Alberto Guiggiani per lo sviluppo del sistema di controllo in tempo reale, Evelina Chieregatti e Hanako Tsushima per penetranti discussioni, Giacomo Pruzzo e Alessandro Parodi per lo sviluppo di elettronica custom e software, e Claudia Chiabrera e Marina Nanni per la loro consulenza e assistenza nella preparazione della coltura cellulare esperto.

1. Setup Optical L&#39;intero sistema ottico è stato descritto in precedenza 15. Brevemente, il sistema di pinzette ottiche è basato su un onda continua itterbio (CW) fibra laser operante a 1064 nm (IPG Laser GmbH). Un modulatore spaziale di luce (SLM) (LCOS-SLM, modello X10468-07 - Hamamatsu) varia la fase del fascio laser in ingresso IR per controllare la posizione del punto di messa a fuoco trapping sul piatto di coltura da Computer ologrammi generati. I Blu-pinzette software (collegamento web sul tavolo attrezzature) ologrammi generati liberamente disponibili proiettate sul modulatore spaziale di luce. L&#39;interferometro per misure di spettroscopia di forza era basata su un fotodiodo a quattro quadranti (QPD, S5980 con C5460SPL 6041 bordo - Hamamatsu) ed un fotodiodo (PD, PDA100A-EC - Thorlabs). La fonte dissezione laser pulsato è stato un sub-nanosecondo UV Nd: YAG laser a 355 nm (PNV-001.525-040, POWERCHIP nano-Pulse UV laser - Teem Photonics). Un acustico-modulatore ottico (MQ110-A3-UV, 355 nm silice fusa-AA-opto-elettronico) controllava la potenza del laser UV consegnato al campione. L&#39;ottica olografica pinzette laser e micro dissettore stati integrati su un microscopio verticale modificato (BX51 - Olympus) dotata di un 60X, 0,9 NA acqua immergendo objective.The fase del microscopio è composto da un motore 3-asse lineare DC micro-posizionamento sistema (M-126.CG1, Fisica-Instruments) che porta un piezoelettrico fase nano-posizionamento a 3 assi separati (P-733.3DD, Fisica-Instruments) per combinare il movimento grossolana del campione con la risoluzione sub-nanometrica della piezo- stadio. Il sistema del microscopio è stato dotato di due circuiti di controllo che agisce sinergicamente per mantenere il punto fuoco intrappolamento nella posizione giusta, a seconda della modalità di funzionamento selezionata (posizione o forza di serraggio, statica o dinamica) 16. In particolare, un circuito di retroazione interna agisce su un palco piezoelettrico, per mantenere il tallone in una selectndr distanza dal centro trappola. L&#39;altro circuito esterno controlla la posizione del portaoggetti motorizzato di sfruttare la regione attraversato dal piezoattuatore su un&#39;area maggiore della sua corsa 17 disponibili. Quando il piezo stadi, raggiunge il limite della corsa disponibile in una direzione, il loop esterno sposta il micro percorso nella direzione opposta, così il piezo recupera verso la sua posizione centrale perché sta rilevando la perlina intrappolato aderito al campione. Quando il piezo-stadio raggiunge la posizione centrale della sua gamma naturalmente, il micro fase interrotta. Ulteriori dettagli del sistema sono riportati in Guiggiani et al 16,17. Un dispositivo Peltier (QE1 riscaldamento resistivo con TC-344B del riscaldatore a doppio canale - Warner Instruments) controlla la temperatura della coltura cellulare al microscopio (37 ° C). Nella cultura, pH e umidità sono stati mantenuti in condizioni fisiologiche per aerare un polidimetil custom-designedsilossano (PDMS) manicotto (integrando l&#39;obiettivo microscopio) con CARBOGEN umidificata (95% O 2, 5% di CO 2). 2. Cell Culture Preparazione Tutti i protocolli sperimentali sono stati approvati dal Ministero della Salute italiano. Colture primarie sono state ottenute da ippocampo di topi (C57BL6J, Charles River) giorno embrionale 18 (E18). <ol><li> I neuroni sono state piastrate ad una concentrazione di 25.000 cellule / ml su fondo di vetro Petri (P35G-0-14-C - matek Corporation). La bassa concentrazione di cellule in coltura è necessaria per evitare la formazione di una fitta rete già nei primi giorni in vitro. Alla concentrazione cellulare menzionato, la probabilità di trovare cellule isolate con un neurite più lungo non collegato ad altre cellule è molto più alta. </li></ol> 3. Rivestimento Bead <ol><li> Polymer microsfere (Ø 4 micron, COOH-terminato-Bangs Laboratories, codice prodotto PC05N/6700) sono stati rivestiti con poli-D-lisina seguendo la procedura descritta nel Polylink Protein Coupling Kit (Polysciences, codice prodotto 19539). Le perle sono rivestite con la stessa molecola utilizzata per coprire il supporto e la coltura favore cellule adesione. </li></ol> 4. Scegli isolato Neuron. Staccare un tallone dalla cultura substrato, Trappola e spostarlo Accanto al Neuron <ol><li> Mettere il piatto cultura Petri sul palco microscopio. Dopo aver impostato la messa a fuoco sul campione di moto fase, correggere la posizione del illuminante obiettivo condensatore per impostare Kohler-illuminazione. Allineamento delle ottiche di illuminazione per impostare la condizione Kolher-illuminazione è necessaria per migliorare la qualità delle immagini luminose campo. Utilizzando tali condizioni di allineamento, è anche necessario per massimizzare l&#39;efficienza di raccolta del laser IR (tramite condensatore oggettivo), dalla dispersione sonda