Questo protocollo offre un metodo per mappare le forze molecolari generate dalle cellule e in particolare dalle cellule immunitarie. Il protocollo è fondamentale per i laboratori interessati a studiare la meccanotrasduzione in meccanobiologia. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è super facile e consente di utilizzare la microscopia a fluorescenza convenzionale per quantificare la trasmissione della forza nelle cellule immortalizzate e primarie.
Per iniziare, posizionare i coprivetrini da 25 millimetri su un rack di politetrafluoroetilene in un becher da 50 millilitri e sciacquare i coperchi tre volte immergendoli in acqua. Mescolare volumi uguali di etanolo e acqua e aggiungere 40 millilitri di questa soluzione al becher contenente il rack e i vetrini di copertura. Quindi, sigillare il becher con nastro parafilm.
Pulire i vetrini di copertura sonicando il becher per 15 minuti in un pulitore ad ultrasuoni e scartare il liquido dopo la sonicazione. Quindi, sciacquare il becher contenente il rack e i coprivetrini con acqua almeno sei volte per rimuovere eventuali residui di solvente organico. Per preparare una soluzione di piranha fresca, aggiungere 30 millilitri di acido solforico in un becher da 50 millilitri e aggiungere lentamente 10 millilitri di perossido di idrogeno.
Mescolare delicatamente la soluzione di piranha usando l'estremità di una pipetta di vetro. Per avviare l'incisione, trasferire il rack contenente i vetrini di copertura nel becher contenente la soluzione di piranha e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente per pulire e idrossilare i vetrini di copertura. Quindi, trasferire il rack utilizzando pinzette in acciaio o politetrafluoroetilene in un becher pulito da 50 millilitri e risciacquare con acqua sei volte.
Per rimuovere completamente l'acqua, immergere il rack che tiene i coperchi in un becher da 50 millilitri con 40 millilitri di etanolo. Quindi, scartare l'etanolo. Quindi, immergere il rack in 40 millilitri di etanolo contenente il 3% di amminopropiltrietossisilano per un'ora a temperatura ambiente per avviare la reazione con il gruppo ossidrile sui vetrini di copertura.
Risciacquare la superficie dei coperchi sei volte immergendoli in 40 millilitri di etanolo e asciugarli in forno a 80 gradi Celsius per 20 minuti. Coprire il fondo interno della capsula di Petri con un nastro parafilm per evitare che i vetrini scivolino all'interno della capsula di Petri. Quindi posizionare i coprivetrini ricoperti di ammina con il lato da funzionalizzare con sonde di tensione del DNA rivolte verso l'alto.
Coprire i coprivetrini a 20 gradi Celsius per un uso futuro. Per modificare i gruppi amminici sui vetrini, aggiungere acido lipoico PEG NHS e mPEG NHS e incubare la capsula di Petri a temperatura ambiente per un'ora. Alla fine dell'incubazione, sciacquare la superficie tre volte con acqua.
Successivamente, aggiungere 100 microlitri di bicarbonato di sodio 0,1 molare contenente un milligrammo per millilitro di solfo-NHS-acetato a una serie di coprivetrini sandwich e incubare per 30 minuti affinché si verifichi la passivazione. Aggiungere 0,5 millilitri di nanoparticelle d'oro a ciascun coprivetrino e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, sciacquare i coperchi con acqua tre volte.
Dopo aver aggiunto il filamento Black Hole Quencher 2 alla sonda di tensione del DNA ricotto con un rapporto di dieci a uno, aggiungere 100 microlitri della miscela per due vetrini per fare il sandwich. Posizionare con cautela una sfera di tessuto da laboratorio bagnata nella capsula di Petri lontano dai vetrini di copertura e sigillare la capsula con nastro parafilm per evitare che la soluzione si asciughi. Dopo di ciò, coprire il piatto con un foglio e incubarlo a quattro gradi Celsius durante la notte.
Il giorno successivo, assemblare la camera di imaging, avendo cura di evitare fessurazioni superficiali mentre si stringe la camera. Quindi, aggiungere da 0,5 a un millilitro di soluzione salina bilanciata di Hank alla camera di imaging. Utilizzare il canale Cy3B con un obiettivo 100X per catturare i segnali fluorescenti delle cellule placcate sulle sonde di tensione della forcina del DNA quando iniziano a diffondersi.
Dopo aver preparato il filamento di bloccaggio non fluorescente da 100 microMolar, al punto temporale desiderato, aggiungerlo alle celle ad una concentrazione finale di un microMolar nella camera di imaging per memorizzare il segnale di tensione e mescolarlo con le cellule mediante pipettaggio. Dopo circa 10 minuti di blocco, acquisire filmati time-lapse o immagini endpoint in epifluorescenza sia per la mappatura qualitativa della tensione che per l'analisi quantitativa. Una superficie di successo aveva un colore rosa pallido.
L'alta qualità della superficie è stata dimostrata con uno sfondo pulito e la microscopia a contrasto di interferenza di riflessione o canale RICM e intensità di fluorescenza uniforme nel canale Cy3B. Le immagini time-lapse del blocco della tensione hanno indicato che entrambi i segnali di tensione TCR anti-CD3 epsilon e TCR-peptide-MHC sono stati amplificati a causa del blocco della forcina e dell'accumulo del segnale. Il filamento di bloccaggio ha registrato eventi di trazione meccanica di breve durata del peptide TCR MHCN4 a partire da zero minuti, che hanno facilitato l'analisi quantitativa e rivelato il modello distinto della forza MHC del peptide TCR che assomigliava al modello bullseye delle sinapsi immunitarie.
Ogni passaggio, la preparazione del substrato della sonda intenzionale richiede attenzione ai dettagli e un'attenta gestione dei materiali. Questa tecnologia consente la visualizzazione delle forze molecolari transitorie che si verificano sulla superficie cellulare quando interagisce con l'ambiente, specialmente nelle cellule immunitarie alla ricerca di antigeni.
