
Allineare le arterie femorali donatrici e riceventi e l'anastomosi in modo end-to-end utilizzando una semplice sutura di nylon 10-0 interrotta, evitando sia la tensione che il looping. L'arteria richiede una media di sei suture. Simile all'arteria, anastomoso le vene femorali donatrici e riceventi in modo end-to-end.
La vena richiede da sei a otto suture. La generosa irrigazione salina fredda, la tecnica di movimentazione atraumatica dei vasi e l'abbandono di lunghe code per fungere da suture di permanenza per la retrazione dei vasi sono strumenti importanti per un'efficace anastomosi microchirurgica. Posizionare una moderata quantità di polvere di cellulosa emostatica su entrambe le anastomosi e successivamente rimuovere i morsetti del bulldog microchirurgico prossimale sulla vena e sull'arteria.
Ispezionare entrambe le anastomosi per una buona persistenza e flusso. Utilizzare bastoncini di cotone per pungere delicatamente la vena e ispezionare per una buona emostasi su entrambe le anastomosi. Quando entrambe le anastomosi sono confermate soddisfacenti, tagliare eventuali code di sutura a lunga permanenza rimanenti per abbinarle alle altre.
Riposizionando il ratto nella posizione del decubito laterale sinistro, utilizzare l'elettrocauteria liberale per ottenere un'emostasi meticolosa di qualsiasi sanguinamento muscolare di riperfusione. L'attenzione è rivolta all'anastomosi nervosa una volta assicurata l'emostasi muscolare. Riapprossimare i gruppi muscolari dorsali che si trovano direttamente sotto il nervo sciatico con semplici suture di poliglactina interrotte 5-0.
Tagliare indietro tutte le estremità nervose che appaiono lacero. Riavvicinare il nervo sciatico con 10-0 suture di nylon che cercano morsi epineurali. Di solito sono sufficienti da otto a 10 semplici suture interrotte.
Riapprossimare i restanti gruppi muscolari dorsali con 5-0 suture di poliglatina. Quindi chiudere la pelle dorsale con 4-0 sutura a corsa continua di poliglactina. Riposizionando il topo in posizione supina, riapprossimare il nervo femorale con sutura di nylon 10-0, ancora una volta, cercando morsi epineurali.
Di solito sono sufficienti da due a tre semplici suture interrotte. Chiudere la pelle ventrale rimanente allo stesso modo della pelle dorsale. Evita l'eccesso di coda di sutura, che può essere irritante per il topo una volta sveglio.
Una volta che gli animali sono fuori dalla finestra postoperatoria immediata, possono essere testati per il recupero neuromotorio. Il test di Hargreaves viene utilizzato per testare la sensazione termica. Posizionare il topo nel contenitore di prova e consentirlo di acclimatarsi per 20 minuti.
Il vetro dell'apparecchio è confermato pulito e si conferma che la fonte di calore sta lavorando con il dito dell'investigatore. Prima del test, verificare che il ratto sia sveglio e che la zampa testata sia posizionata sopra il rilevatore di movimento a infrarossi. Trasmettere energia termica al livello di intensità 90.
Viene registrato un ritardo nel tempo in cui l'animale allontana la zampa dalla fonte di calore. Se non si verifica alcun movimento entro 20 secondi, il test viene interrotto per prevenire lesioni. Ottenere cinque prove per arto testato, escluso il valore più alto e più basso prima di calcolare il tempo medio di latenza di astinenza per ciascun animale.
Ecco il design operativo raffigurato in formato cartone animato. L'arto posteriore destro dei ratti donatori e riceventi viene amputato a livello della coscia media come sezione trasversale sciatica. L'arteria femorale, la vena e il nervo, così come il nervo sciatico e l'osso del femore devono quindi essere ricollegati nell'intervento chirurgico al ricevente.
Il modello può essere utilizzato per mostrare effetti differenziali di sopravvivenza della soppressione immunitaria e della strategia di trapianto. Con questa tecnica, la sopravvivenza a lungo termine è realizzabile. Il modello può essere utilizzato per indagare il recupero sensoriale dei nervi, che può essere evidente per quattro settimane postoperatoriamente.
La funzione motoria può anche essere interrogata utilizzando una piattaforma di analisi dell'andatura. Qui, abbiamo presentato una piattaforma modello di ratto con caratteristiche di sopravvivenza favorevoli, che usiamo per sondare il recupero sensoriale e motorio come si vede nelle figure in corso. Trapianto di arti nella più ampia categoria di VCA, l'allotrapianto dei componenti vascolarizzati ha una promessa terapeutica ampiamente applicabile non è ancora stata mantenuta.
I principali blocchi stradali sono le attuali tecniche di immunosoppressione e recupero neuromotorio. Lo sviluppo di nuove tecniche dipenderà da una modellazione animale flessibile, robusta e riproducibile. Utilizzando questa piattaforma, speriamo che gli investigatori siano in grado di avanzare molteplici sfaccettature del trapianto di arti.
Grazie per la visione e buona fortuna nei tuoi prossimi passi.