intrappolato, effettuare il tracciamento interferometrica dal QPD e PD. </li><li> Pipettare pochi microlitri della soluzione patinati microsfere inal piatto cultura. Microsfere depositerà e di aderire al substrato della cultura. Il numero di microlitri iniettato nel piatto cultura dipende dalla concentrazione microsfere della soluzione di riserva. La condizione ideale è avere tra uno e due microsfere per campo dell&#39;imaging di vista. Quando troppi microsfere vengono aggiunti al piatto di coltura, possono già attaccare caso ai neuroni coltivati. </li><li> Muoversi nel piatto cultura, alla ricerca di un neurone isolato con una neurite più lungo (l&#39;assone), e salvare la posizione del palco microscopio. </li><li> Muoversi e cercare una perlina aderito al sostegno della cultura. </li><li> Accendere il laser a infrarossi cattura. In questa fase, non ologrammi vengono proiettate su SLM, e la posizione del punto laser IR coincide con la posizione spot laser UV. Impostare la posizione assiale dello spot IR 2-3 micron sopra la superficie di supporto cultura, dal movimento del microscopio. </li><li> Impostare la potenza del laser UV consegnato al campione da meno di 1 μW. GliUV laser dissettore è stato precedentemente tarato 14: 5-6 μW il supporto di vetro viene ablata 4 μW una connessione neuronale è completamente sezionato 2,5 μW una neurite è parzialmente lesionati &lt;1 μW un&#39;onda d&#39;urto è prodotto nel piatto di coltura. L&#39;onda d&#39;urto ottico è abbastanza forte da staccare il tallone dal supporto di vetro. </li><li> Accendere il laser UV, lasciando il laser IR, e spostare il punto UV sopra il tallone aderito al movimento palco microscopio. Gli stacca tallone dalla superficie, ed è intrappolato dal laser IR. Quindi, spegnere il laser UV. </li><li> Spostare le intrappolati tallone diversi micrometri di sopra del supporto di vetro (20-30 micron). Sollevamento del tallone a questa posizione sarà impediva di contattare altre cellule mentre viene spostato verso il neurone precedentemente scelto. Portare il tallone nella posizione precedentemente salvata stadio. Impostare la velocità di fase a un valore basso (10 micron / sec), cosicché la forza di trascinamento del fluido non superi la trappola otticaforza ping. </li></ol> 5. Spostare la posizione Trappola rispetto al Dissector Spot Laser e Axon posizione da Computer Generated Hologram e calibrare il Optical pinzette Rigidità <ol><li> Spostare il tallone verso il supporto in vetro di visualizzare l&#39;assone. La sferetta è tenuta sopra la cella per evitare il contatto con essa (circa 5 micron sopra del supporto di vetro). </li><li> Spostare la fase di microscopio per spostare il punto attivo UV sul centro della larghezza del assone. Salvare la posizione attuale fase. </li><li> Spostare il focus posizione a pronti IR da ologramma generato al computer. In questa fase, la fase viene arrestato nella posizione scelta nel passaggio precedente. Quando il computer ologramma generato è proiettato sul SLM, il tallone intrappolata viene spostata rispetto alla assone. Abbiamo spostare il punto laser IR avere il tallone intrappolata allineato al centro del neurite, con il punto laser UV centrata sulla stessa neurite troppo. Lo spot IR e quindi il intrappolata tallone sono posizionati lungo i neuriti5-10 micron di distanza dal punto UV. Muoviamo la posizione del IR rispetto alla macchia UV in funzione della geometria neurite. Nel caso le pinzette ottiche non sono dotati di un sistema SLM, la posizione può essere variata specchi ribaltabili, o deflettori acustici ottiche, sul percorso ottico di IR. Il punto laser IR potrebbe essere posizionata 5-10 micron dalla macchia UV per evitare interazioni ottico del fascio dissezione con la sonda intrappolato, che potrebbe influenzare il moto browniano e alterare le tracce spettroscopia di forza. </li><li> Dopo aver definito la nuova posizione a pronti IR rispetto a macchia UV e posizione assone, spostare la fase di posizionare il tallone intrappolato dalla assone ed evitare collisioni con esso. Spostare la posizione assiale del tallone intrappolata di circa 2 micron sopra il vetro di copertura. </li><li> Allineare il QPD al centro le frange di interferenza su di esso: x e segnali differenziali y QPD sono zeri quando il QPD è centrato. Acquisire 5 secondi del moto browniano del tallone intrappolati dalla interferometrichemetro, a 50 KHz frequenza di campionamento. Avere la rigidità (pN / nm) e sensibilità (V / nm) della trappola ottica dal metodo spettro di potenza 18. </li></ol> 6. Fissare il tallone alla Axon. Eseguire assotomia e simultanea Misura della forza <ol><li> Sollevare la posizione tallone intrappolato circa 4 micron sopra il vetro di copertura, e spostarlo nella posizione di fase precedentemente salvata (vedi punto 3.2). </li><li> Spostare il tallone giù intrappolato verso l&#39;assone finché non tocca la neuriti. La collisione tra tallone intrappolati e l&#39;assone è controllata dal segnale QPD z rilevamento spostamento del tallone intrappolato nella direzione assiale. </li><li> Attendere 10 sec con il tallone intrappolata spinto contro l&#39;assone di favorire l&#39;adesione alla membrana neuriti. </li><li> Spostare il micro fase di spostare il tallone intrappolato dal assone, e quindi verificare la sua adesione alla membrana cellulare. Se il tallone aderito, sfugge dalla trappola ottica. </li><li> Spostare indietro la trappola laser sul tallone aderitoe attivare il ciclo forza-clamp con condizione forza pari a zero. In tal modo, i riposiziona piezo-fase del tallone, allegate alla cella, sul centro trappola ottica. Se il sistema non dispone di un controllo di retroazione, la posizione trappola laser può essere spostata dal palco microscopio per centrarlo sulla sonda aderito. Il centro della trappola è raggiunto quando i segnali QPD sono gli stessi quando il tallone è bloccata e non aderisce alla cella (x ed y segnali QPD pari a zero, e il segnale z QPD dà la stessa tensione somma dei quattro quadranti come quando il tallone è intrappolato lontano da qualsiasi superficie). </li><li> Impostare una condizione forza-clamp sull&#39;asse z, posizionando il laser trapping leggermente nel centro del tallone (circa 100 nm), per generare un precarico sul aderito sonda intrappolato. Nel caso il sistema non è dotato di un controllo di forza-clamp, la posizione trappola ottica può essere sollevato fino a passi di 25 nm dalla fase microscopio. Il segnale z QPD permette il monitoraggio. Pertanto, utilizzare thiil segnale s per impostare la posizione della trappola laser rispetto alla sonda aderito. Tale pre-tensionamento è necessario per rilevare la tensione sulla membrana dopo la lesione assonale, e la conseguente diminuzione del moto browniano della sonda aderito. Un approccio simile è stato proposto di misurare il rilascio di tensione in un tether membrana da immagini video 19. </li><li> Spegnere il ritorno di forza-clamp per misurare la forza sulla sonda aderito nella condizione di posizione-clamp (il piezo-stadio è bloccato). </li><li> Avviare la registrazione simultanea delle posizioni del tastatore intrappolate attraverso l&#39;interferometro (20 KHz frequenza di campionamento), e la cellula durante laser assotomia time-lapse imaging in campo chiaro (20 Hz frame rate). </li><li> Accendere il laser UV per fornire impulsi laser fino a una lesione diventa visibile sull&#39;immagine del l&#39;assone (solitamente 200-400 impulsi ottici sono necessari Energia per impulso: 25. NJ), quindi spegnere il laser UV. </li><li> Continuare la registrazione dal interferometro per circa 3 min, fino a quando la x, yez QPD tracce di raggiungere un plateau. </li></ol> 7. Quantificare il totale tensione di uscita <ol><li> Convertire le tracce QPD registrati (in Volt) per la sensibilità calibrata della trappola ottica, per ottenere le rispettive tracce in nanometri. </li><li> Filtrare il x, y, z e tracce di spostamento da un filtro passa alto con tagliato a 10 Hz. </li><li> Calcolare la varianza totale delle tracce filtrati rappresentano il moto browniano del tallone intrappolato. Calcola la varianza a 25 msec per le finestre di tempo di 500 msec (10.000 punti dati) 20 sovrapposte. L&#39;elevato filtraggio delle tracce passaggio esclude le variazioni del moto browniano a causa della fluttuazione della membrana o movimento actina corticale. Il moto browniano del tallone è ridotta dalle forze ottici e le forze di adesione sulla membrana cellulare. Quando la membrana è tesa a causa del rilascio di tensione sua viscosità è aumentata e quindi il moto browniano della perlina, rilevata immediatamente dopo assotomia, inizia a diminuire. </li><li> Definire t0: l&#39;inizio della diminuzione del moto browniano varianza, dopo la consegna di energia laser UV. L&#39;istante t0 tempo indica l&#39;inizio del ceppo membrana. </li><li> Definire t1: la fine della diminuzione del moto browniano varianza (quando raggiunge un plateau). L&#39;istante t1 tempo indica la fine del ceppo membrana. </li><li> Eseguire video tracking di detriti o un graffio sul supporto vetro di copertura, per misurare qualsiasi deriva del campione durante la misurazione della forza. Per tenere traccia della particella sul supporto di vetro, per prima cosa applicare soglie per le immagini in campo chiaro, per ottenere una pila di immagini binarie con la particella in bianco su sfondo nero. Poi, si traccia il centro particella di massa con una precisione sub-pixel (utilizzando il software freeware ImageJ). </li><li> Sottrarre la deriva misurato dalle tracce QPD spostamento. Moltiplicare le tracce QPD drift-corretti dai rispettivi rigidità ottico calibrato (k x, k <sub&gt; y, k z) per ottenere le Fx, Fy, Fz tracce in piconewtons. </li><li> Calcolare la traccia forza totale come F tot = √ (2 + Fx Fy Fz 2 + 2). </li><li> Calcola il rilascio totale di forza tra T0 e T1 come F rilasciato = F tot (t1) - F tot (T0). La forza misurata in t0 deve essere sottratto perché è dovuto allo spostamento della sonda dal centro trappola, quando aderisce al tallone neuriti. </li><li> Calcolare l&#39;area di contatto tra il tallone neuriti intrappolati e la posizione di punto laser UV: sulla misura di immagine in campo chiaro le lunghe (L) e corto (D) assi del neuriti intrappolato tra il tallone e la posizione di punto laser UV. L&#39;area di contatto assone assone è A = L x D. </li><li> Normalizzare il totale rilasciato dalla pubblicato forza F l&#39;area di contatto Un assone assone. </li></ol>

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Riportiamo in questo lavoro un metodo quantitativo per confrontare l&#39;adesione al substrato neuriti cultura, effettuando la misurazione simultanea forza spettroscopia laser durante lesione cellulare indotta. Il rilascio della tensione misurata è correlato al grado di adesione della cellula al substrato: celle con un numero più elevato di adesioni focali dovrebbero rilasciare meno tensione. Misurando il rilascio di tensione in termini di piconewtons fornisce una grandezza fisica da cui calcolare la assonale adesione...

Microscopia ottica è uno del sistema di imaging meno invasiva disposizione per osservare le cellule viventi. Con lo sfruttamento degli effetti, come la pressione di radiazione (come in pinzetta ottica 1), o flusso di fotoni ad alta energia (come nel laser dissettore 2), questa tecnologia è stata estesa a nano-manipolazione. Il sistema di imaging ottico fornisce un controllo preciso di visualizzare e manipolare gli obiettivi sub cellulari 3. Allo stesso tempo, grazie alla calibrazione accurata della potenza del laser consegnato, strumenti ottici realizzano sia la manipolazione del campione morbido o invasivi con riproducibilità senza precedenti. Diversi laboratori integrati, nello stesso setup sperimentale, pinzette ottiche e laser dissettore per ablazione organelli 4, a fondere 5 celle diverse, o per stimolare le cellule dai guidato otticamente carichi 6,7. Mentre pinzette ottiche, dopo la calibrazione della rigidezza ottica, consentonoil controllo della forza applicata alla cella su scala piconewton, sistemi dissezione laser può modulare manipolazione ottica, che varia da membrana foto-porazione all&#39;ablazione di singoli organelli o dissezione di strutture sub-cellulari. Tuttavia, calibratura dissezione laser si basa sulla valutazione qualitativa dell&#39;entità di manipolazione ottica rispetto alla energia fornita al campione, principalmente sulla base di analisi di immagini che illustra i cambiamenti morfologici dovuti al campione 8. Nel metodo presentato, dimostriamo come eseguire la misurazione spettroscopia di forza durante la dissezione laser assonale di un neurone sviluppo, quantificare, su scala piconewton, la forza prodotta da un equilibrio alterato nella struttura citoscheletro di un compartimento subcellulare 9. Neuroni coltivati ​​aderiscono al substrato, e polarizzano durante lo sviluppo. La fase di polarizzazione si verifica durante i primi cinque giorni in vitro. Alla seconda fase di polarizzazione, una delle estrusorizione neuriti diventa più lungo, e sarà differenziarsi per diventare l&#39;assone 10. Allungamento assonale in risposta alla forza di traino presso il cono di crescita è già stato modellato dal modello di Dennerl 11. Recentemente, questo modello è stato esteso da 12 a includere il ruolo di neuriti adesione ai substrati della matrice extracellulare. Questo modello biofisico, proposto dopo 13 osservazioni sperimentali, ha mostrato che tirando forze sul cono di crescita, si propaga lungo i neuriti, sono modulati da adesioni focali al substrato. Allo stesso modo, lesione assonale produce un rilascio locale di tensione propagare verso il corpo cellulare. Pertanto, abbiamo proposto che la misura tale tensione rilasciato in una posizione lungo l&#39;assone tra la lesione e la soma cellulare offre la possibilità di valutare l&#39;esito di smorzamento di adesioni focali inalterati. Calibriamo l&#39;energia necessaria fotone-flusso del laser dissettore per controllare l&#39;entità del damag assonale inflittoe, da completo transection a lesione parziale. Dopo la calibrazione, si è ripetuta lesione parziale ai assoni di diversi neuroni differenzianti e sviluppato il protocollo di quantificare il rilascio della tensione, e così ottenuto un parametro quantitativo per stimare l&#39;adesione del assone al substrato 14. Nel presente lavoro, si descrive in dettaglio il protocollo sviluppato, che rappresenta una precisa procedura sperimentale per valutare e confrontare con sensibilità piconewton assonale l&#39;adesione al substrato in diverse condizioni sperimentali come trattamento chimico 14, o diversi tipi di supporto di coltura cellulare.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymer microspheres, &Oslash; 4 &mu;m, COOH coated</td>
			<td>Bangs laboratories</td>
			<td>PC05N/6700</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PolyLink Protein Coupling Kit</td>
			<td>Polyscience</td>
			<td>19539</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IR laser</td>
			<td>IPG Laser GmbH</td>
			<td>YLM-5-SC-LP</td>
			<td>ytterbium continuous wave (CW) fiber laser operating at 1064 nm, with linear polarization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatial light modulator</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>LCOS-SLM 10468-07</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue-tweezers software</td>
			<td>Optics group, University of Glasgow</td>
			<td>Free downloadable software</td>
			<td><a href="http://www.physics.gla.ac.uk/Optics/projects/tweezers/slmcontrol/" target="_blank">http://www.physics.gla.ac.uk/Optics/projects/tweezers/slmcontrol/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td>Free downloadable software</td>
			<td><a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/ </a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QPD</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>S5980 with C5460SPL 6041 board</td>
			<td>Four quadrant photo-diode to measure x, y trapped probe displacement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD</td>
			<td>Teem Photonics</td>
			<td>PDA100A-EC</td>
			<td>Photodiode to measure z trapped probe displacement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nano-Pulse UV laser</td>
			<td>AA-optoelctronics</td>
			<td>PNV-001525-040</td>
			<td>Pulsed UVA laser, pulse length 400 ps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acoustic Optic Modulator</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>MQ110-A3-UV, 355 nm fused silica</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright microscope</td>
			<td>Andor</td>
			<td>BX51</td>
			<td>Equipped with a 60X, 0.9 NA, water dipping objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>V887ECSUVB EMCCD</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peltier device</td>
			<td>Physic Instruments</td>
			<td>QE1 resistive heating with TC-344B dual channel heater controller</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope stage: micro+piezo stage</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>Three linear stages M-126.CG1 carrying a separate 3-axis piezoelectric nano-positioning stage P-733.3DD</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Daq</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>NI PCI-6229</td>
			<td>Acquiring the x, y, z position of the trapped probe, and sending feedback loop signals to microscope stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linux Real Time Application Interface (RTAI) machine</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Real time feedback loop system, to control stage position, developed on a dedicated PC desktop</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of tension release during laser induced axon lesion to evaluate axonal adhesion to the substrate at piconewton and millisecond resolution

La formazione di connessioni funzionali in una rete neuronale sviluppo è influenzato da stimoli estrinseci. La crescita dei neuriti dei neuroni in via di sviluppo è oggetto di segnali chimici e meccanici, ed i meccanismi con cui percepisce e risponde a segnali meccanici sono poco conosciuti. Chiarire il ruolo di forze nella maturazione delle cellule consentirà la progettazione di scaffold che può promuovere l&#39;adesione cellulare e citoscheletro accoppiamento al substrato, e quindi migliorare la capacità di diversi tipi neuronali di rigenerarsi dopo una lesione. Qui, descriviamo un metodo per applicare misure di spettroscopia di forza simultanee durante laser della lesione cellulare indotta. Misuriamo il rilascio della tensione nel assone parzialmente lesionata dal simultaneo monitoraggio interferometrico di una sonda otticamente intrappolati aderito alla membrana dell&#39;assone. Il nostro protocollo sperimentale rileva il rilascio della tensione con la sensibilità piconewton, e la dinamica del rilascio della tensione arisoluzione temporale millisecondo. Pertanto, offre un metodo ad alta risoluzione per studiare come l&#39;accoppiamento meccanico tra cellule e substrati può essere modulata mediante trattamento farmacologico e / o da distinti proprietà meccaniche del substrato.

La cella genera forze di trazione sul substrato dai suoi adesioni focali. Forza generata da elementi del citoscheletro sono in equilibrio con la forza di contrasto del substrato cultura. Dopo laser indotta lesione del neurite, alcuni cavi citoscheletro Tensed sono interrotti e la loro tensione equilibrata viene rilasciato perché la forza opposta del substrato adesione è eliminato. La tensione rilasciata è parzialmente distribuita sulle adesioni focali inalterati, e il tallone attaccato alla membrana cellulare, tenuto...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Tension Release During Laser Induced Axon Lesion to Evaluate Axonal Adhesion to the Substrate at Piconewton and Millisecond Resolution at JoVE.

Measurement of Tension Release During Laser Induced Axon Lesion to Evaluate Axonal Adhesion to the Substrate at Piconewton and Millisecond Resolution

Abbiamo misurato il rilascio della tensione in un assone, parzialmente lesionati con un dissettore laser per la misurazione simultanea della spettroscopia di forza eseguita su una sonda otticamente intrappolati aderito alla membrana dell&#39;assone. Il protocollo sperimentale sviluppato valuta l&#39;assone adesione al substrato cultura.

Misura della tensione di uscita durante Laser Induced Axon Lesione di valutare Adesione assonale al substrato a piconewton e Millisecond Risoluzione

The formation of functional connections in a developing neuronal network is influenced by extrinsic cues. The neurite growth of developing neurons is ...

measurement-tension-release-during-laser-induced-axon-lesion-to

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.2K Views.  National Research Council of Italy. Abbiamo misurato il rilascio della tensione in un assone, parzialmente lesionati con un dissettore laser per la misurazione simultanea della spettroscopia di forza eseguita su una sonda otticamente intrappolati aderito alla membrana dell'assone. Il protocollo sperimentale sviluppato valuta l'assone adesione al substrato cultura.

Video: Measurement of Tension Release During Laser Induced Axon Lesion to Evaluate Axonal Adhesion to the Substrate at Piconewton and Millisecond Resolution

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

Progettazione di un bioreattore per la pressione ciclica Ex Vivo Studio delle valvole cardiache aortica

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Ricerca

Bioingegneria

Constructing a Low-budget Laser Axotomy System to Study Axon Regeneration in C. elegans

Laser axotomy followed by time-lapse microscopy is a sensitive assay for axon regeneration phenotypes in C. elegans1. The main difficulty of this assay is the perceived cost ($25-100K) and technical expertise required for implementing a laser ablation system2,3. However, solid-state pulse lasers of modest costs (&lt;$10K) can provide robust performance for laser ablation in transparent preparations where target axons are "close" to the tissue surface. Construction and alignment of a system can be accomplished in a day. The optical path provided by light from the focused condenser to the ablation laser provides a convenient alignment guide. An intermediate module with all optics removed can be dedicated to the ablation laser and assures that no optical elements need be moved during a laser ablation session. A dichroic in the intermediate module allows simultaneous imaging and laser ablation. Centering the laser beam to the outgoing beam from the focused microscope condenser lens guides the initial alignment of the system. A variety of lenses are used to condition and expand the laser beam to fill the back aperture of the chosen objective lens. Final alignment and testing is performed with a front surface mirrored glass slide target. Laser power is adjusted to give a minimum size ablation spot (&lt;1um). The ablation spot is centered with fine adjustments of the last kinematically mounted mirror to cross hairs fixed in the imaging window. Laser power for axotomy will be approximately 10X higher than needed for the minimum ablation spot on the target slide (this may vary with the target you use). Worms can be immobilized for laser axotomy and time-lapse imaging by mounting on agarose pads (or in microfluidic chambers4). Agarose pads are easily made with 10% agarose in balanced saline melted in a microwave. A drop of molten agarose is placed on a glass slide and flattened with another glass slide into a pad approximately 200 um thick (a single layer of time tape on adjacent slides is used as a spacer). A "Sharpie" cap is used to cut out a uniformed diameter circular pad of 13mm. Anesthetic (1ul Muscimol 20mM) and Microspheres (Chris Fang-Yen personal communication) (1ul 2.65% Polystyrene 0.1 um in water) are added to the center of the pad followed by 3-5 worms oriented so they are lying on their left sides. A glass coverslip is applied and then Vaseline is used to seal the coverslip and prevent evaporation of the sample.

Constructing a Low-budget Laser Axotomy System to Study Axon Regeneration in C. elegans

Laser axotomy followed by time-lapse imaging is a sensitive way to assay the effects of mutations in C. elegans on axon regeneration. A high quality, but inexpensive, laser ablation system can be easily added to most microscopes. Time lapse imaging over 15 hours requires careful immobilization of the worm.

Costruzione di un laser a basso costo del sistema assotomia per studiare la rigenerazione assonale nel C. elegans</em

Laser axotomy followed by time-lapse microscopy is a sensitive assay for axon regeneration phenotypes in C. elegans1.  The main difficulty of this assay ...

Micropipette Aspiration of Substrate-attached Cells to Estimate Cell Stiffness

Growing number of studies show that biomechanical properties of individual cells play major roles in multiple cellular functions, including cell proliferation, differentiation, migration and cell-cell interactions. The two key parameters of cellular biomechanics are cellular deformability or stiffness and the ability of the cells to contract and generate force. Here we describe a quick and simple method to estimate cell stiffness by measuring the degree of membrane deformation in response to negative pressure applied by a glass micropipette to the cell surface, a technique that is called Micropipette Aspiration or Microaspiration.
Microaspiration is performed by pulling a glass capillary to create a micropipette with a very small tip (2-50 &mu;m diameter depending on the size of a cell or a tissue sample), which is then connected to a pneumatic pressure transducer and brought to a close vicinity of a cell under a microscope. When the tip of the pipette touches a cell, a step of negative pressure is applied to the pipette by the pneumatic pressure transducer generating well-defined pressure on the cell membrane. In response to pressure, the membrane is aspirated into the pipette and progressive membrane deformation or "membrane projection" into the pipette is measured as a function of time. The basic principle of this experimental approach is that the degree of membrane deformation in response to a defined mechanical force is a function of membrane stiffness. The stiffer the membrane is, the slower the rate of membrane deformation and the shorter the steady-state aspiration length.The technique can be performed on isolated cells, both in suspension and substrate-attached, large organelles, and liposomes.
Analysis is performed by comparing maximal membrane deformations achieved under a given pressure for different cell populations or experimental conditions. A "stiffness coefficient" is estimated by plotting the aspirated length of membrane deformation as a function of the applied pressure. Furthermore, the data can be further analyzed to estimate the Young's modulus of the cells (E), the most common parameter to characterize stiffness of materials. It is important to note that plasma membranes of eukaryotic cells can be viewed as a bi-component system where membrane lipid bilayer is underlied by the sub-membrane cytoskeleton and that it is the cytoskeleton that constitutes the mechanical scaffold of the membrane and dominates the deformability of the cellular envelope. This approach, therefore, allows probing the biomechanical properties of the sub-membrane cytoskeleton.

Here we describe a quick and simple method to measure cell stiffness. The general principle of this approach is to measure membrane deformation in response to well-defined negative pressure applied through a micropipette to the cell surface. This method provides a powerful tool to study biomechanical properties of substrate-attached cells.

Aspirazione Micropipetta di celle substrato-attached per Stima rigidità cellulare

Growing number of studies show that biomechanical properties of individual cells play major roles in multiple cellular functions, including cell ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and other matrix-modifying oxidants/enzymes released during inflammation) are implicated in triggering pathological changes in cellular function, phenotype and viability in a number of diseases. Here, we describe how cell-substrate impedance and live cell imaging approaches can be readily employed to accurately quantify real-time changes in cell adhesion and de-adhesion induced by matrix modification (using endothelial cells and myeloperoxidase as a pathophysiological matrix-modifying stimulus) with high temporal resolution and in a non-invasive manner. The xCELLigence cell-substrate impedance system continuously quantifies the area of cell-matrix adhesion by measuring the electrical impedance at the cell-substrate interface in cells grown on gold microelectrode arrays. Image analysis of time-lapse differential interference contrast movies quantifies changes in the projected area of individual cells over time, representing changes in the area of cell-matrix contact. Both techniques accurately quantify rapid changes to cellular adhesion and de-adhesion processes. Cell-substrate impedance on microelectrode biosensor arrays provides a platform for robust, high-throughput measurements. Live cell imaging analyses provide additional detail regarding the nature and dynamics of the morphological changes quantified by cell-substrate impedance measurements. These complementary approaches provide valuable new insights into how myeloperoxidase-catalyzed oxidative modification of subcellular extracellular matrix components triggers rapid changes in cell adhesion, morphology and signaling in endothelial cells. These approaches are also applicable for studying cellular adhesion dynamics in response to other matrix-modifying stimuli and in related adherent cells (e.g., epithelial cells).

Here, we present a protocol to continuously quantify cell adhesion and de-adhesion processes with high temporal resolution in a non-invasive manner by cell-substrate impedance and live cell imaging analyses. These approaches reveal the dynamics of cell adhesion/de-adhesion processes triggered by matrix modification and their temporal relationship to adhesion-dependent signaling events.

Utilizzando impedenza Cell-substrato e imaging cellulare dal vivo per misurare i cambiamenti in tempo reale in Cellular Adesione e De-adesione indotta da Matrix Modifica

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement (EFIRM)

Exosomes are microvesicular structures that play a mediating role in intercellular communication. It is of interest to study the internal cargo of exosomes to determine if they carry disease discriminatory biomarkers. For performing exosomal analysis, it is necessary to develop a method for extracting and analyzing exosomes from target biofluids without damaging the internal content.
Electric field-induced release and measurement (EFIRM) is a method for specifically extracting exosomes from biofluids, unloading their cargo, and testing their internal RNA/protein content. Using an anti-human CD63 specific antibody magnetic microparticle, exosomes are first precipitated from biofluids. Following extraction, low-voltage electric cyclic square waves (CSW) are applied to disrupt the vesicular membrane and cause cargo unloading. The content of the exosome is hybridized to DNA primers or antibodies immobilized on an electrode surface for quantification of molecular content.
The EFIRM method is advantageous for extraction of exosomes and unloading cargo for analysis without lysis buffer. This method is capable of performing specific detection of both RNA and protein biomarker targets in the exosome. EFIRM extracts exosomes specifically based on their surface markers as opposed to size-based techniques.
Transmission electron microscopy (TEM) and assay demonstrate the functionality of the method for exosome capture and analysis. The EFIRM method was applied to exosomal analysis of 9 mice injected with human lung cancer H640 cells (a cell line transfected to express the exosome marker human CD63-GFP) in order to test their exosome profile against 11 mice receiving saline controls. Elevated levels of exosomal biomarkers (reference gene GAPDH and protein surface marker human CD63-GFP) were found for the H640 injected mice in both serum and saliva samples. Furthermore, saliva and serum samples were demonstrated to have linearity (R = 0.79). These results are suggestive for the viability of salivary exosome biomarkers for detection of distal diseases.

Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement EFIRM

Exosomes are microvesicular structures found within biofluids that potentially carry important disease discriminatory biomarkers. Here, a novel method is used to specifically extract exosomes and rapidly test the exosomal cargo for both RNA/protein targets following the disruption of exosomes using non-uniform electric cyclic square waves.

Rilevazione di Exosomal Biomarker da campo elettrico indotto rilascio e di misura (Efirm)

Exosomes are microvesicular structures that play a mediating role in intercellular communication. It is of interest to study the internal cargo of ...

Intraductal Delivery to the Rabbit Mammary Gland

Localized intraductal treatments for breast cancer offer potential advantages, including efficient delivery to the tumor and reduced systemic toxicity and adverse effects1,2,3,4,5,6,7. However, several challenges remain before these treatments can be applied more widely. The development and validation of intraductal therapeutics in an appropriate animal model facilitate the development of intraductal therapeutic strategies for patients. While the mouse mammary gland has been widely used as a model system of mammary development and tumorigenesis, the anatomy is distinct from the human gland. A larger animal model, such as the rabbit, may serve as a better model for mammary gland structure and intraductal therapeutic development. In contrast to mice, in which ten ductal trees are spatially distributed along the body axis, each terminating in a separate teat, the rabbit mammary gland more closely resembles the human gland, with multiple overlapping ductal systems that exit through separate openings in one teat. Here, we present minimally invasive methods for the delivery of reagents directly into the rabbit mammary duct and for visualization of the delivery itself with high-resolution ultrasound imaging.

Here, we describe a technique for the localized delivery of reagents to the rabbit mammary gland via an intraductal injection. In addition, we describe a protocol for visualization and the confirmation of delivery by high-resolution ultrasound imaging of contrast agents.

Consegna intraduttale al Coniglio ghiandola mammaria

Localized intraductal treatments for breast cancer offer potential advantages, including efficient delivery to the tumor and reduced systemic toxicity and ...

Environmental Dynamic Mechanical Analysis to Predict the Softening Behavior of Neural Implants

When using dynamically softening substrates for neural implants, it is important to have a reliable in vitro method to characterize the softening behavior of these materials. In the past, it has not been possible to satisfactorily measure the softening of thin films under conditions mimicking body environment without substantial effort. This publication presents a new and simple method that allows dynamic mechanical analysis (DMA) of polymers in solutions, such as phosphate buffered saline (PBS), at relevant temperatures. The use of environmental DMA allows measurement of the softening effects of polymers due to plasticization in various media and temperatures, which therefore allows a prediction of the materials behavior under in vivo conditions.

To allow reliable predictions of the softening of polymeric substrates for neural implants in an in vivo environment, it is important to have a reliable in vitro method. Here, the use of dynamic mechanical analysis in phosphate buffered saline at body temperature is presented.

Analisi meccanica dinamica ambientale per predire il comportamento di rammollimento di impianti neurali

When using dynamically softening substrates for neural implants, it is important to have a reliable in vitro method to characterize the softening behavior ...

Imaging Integrin Tension and Cellular Force at Submicron Resolution with an Integrative Tension Sensor

Molecular tension transmitted by integrin-ligand bonds is the fundamental mechanical signal in the integrin pathway that plays significant roles in many cell functions and behaviors. To calibrate and image integrin tension with high force sensitivity and spatial resolution, we developed an integrative tension sensor (ITS), a DNA-based fluorescent tension sensor. The ITS is activated to fluoresce if sustaining a molecular tension, thus converting force to fluorescent signal at the molecular level. The tension threshold for ITS activation is tunable in the range of 10&#8211;60 pN that well covers the dynamic range of integrin tension in cells. On a substrate grafted with an ITS, the integrin tension of adherent cells is visualized by fluorescence and imaged at submicron resolution. The ITS is also compatible with cell structural imaging in both live cells and fixed cells. The ITS has been successfully applied to the study of platelet contraction and cell migration. This paper details the procedure for the synthesis and application of the ITS in the study of integrin-transmitted cellular force.

Integrin tension plays important roles in various cell functions. With an integrative tension sensor, integrin tension is calibrated with picoNewton (pN) sensitivity and imaged at submicron resolution.

Tensione di integrina e cellulare forza alla risoluzione di Submicron con un sensore di tensione integrativa di imaging

Molecular tension transmitted by integrin-ligand bonds is the fundamental mechanical signal in the integrin pathway that plays significant roles in many ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically carried out in low throughput. Rapid and ongoing expansion of induced pluripotent stem cell (iPSC) technology presents a new standard in cardiovascular research and alternate methods are now necessary to increase throughput of electrophysiological data at a single cell level. VF2.1Cl is a recently derived voltage sensitive dye which provides a rapid single channel, high magnitude response to fluctuations in membrane potential. It possesses kinetics superior to those of other existing voltage indicators and makes available functional data equivalent to that of traditional microelectrode techniques. Here, we demonstrate simplified, non-invasive action potential characterization in externally paced human iPSC derived cardiomyocytes using a modular and highly affordable photometry system.

Here we describe optical acquisition and characterization of action potentials from induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes using a high-speed modular photometry system.

Misurazione del potenziale d'azione ottico a singola cellula in cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

DNA Tension Probes to Map the Transient Piconewton Receptor Forces by Immune Cells

Mechanical forces transmitted at the junction between two neighboring cells and at the junction between cells and the extracellular matrix are critical for regulating many processes ranging from development to immunology. Therefore, developing the tools to study these forces at the molecular scale is critical. Our group developed a suite of molecular tension sensors to quantify and visualize the forces generated by cells and transmitted to specific ligands. The most sensitive class of molecular tension sensors are comprised of nucleic acid stem-loop hairpins. These sensors use fluorophore-quencher pairs to report on the mechanical extension and unfolding of DNA hairpins under force. One challenge with DNA hairpin tension sensors is that they are reversible with rapid hairpin refolding upon termination of the tension and thus transient forces are difficult to record. In this article, we describe the protocols for preparing DNA tension sensors that can be "locked" and prevented from refolding to enable "storing" of mechanical information. This allows for the recording of highly transient piconewton forces, which can be subsequently "erased" by the addition of complementary nucleic acids that remove the lock. This ability to toggle between real-time tension mapping and mechanical information storing reveals weak, short-lived, and less abundant forces, that are commonly employed by T cells as part of their immune functions.

This paper describes a detailed protocol for using DNA-based tension probes to image the receptor forces applied by immune cells. This approach can map receptor forces &gt;4.7pN in real-time and can integrate forces over time.

Sonde di tensione del DNA per mappare le forze transitorie del recettore di Piconewton da parte delle cellule immunitarie

Mechanical forces transmitted at the junction between two neighboring cells and at the junction between cells and the extracellular matrix are critical ...